Наш протокол предоставляет альтернативные методы идентификации и характеристики вирусных, нуклеолярных и неклеолярных факторов, хозяйерных, которые поддерживают инфекционный цикл ВИЧ-1. Концепции, используемые в этом подходе, применимы к другим вирусным моделям и моделям заболеваний, требующим характеристики недостаточно изученных путей. Методы устранения неполадок описаны для модификации других белковых моделей.
Демонстрация процедуры будет Haitang Ли и Прицана Chomchan, ученые в молекулярной и клеточной биологии Департамента Бекман научно-исследовательский институт в городе Надежда, и Роджер Мур, члены города надежда Proteomics Core и кафедры молекулярной иммунологии. Начните с выращивания HLfB, стабиливно выражаюго культуру клеточной линии HeLa в трех, 100-миллиметровых культурных пластинах до плотности от двух раз до 10-шести ячеек на миллилитр. Когда клетки достигнут соответствующей концентрации, смешайте 20 микрограммов плазмиды, содержащей нуклеолярную локализацию Rev, сигнал трех-премьер-флаг мутации интереса с 1,76 миллилитров TE 79/10 в 15-миллилитровой трубки, а затем добавление 240 микролитров двухмядерного хлорида кальция, с тщательной смешивания.
Затем перенесите содержимое трубки в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров 2x HBS, а затем смешайте на вихревой машине. Через 30 минут при комнатной температуре вихрь осадков. Добавьте один миллилитр подвески dropwise к каждому из трех, 100-миллиметровых пластин культуры HLfB, осторожно закрученных среды.
После шестичасовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры замените трансфектную смесь на 10 миллилитров свежей культуры среды и верните клетки в инкубатор еще на 42 часа. Через 48 часов после трансфекции поместите каждую тарелку на гну льда в пределах биоопасного уровня двух тканей культуры капюшона. Удалите средства культуры клеток и аккуратно промойте клетки 10 миллилитров предварительно облицованного PBS, не нарушая слои клеток.
Отбросьте PBS после полоскания клеток. Затем обработать клетки одним миллилитром буфера лиза, дополненного коктейлем ингибитора протеазы, на тарелку. Наклоняя пластины, чтобы собрать клетки в бассейн, используйте сотовый скребок, чтобы вручную нарушить слои.
Используя микропиперный микропипет с 1000 микролитером, объединить лизат с каждой пластины в предварительно облицованную 15-миллилитровую трубку для 15-минутной инкубации на льду, с вихрем каждые пять минут. В конце инкубации, aliquot лизатов в три, 1,5-миллилитровый микроцентрифуг труб, и собирать лизаты центрифугации. Перенесите супернатант в новую 15-миллилитровую трубку и получите концентрацию лизата вирусного белка, как описано в рукописи.
Для coimmunoprecipitation Rev нуклеолярной локализации сигнала три-премьер флаг, промыть 25 микролитров M2 сродство гель бусы три раза с 500 микролитров свежего буфера лиза, дополненный ингибитором протеазы коктейль, за стирку. Выполните эти шаги в холодной комнате или с реагентами на льду. После последнего полоскания добавьте концентрацию вирусного белка в промытых бусинках в объеме одного миллиграмма на миллилитр буфера лиза.
Инкубировать реакцию в течение трех часов при четырех градусах по Цельсию с вращением. В конце инкубации гранулы вирусного белка лизируют-конъюгированные бусы центрифугации. Соберите супернатант для измерения концентрации белка после иммунопреципиентации.
Смотрите рукопись для инструкций по хранению образцов. Добавьте 750 микролитров буфера лиза в вирусный белок лизатейно-конъюгированных гранул шарика, перенесите шарики в 1,5-миллилитровую микроцентрифуговую трубку и помойте бисер на ротаторе в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Соберите бисер центрифугой для еще двух моет на ротаторе, как только что продемонстрировано.
