Nuestra investigación se centra en nuestras mangas de expansión intestinal y vaginal, que proporcionan una fuerza de distracción que se ha demostrado que alarga significativamente los canales intestinales y vaginales. Esperamos optimizar nuestros dispositivos con la adición de terapias basadas en proteínas para ayudar a minimizar la inflamación local y la fibrosis después del despliegue de estos dispositivos. Al unir estos agentes terapéuticos directamente a nuestros dispositivos, podemos evitar la necesidad de una administración sistémica dirigida directamente a nuestras áreas de interés con una dosis localizada.
Esta localización permitirá una menor dosificación del fármaco, disminuyendo el riesgo de efectos secundarios sistémicos y también reduciendo el coste de los tratamientos. En el futuro, queremos determinar la tasa de liberación de estas terapias basadas en proteínas que se unen a nuestros dispositivos recubiertos de PVA, lo que será necesario para determinar las dosis de medicamentos para diferentes tipos de tratamientos. Para comenzar, prepare la solución de alcohol polivinílico al 5% o PVA agregando cinco gramos de PVA en 100 mililitros de agua desionizada.
Revuelva la mezcla en una placa caliente para ayudar en la disolución. A continuación, prepare el miligramo por mililitro de la solución de péptido similar al glucagón 2 o GLP-2 agregando un miligramo de GLP-2 en un mililitro de agua desionizada. Contrae previamente los manguitos de expansión intestinal y vaginal sobre una pipeta de vidrio, estabilizando los extremos con pipetas de plástico cortadas ajustadas firmemente alrededor de la pipeta de vidrio y los manguitos.
Pintar las mangas precontratadas con la solución de PVA al 5% con un pincel pequeño. Deje que las mangas se sequen a temperatura ambiente durante 10 minutos entre cada capa. Una vez que la quinta capa esté seca, coloque las mangas precontratadas en un desecado debajo de una cubierta de seguridad química.
Agregue tres mililitros de glutaraldehído al 25% y tres mililitros de ácido sulfúrico al 94 al 98% en vasos de precipitados abiertos separados en el desecador para permitir la reacción de vapor y reticular las membranas de PVA en los manguitos. Después de la reticulación durante 48 horas, retire los manguitos de la cámara y deje que el glutaraldehído se evapore durante 15 minutos. Pipetear 50 microlitros de solución de GLP-2 en cada manguito reticulado para su uso posterior.
Para hacer la curva estándar de GLP-2 unida al PVA, pipetee 50 microlitros de PVA al 5% en el fondo de 18 pocillos de una placa de 24 pocillos. Deje seis pocillos en blanco para sujetar las mangas de expansión intestinal y las mangas de expansión vaginal con tres pocillos para cada tipo de dispositivo. Deje que la capa de PVA se seque durante la noche en un horno a 120 grados centígrados.
Al día siguiente, coloque la placa de 24 pocillos en un desecado debajo de una tapa de seguridad química. Agregue tres mililitros de 25% de glutaraldehído y tres mililitros de 94 a 98% de ácido sulfúrico en vasos de precipitados abiertos separados dentro del desecador para permitir la reacción de vapor y reticular las membranas de PVA en la placa de 24 pocillos. Después de 48 horas de reticulación, retire la placa de 24 pocillos del desecador y deje que el glutaraldehído se evapore durante 15 minutos.
A continuación, cree un gradiente de concentración agregando 250, 150, 25 y cero microlitros de un miligramo por mililitro de solución de GLP-2 en sus respectivos pocillos etiquetados. A continuación, coloque las mangas de expansión intestinal y vaginal recubiertas de fármaco en sus respectivos pocillos. Después de agregar la concentración respectiva de GLP-2 y las mangas de expansión intestinal y vaginal recubiertas de fármaco a los pocillos, refrigere la placa de 24 pocillos durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir la unión del fármaco.
Al día siguiente, agregue dos mililitros de un miligramo por mililitro de leche en polvo en una solución bloqueadora de agua desionizada a cada pozo durante una hora. Después de bloquear, lave cada pocillo tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Prepare la solución de anticuerpos anti GLP-2 de conejo agregando 40 microlitros de anticuerpo anti GLP-2 de conejo en 50 mililitros de agua desionizada.
Luego, agregue dos mililitros de la solución de anticuerpos a cada pocillo de la placa. Refrigere el plato durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave cada pocillo tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado.
Prepare la solución de anticuerpos secundarios de fosfatasa alcalina IgG anti conejo agregando 20 mililitros de anticuerpo en 40 mililitros de agua desionizada. Agregue dos mililitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar los pocillos con PBS, agregue dos mililitros del sustrato de micropocillo azul de fosfatasa alcalina a cada pocillo e incube durante 20 minutos.
Durante la incubación, controle la reacción a medida que la solución cambia de color de amarillo a azul. Detenga la reacción pipeteando 200 microlitros de la solución de cada pocillo en una placa de 96 pocillos etiquetada. Lea la placa de 96 pocillos utilizando un lector de microplacas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nanómetros.
Genere la curva estándar y calcule la concentración de GLP-2 en los manguitos recubiertos de PVA. La concentración de GLP-2 de los manguitos de expansión intestinal y los dispositivos de manguitos de expansión vaginal tiene un promedio de 22,69 microgramos por centímetro cuadrado, similar a la concentración en los pocillos de 50 microgramos en la placa de 24 pocillos con 23,7 microgramos por centímetro cuadrado.
