Unser Protokoll bietet alternative Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von viralen, nukleolaren und nicht-nukleolaren Wirtsfaktoren, die den HIV-1-Infektionszyklus aufrechterhalten. Die in diesem Ansatz verwendeten Konzepte gelten für andere Virus- und Krankheitsmodelle, die die Charakterisierung unterstudierter Pfade erfordern. Fehlerbehebungstechniken werden für die Modifikation an anderen Proteinmodellen beschrieben.
Demonstriert werden Haitang Li und Pritsana Chomchan, Wissenschaftler der Abteilung für Molekulare und Zelluläre Biologie am Beckman Research Institute der Stadt der Hoffnung, und Roger Moore, Mitglieder der City of Hope Proteomics Core und des Department of Molecular Immunology. Beginnen Sie mit dem Wachstum einer HLfB, die die HeLa-Zelllinienkultur in drei 100-Millimeter-Kulturplatten stabil ausdrückt, zu einer zweifach-10-zu-den-sechs-Zellen-pro-Milliliter-Dichte. Wenn die Zellen die entsprechende Konzentration erreichen, mischen Sie 20 Mikrogramm Plasmid, das die Rev nukleolar Lokalisation enthält, eine Drei-Prime-Flag-Mutation von Interesse mit 1,76 Millilitern TE 79/10 in einer 15-Milliliter-Röhre, gefolgt von der Zugabe von 240 Mikrolitern zwei-molaren Calciumchlorid, mit gründlicher Durchmischung.
Als nächstes übertragen Sie den Inhalt des Rohres tropfenweise in ein neues 15-Milliliter-Rohr mit zwei Millilitern 2x HBS, gefolgt von dem Mischen auf einer Wirbelmaschine. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur, Wirbel den Niederschlag. Fügen Sie jedem der drei 100-Millimeter-HLfB-Kulturplatten einen Milliliter der Federung tropfenweise hinzu, während Sie das Medium sanft wirbeln.
Ersetzen Sie nach einer sechsstündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator die Transfektionsmischung durch 10 Milliliter frisches Kulturmedium und geben Sie die Zellen für weitere 42 Stunden in den Inkubator zurück. 48 Stunden nach der Transfektion, legen Sie jede Platte auf ein Bett aus Eis innerhalb einer Biohazard Ebene zwei Gewebekultur Haube. Entfernen Sie die Zellkulturmedien, und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 Millilitern vorgebürsteter PBS, ohne die Zellschichten zu stören.
Entsorgen Sie die PBS nach dem Spülen der Zellen. Als nächstes behandeln Sie die Zellen mit einem Milliliter Lysepuffer, ergänzt durch Proteasehemmer-Cocktail, pro Platte. Kippen Sie die Platten, um die Zellen in einen Pool zu sammeln, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Schichten manuell zu unterbrechen.
Mit einer 1.000-Mikroliter-Mikropipette das Lysat von jeder Platte in ein vorgechilltes 15-Milliliter-Rohr für eine 15-minütige Inkubation auf Eis, mit Wirbeln alle fünf Minuten. Am Ende der Inkubation werden die Lysate in drei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren einfließen und die Lysate durch Zentrifugation gesammelt. Übertragen Sie den Überstand in eine neue 15-Milliliter-Röhre und erhalten Sie die virale Proteinlysatkonzentration, wie im Manuskript beschrieben.
Zur Koimmunozipitierung des Rev nukleolaren Lokalisationssignals Drei-Prime-Flagge, spülen Sie 25 Mikroliter M2-Affinitätgelperlen dreimal mit 500 Mikroliter frischer Lysepuffer, ergänzt mit Protease-Hemmer-Cocktail, pro Wäsche. Führen Sie diese Schritte in einem kalten Raum oder mit den Reagenzien auf Eis. Nach der letzten Spülung eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter viralem Proteinlysat in einem Endvolumen von fünf Milliliterlysepufferin in die spülten Perlen geben.
Inkubieren Sie die Reaktion für drei Stunden bei vier Grad Celsius mit Rotation. Am Ende der Inkubation pellet das virale Protein lysat-konjugierte Perlen durch Zentrifugation. Sammeln Sie den Überstand zur Messung der Nachimmunitizipationslysatproteinkonzentration.
Siehe Manuskript für Probenaufbewahrungsanweisungen. 750 Mikroliter Lysepuffer in das virale Protein Lysat-konjugierte Perlenpellet geben, die Perlen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben und die Perlen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator waschen. Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation für weitere zwei Wärungen am Rotator, wie gerade gezeigt.
Verwenden Sie nach der letzten Wäsche eine eingeklemmte, lange, Gel-Ladespitze, um Alle Spuren von Lysepuffer aus dem Perlen-Coimmununo-/Exzipitationskomplex zu entfernen. Die Perlen in 55 Mikroliter 2x Ladepuffer wieder aufhängen. Dann kochen Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten.