После последней стирки используйте ущипнутый, длинный, гелепогрузочный наконечник, чтобы удалить любые следы буфера лиза из бисероплетения. Повторное посасыть бисер в 55 микролитров 2x буфер загрузки. Затем варить образец при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Загрузите 25 микролитров элуата на один западный гель для помарки и один гель Coomassie, окрашивающий SDS-PAGE. После завершения SDS-PAGE гель электрофорез, промыть гель три раза в 25 миллилитров ультрапурной воды в течение 15 минут. После последней стирки, добавить 100 миллилитров coomassie пятно реагент на гель.
Смотрите рукопись для полного протокола окрашивания. Для переваривания гелеобразующих полос сначала используйте чистое лезвие бритвы, чтобы вырезать гелеобразные полосы со всей полосы геля, представляющие каждую мутацию, примерно на пятимиллиметровые кубики. Поместите каждую полосу в чистую, 0,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Обложка полосы два раза с 100-миллимолярного бикарбоната аммония в один-к-одному ацетонитрил к воде раствор при комнатной температуре в течение 15 минут за стирку. Затем высушите кусочки геля в течение пяти минут в вакуумной центрифуге. Чтобы уменьшить количество белков, накройте высушенные кусочки геля 10-миллимолярной дитиотрейтолом в 100-миллимоляном бикарбонате аммония в течение часа инкубации при температуре 56 градусов по Цельсию, а затем алкилированием в 100-миллимолярной идоацетамиде в воде в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
Затем, уменьшить и reswell кусочки геля два раза с ацетонитрилом, а затем 100-миллимолярной бикарбоната аммония, как с нежной тряски при комнатной температуре в течение 15 минут. После второго замысывания высушите кусочки геля в течение пяти минут в вакуумной центрифуге. Набухают кусочки геля с 50 нанограмм на микролитр секвенирования класса модифицированного трипсина в 100-миллимолярный бикарбонат аммония.
Через пять минут, накройте кусочки геля 100-миллимолярным бикарбонатом аммония, и дайте им reswell полностью, добавив дополнительные 100-миллимолярный бикарбонат аммония, чтобы опухшие кусочки геля полностью покрыты. Затем инкубировать кусочки геля на ночь при 37 градусах по Цельсию, останавливая реакцию с 1/10 объема образцов с 10% formic кислоты в воде на следующее утро, и собирать супернатант из каждой трубки. Сигнал локализации Rev nucleolar 3-премьер флаг обнаруживается в трех различных условиях буфера лиза, содержащих различные концентрации хлорида натрия.
B23 также обнаруживается в буфере лиза, содержащем более низкую концентрацию соли, едва обнаруживаемой в буфере лиза, содержащем средней концентрации соли, и необнаруживаемом в буфере лиза, содержащем высокую концентрацию соли. Обнаружение B23 является оптимальным в буфере лиза, содержащем низкую концентрацию хлорида натрия с трех-премьер-флагом дикого типа Rev и теряет сродство с сигналом локализации Rev nucleolar M1 трех-премьер-флагом. B23 сродство с диким типом Rev трех-премьер флаг также уменьшается с более высокой концентрацией соли, и PCDNA отрицательный контроль не дает неспецифического иммунодефицита после иммунопреципиентации в обоих условиях буфера лиза.
Сигнал нуклеолярной локализации Rev 3-премьер флаг наиболее обнаружить после elution через кипения в 2x буфер загрузки образца, в то время как B23 обнаруживается как в 37-и 95-градусный по Цельсию образца буфера инкубации условиях. После иммунопреципиентации и окрашивания серебра, как попродемонстрировано, сигналы нуклеолярной локализации дикого типа Rev и Rev M2, M6 и M9 обнаруживаются на 18 килодальтонах. Полосы, соответствующие белку B23, также наблюдаются на 37-килодальтоновом маркере.
Окрашивание реагентом Кумасси еще раз демонстрирует обнаруживаемость сигнала нуклеолярной локализации Rev трех-премьер-флага при наличии и отсутствии мутаций на 18 килодальтонах. Используйте как можно больше элементов управления, как положительных, так и отрицательных, по мере необходимости для ссылок, относящихся к вашей модели заболевания в процессе устранения неполадок и скрининга, для потенциальных связывающих факторов. Все удаления и однотомные мутации могут быть изучены на доминантно-отрицательную активность путем мультимеризации с диким типом Rev и использованы при аресте репликации ВИЧ-1.
