يتمحور بحثنا حول أكمام التمدد المعوي وأكمام التمدد المهبلي ، وكلاهما يوفر قوة مشتتة أثبتت أنها تطيل القنوات المعوية والمهبلية بشكل كبير. نأمل في تحسين أجهزتنا بإضافة العلاجات القائمة على البروتين للمساعدة في تقليل الالتهاب الموضعي والتليف بعد نشر هذه الأجهزة. من خلال ربط هذه العوامل العلاجية مباشرة بأجهزتنا ، يمكننا تجاوز الحاجة إلى الإدارة الجهازية التي تستهدف بشكل مباشر مجالات اهتمامنا بجرعة موضعية.
سيسمح هذا التوطين بخفض جرعات الدواء ، وتقليل مخاطر الآثار الجانبية الجهازية ، وكذلك خفض تكلفة العلاجات. في المستقبل ، نريد تحديد معدل إطلاق هذه العلاجات القائمة على البروتين المرتبطة بأجهزتنا المطلية ب PVA ، والتي ستكون ضرورية لتحديد جرعات الدواء لأنواع مختلفة من العلاجات. للبدء ، قم بإعداد محلول 5٪ من كحول البولي فينيل أو PVA عن طريق إضافة خمسة جرامات من PVA إلى 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
قلب الخليط على طبق ساخن للمساعدة في الذوبان. بعد ذلك ، قم بإعداد مليغرام واحد لكل مليلتر من محلول الببتيد 2 أو GLP-2 الشبيه بالجلوكاجون عن طريق إضافة ملليغرام واحد من GLP-2 في مليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات. قم بتقليص أكمام التمدد المعوي وأكمام التمدد المهبلي مسبقا فوق ماصة زجاجية، وتثبيت الأطراف بماصات بلاستيكية مقطوعة مثبتة بإحكام حول الماصة الزجاجية والأكمام.
قم بطلاء الأكمام المتعاقد عليها مسبقا بمحلول PVA بنسبة 5٪ باستخدام فرشاة رسم صغيرة. اترك الأكمام تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بين كل طبقة. بمجرد أن تجف الطبقة الخامسة ، ضع الأكمام المتعاقد عليها مسبقا في مجفف تحت غطاء أمان كيميائي.
أضف ثلاثة ملليلتر من 25٪ جلوتارالديهايد وثلاثة ملليلتر من 94 إلى 98٪ من حمض الكبريتيك في أكواب مفتوحة منفصلة في المجفف للسماح بتفاعل البخار وربط أغشية PVA بالأكمام. بعد الربط المتبادل لمدة 48 ساعة ، قم بإزالة الأكمام من الغرفة واترك الجلوتارالديهايد يتبخر لمدة 15 دقيقة. ماصة 50 ميكرولتر من محلول GLP-2 على كل غلاف متقاطع لاستخدامه لاحقا.
لجعل المنحنى القياسي ل GLP-2 مرتبطا ب PVA، ضع الماصة 50 ميكرولترا من 5٪ PVA في قاع 18 بئرا من لوحة 24 بئرا. اترك ستة آبار فارغة لتثبيت أكمام التمدد المعوي وأكمام التمدد المهبلي مع ثلاثة آبار لكل نوع من الأجهزة. اترك طبقة PVA تجف طوال الليل في فرن على حرارة 120 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، ضع صفيحة 24 بئر في مجفف تحت غطاء أمان كيميائي. أضف ثلاثة ملليلتر من 25٪ جلوتارالديهايد وثلاثة ملليلتر من 94 إلى 98٪ من حمض الكبريتيك في أكواب مفتوحة منفصلة داخل المجفف للسماح بتفاعل البخار وربط أغشية PVA بلوحة 24 بئر. بعد 48 ساعة من الربط المتقاطع ، قم بإزالة لوح 24 جيدا من المجفف واترك الجلوتارالديهايد يتبخر لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بإنشاء تدرج تركيز عن طريق إضافة 250 و 150 و 25 وصفر ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر محلول GLP-2 إلى الآبار المسماة الخاصة بها. بعد ذلك ، ضعي أكمام التمدد المعوية والمهبلية المغلفة بالدواء في الآبار الخاصة بها. بعد إضافة تركيز GLP-2 وأكمام التمدد المعوي المطلية بالدواء وأكمام التمدد المهبلي إلى الآبار ، قم بتبريد صفيحة 24 جيدا طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح بربط الدواء.
في اليوم التالي ، أضف ملليلترين من ملليغرام واحد لكل مليلتر من مسحوق الحليب في محلول مانع الماء منزوع الأيونات لكل بئر لمدة ساعة واحدة. بعد الحظر ، اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة للأرانب المضادة GLP-2 عن طريق إضافة 40 ميكرولترا من الجسم المضاد للأرانب المضاد GLP-2 إلى 50 مل من الماء منزوع الأيونات.
ثم أضف ملليلترين من محلول الجسم المضاد إلى كل بئر من اللوحة. ضعي الطبق في الثلاجة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.
قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوية للفوسفاتيز القلوي IgG المضاد للأرانب عن طريق إضافة 20 مل من الجسم المضاد إلى 40 مل من الماء منزوع الأيونات. أضف ملليلترين من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد غسل الآبار باستخدام PBS ، أضف ملليلترين من ركيزة البئر الصغيرة الزرقاء الفوسفاتيز القلوية إلى كل بئر واحتضانها لمدة 20 دقيقة.
أثناء الحضانة ، راقب التفاعل حيث يتغير لون المحلول من الأصفر إلى الأزرق. أوقف التفاعل عن طريق سحب 200 ميكرولتر من المحلول من كل بئر في صفيحة 96 بئر مكتوبة بعلامة 96. اقرأ لوحة 96 جيدا باستخدام قارئ صفيحة دقيقة امتصاص بطول موجي 620 نانومتر.
قم بإنشاء المنحنى القياسي وحساب تركيز GLP-2 على الأكمام المطلية ب PVA. يبلغ متوسط تركيز GLP-2 لأكمام التمدد المعوي وأجهزة أكمام التمدد المهبلي 22.69 ميكروغراما لكل سنتيمتر مربع ، على غرار التركيز في آبار 50 ميكروغراما على صفيحة 24 بئرا مع 23.7 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع.
