Общая цель этой процедуры заключается в оценке in vitro, влияния реверсивных агентов задержки на обработку ВИЧ-мРНК. Протокол обеспечивает простой эффективный и надежный метод оценки, одновременное влияние ЛРА на транскрипцию ВИЧ и сращивание. Этот метод дал представление о способности ЛРВ вызывать реактивацию вируса и расчистку скрытого резервуара.
После культивирования клеток поместите 20 000 из них в 100 микролитров среды DMEM, дополненных 10%FBS, и без антибиотиков в колодцах 96-хорошо плоской нижней пластины в течение 24 часов. На следующий день разбавить двойной цвет репортер построить. Tat и Rev ДНК в 50 микролитров сыворотки свободной среды, и смешать осторожно.
Аккуратно смешайте липидный реагент, а затем разбавьте 0,65 микролитров его на реакцию в 50 микролитров сыворотки свободной среды. Смешайте осторожно и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Смешайте разбавленный липидный реагент с разбавленной ДНК и аккуратно перемешайте.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, обойтись 100 микролитров этого липидного реагента ДНК комплекс падение мудрым, на вершине клеток в каждой хорошо. Рок пластины мягко вперед и назад, чтобы смешать.
И инкубировать пластину во влажном инкубаторе, при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение пяти часов. После этого, transfect дополнительные скважины с 100 нанограммов CMV приводом EGFP и DsRed экспресс ДНК плазмид для компенсационных целей. Для начала разбавляют каждую задержку реверсивным агентом в соответствующее рабочее состояние со средой роста.
Используя многоканарновую головку трубы, тщательно аспирировать трансфектную среду и заменить ее 100 микролитров среды, содержащих соответствующий реверсивный агент задержки. Инкубация во влажном инкубаторе при 37%celsius с 5%carbon dioxide в течение 48 часов. Чтобы начать окрашивание клеток, используйте многоканарную головку трубы, чтобы добавить 100 микролитров PBS к каждой хорошо.
Аккуратно труба голову вверх и вниз примерно в пять раз. Хотя убедившись, чтобы избежать вспенивания, чтобы отделить клетки в средствах массовой информации. Затем перенесите клетки в колодцы 96-ну V-нижней пластины.
Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать среды и PBS, не касаясь клеток. Вымойте клетки по крайней мере один раз с 200 микролитров белка и сыворотки свободной PBS.
Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Наклоните пластину, чтобы отбросить супернатант и удалить буфер мытья, не касаясь клеток. После этого разбавить фиксированный краситель жизнеспособности в белке и сыворотке свободной PBS в соотношении от 1 до 1000, чтобы подготовить рабочий раствор.
Добавить 50 микролитров разбавленного красителя к каждой хорошо, и труба голову вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию. В то время как защищены от света с помощью фольги в течение 10 до 15 минут.
Затем мыть клетки один или два раза с 150 микролитров мыть буфера. После этого центрифугу в 500 раз больше гравитации и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, и отбросим супернатант. Чтобы исправить клетки, добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 1%формальдегида и вымойте буфер.
И инкубировать при четырех градусах по Цельсию в то время как защищены от света в течение 10 до 15 минут. После этого, мыть клетки один или два раза с 100 микролитров мыть буфера. Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 70 микролитров буфера стирки. После проверки цитометра настройки производительности и чувствительности путем запуска калибровки бисера, настроить вперед и сбоку рассеяния напряжения с неопледеленным образцом, так что основная популяция находится на экране и четко различимы. Выполните ручную или автоматическую компенсацию с помощью одного окрашенных образцов, обеспечивая минимальное перелив положительной популяции EGFP в детектор DsRed и наоборот.
Используя флуоресценцию минус один элемент управления, создайте участки и установите ворота. Далее отрегулируйте напряжение вперед и бокового рассеяния с неопляленной выборкой, так что основная популяция находится на экране и четко различима. Приобретайте и записывая не менее 10 000 жизнеспособных событий ячейки на выборку.
После этого используйте программное обеспечение для анализа цитометрий данных потока для анализа данных, изложенных в текстовом протоколе. Репрезентативные результаты экспрессии ВИЧ-1, непликированных и сращивания продуктов, после лечения ингибитором бромодомаина J-1, показывают, что как положительный, так и Tat, значительно увеличивают процент клеток, выражаюющих EGFP. Что свидетельствует о неразлиценные стенограммы.
Также наблюдается значительное увеличение доли клеток, выражаюющих DsRed. И увеличить долю сращивания продукта до тех же уровней, как Тат. Это подтверждает способность J'1 положительно включить транскрипцию ВИЧ и сращивание.
Тем не менее, лечение с помощью стереоизомера контроля J'1 отрицательный, отменяет положительное влияние J-1 на транскрипцию ВИЧ и сращивания. После освоения, этот метод может быть осуществлен с использованием наркотиков индивидуально или в комбинации. Тестирование на их способность эффективно синхронизировать.
Что приведет к снижению дозы препарата и токсичности. После каждого развития, этот метод проложил путь для тестирования эффективных комбинаций наркотиков в первичных моделях задержки в образцах ex vivo пациента.