25 Mikroliter Eluat auf ein western blot gel und ein Coomassie-FärbungS-SDS-PAGE-Gel laden. Nach Abschluss der SDS-PAGE Gelelektrophorese das Gel dreimal in 25 Milliliter Reinstwasser für 15 Minuten abspülen. Nach der letzten Wäsche 100 Milliliter Coomassie-Fleckenreagenz auf das Gel geben.
Das vollständige Färbeprotokoll finden Sie im Manuskript. Für die Verdauung der Gelbänder verwenden Sie zunächst eine saubere Rasierklinge, um die Gelbänder aus der gesamten Spur des Gels, die jede Mutation darstellen, in etwa Fünf-Millimeter-Würfel zu schneiden. Legen Sie jedes Band in ein sauberes, 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.
Bedecken Sie die Bänder zweimal mit 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat in einer Eins-zu-eins-Acetonitril-zu-Wasser-Lösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten pro Waschgang. Anschließend die Gelstücke fünf Minuten in einer Vakuumzentrifuge trocknen. Um die Proteine zu reduzieren, bedecken Sie die getrockneten Gelstücke mit 10-Millimolar-Dithiothreitol in 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat für eine einstündige Inkubation bei 56 Grad Celsius, gefolgt von Alkylierung in 100-Millimolar-Iodoacetamid in Wasser für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Als nächstes schrumpfen und saugen Sie die Gelstücke zweimal mit Acetonitril, gefolgt von 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat, beide mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Nach dem zweiten Anschwellen die Gelstücke fünf Minuten in einer Vakuumzentrifuge trocknen. Die Gelstücke mit 50 Nanogramm pro Mikroliter modifiziertem Trypsin in 100-Millimolar-Ammoniumbicarbonat anschwellen lassen.
Nach fünf Minuten die Gelstücke mit 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat bedecken und vollständig anschwellen lassen, indem zusätzliche 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat hinzugefügt werden, so dass die geschwollenen Gelstücke vollständig abgedeckt sind. Dann inkubieren Sie die Gelstücke über Nacht bei 37 Grad Celsius, stoppen Sie die Reaktion mit 1/10 des Volumens der Proben mit 10% Ameisensäure in Wasser am nächsten Morgen, und sammeln Sie den Überstand aus jedem Rohr. Rev nukleolar Lokalisationssignal Drei-Prime-Flagge ist nachweisbar unter drei verschiedenen Lyse-Pufferbedingungen, die verschiedene Konzentrationen von Natriumchlorid.
B23 ist auch im Lysepuffer nachweisbar, der die niedrigere Salzkonzentration enthält, kaum nachweisbar im Lysepuffer, der die mittlere Salzkonzentration enthält, und nicht nachweisbar im Lysepuffer mit einer hohen Salzkonzentration. Die B23-Erkennung ist optimal im Lysepuffer, der die niedrige Natriumchloridkonzentration mit Wildtyp Rev-Drei-Prime-Flag enthält und verliert die Affinität zum Rev nukleolaren Lokalisationssignal M1-Drei-Prime-Flag. Die B23-Affinität mit der Wildtyp-Rev-Drei-Prime-Flagge nimmt ebenfalls mit einer höheren Salzkonzentration ab, und die pcDNA-Negativkontrolle liefert keine unspezifische Immundetektion nach Immunpräzipitation unter beiden Lysepufferbedingungen.
Rev nukleolar Lokalisationssignal Drei-Prime-Flag ist am meisten nachweisbar nach Elution durch Kochen in 2x Probe Ladepuffer, während B23 ist sowohl unter den 37-und 95-Grad-Grad-Celsius-Probenpuffer Inkubationsbedingungen nachweisbar. Nach Immunitizipation und Silberfärbung sind, wie gezeigt, die Wildtyp-Rev- und Rev-Nukleolar-Lokalisierungssignale M2, M6 und M9 bei 18 Kilodaltonnachweisbar. Bänder, die dem B23-Protein entsprechen, werden auch am 37-Kilodalton-Marker beobachtet.
Die Färbung mit Coomassie-Reagenz zeigt die Nachweisbarkeit von Rev nukleolaren Lokalisationssignal-Drei-Prime-Flagge in Gegenwart und Abwesenheit von Mutationen bei 18 Kilodaltonen. Verwenden Sie so viele positive und negative Steuerelemente, wie erforderlich für Referenzen, die sich auf Ihr Krankheitsmodell beziehen, während des Fehlerbehebungs- und Screening-Prozesses auf potenzielle Bindungsfaktoren. Alle Deletions- und Single-Point-Mutationen können durch Multimerisierung mit Wildtyp Rev auf dominant-negative Aktivität untersucht und bei der Festnahme der HIV-1-Replikation verwendet werden.
