ويوفر البروتوكول لدينا طرقاً بديلة لتحديد وتوصيف العوامل المضيفة الفيروسية والنوية وغير النويّة التي تحافظ على الدورة المعدية لفيروس العوز المناعي البشري-1. تنطبق المفاهيم المستخدمة في هذا النهج على نماذج أخرى من الفيروسات والأمراض تتطلب توصيف المسارات غير المدروسة. يتم وصف تقنيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتعديلها على نماذج البروتين الأخرى.
وسيكون من بين البرهان على الإجراء هيتانغ لي وبريتسانا تشومشان، والعلماء في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية في معهد بيكمان للأبحاث في مدينة الأمل، وروجر مور، أعضاء في مدينة الأمل بروتوميك كور وقسم المناعة الجزيئية. تبدأ من خلال زيادة HLfB بشكل ثابت التعبير عن خلية هيلا ثقافة خط في ثلاث، لوحات ثقافة 100 ملليمتر إلى كثافة مرتين-10-إلى-ستة خلايا في المليلتر. عندما تصل الخلايا إلى التركيز المناسب، اخلط 20 ميكروغرامًا من البلازميد تحتوي على تعريب نوكلار Rev signal 3-prime flag الطفرة من الاهتمام مع 1.76 ملليلتر من TE 79/10 في أنبوب 15 ملليلتر، يليه إضافة 240 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم من نوع اثنين من المولار، مع خلط دقيق.
بعد ذلك، نقل محتويات أنبوب قطرة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر تحتوي على ملليلترين من HBS 2x، تليها الاختلاط على آلة دوامة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، دوامة هطول الأمطار. إضافة ملليلتر واحد من قطرة التعليق إلى كل من ثلاثة, 100 ملليمتر HLfB لوحات الثقافة في حين يحوم بلطف المتوسطة.
بعد احتضان لمدة ست ساعات في حاضنة ثقافة الخلية، استبدل خليط transfection بـ 10 ملليلتر من وسط الثقافة الطازجة، وتعيد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 42 ساعة أخرى. بعد 48 ساعة من عملية الزرع، ضع كل طبق على سرير من الجليد داخل غطاء لثقافة الأنسجة من مستوى الخطر الحيوي اثنين. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية، وشطف بلطف الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني prechilled، دون تعطيل طبقات الخلية.
تجاهل برنامج تلفزيوني بعد شطف الخلايا. المقبل، علاج الخلايا مع ملليلتر واحد من العازلة تحلل، وتستكمل مع كوكتيل مثبطات البروتياز، في كل لوحة. إمالة اللوحات لتجميع الخلايا في بركة، استخدم مكشطة خلية لتعطيل الطبقات يدويًا.
باستخدام 1، 000 ميكرولتر ميكروبيبت، تجمع lysate من كل لوحة في أنبوب prechilled، 15 ملليلتر لاحتضان 15 دقيقة على الجليد، مع دوامة كل خمس دقائق. في نهاية الحضانة، aliquot وlysates في ثلاثة، 1.5 ملليلتر microcentuge الأنابيب، وجمع lysates عن طريق الطرد المركزي. نقل المُنَتَكَّل إلى أنبوب جديد بـ 15 ملليلتر، والحصول على تركيز البروتين الفيروسي، كما هو موضح في المخطوطة.
لcoimmunoprecipitation من Rev نوكليولار إشارة إشارة ثلاثة رئيس العلم، شطف 25 microliters من الخرز هلام M2 تقارب ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من عازلة تحلل جديدة، وتستكمل مع كوكتيل مثبطات البروتيز، لكل غسل. قم بإجراء هذه الخطوات في غرفة باردة أو مع الكواشف على الجليد. بعد الشطف الأخير ، أضف تركيزًا واحدًا لكل ملليلتر من البروتين الفيروسي إلى الخرز المشطف في حجم نهائي من خمسة ملليلتر من عازلة التحلل.
احتضان رد الفعل لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية مع التناوب. في نهاية الحضانة، بيليه البروتين الفيروسي lysate-متقارنة الخرز من قبل الطرد المركزي. جمع فائق لقياس ما بعد المناعي تركيز البروتين.
راجع المخطوطة للحصول على إرشادات تخزين العينات. إضافة 750 ميكرولترات من العازلة تحلل إلى البروتين الفيروسي lysate-مترافق حبة بيليه، ونقل الخرز إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر، وغسل الخرز على دوار لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. جمع الخرز عن طريق الطرد المركزي لغسل اثنين إضافية على الدوار، كما أظهرت للتو.
بعد الغسيل الأخير ، استخدم طرفًا مقروصًا وطويلًا وتحميلًا للجل لإزالة أي آثار لمخزن تحلل من مجمع الخرز - coimmununoprecipcipitation. Resuspend الخرز في 55 ميكروليتر من 2x تحميل العازلة. ثم، تغلي العينة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
تحميل 25 ميكرولترات من الوميض على هلام واحد بقعة الغربية واحد وCoomassie تلطيخ هلام SDS-PAGE. بعد الانتهاء من الكبسولات الكهربائية هلام SDS-PAGE، شطف الجل ثلاث مرات في 25 ملليلتر من الماء فائقة الخطورة لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل الأخير، أضف 100 ملليلتر من كاشف البقعة Coomassie على الجل.
انظر المخطوطة للاطلاع على بروتوكول التلطيخ الكامل. من أجل هضم نطاقات الجل، استخدم أولاً شفرة حلاقة نظيفة لقطع نطاقات الجل من الممر بأكمله من الجل، الذي يمثل كل طفرة، إلى مكعبات يبلغ طولها حوالي خمسة ملليمترات. ضع كل فرقة في أنبوب 0.5 ملليلتر صغير.
غطي النطاقات مرتين ببيكرونيوم أمونيوم 100 ميليملي في محلول أسيتونتريريل إلى الماء من واحد إلى واحد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لكل مغسلة. ثم جففي قطع الجل لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي فراغي. للحد من البروتينات، وتغطية القطع هلام المجففة مع dithiothreitol 10 ملليمولار في بيكربونات 100 ملليمولار لاحتضان لمدة ساعة واحدة في 56 درجة مئوية، تليها الألكليل في iodoacetamide 100 ملليمولار في الماء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
المقبل, تقليص وإعادة بيع القطع هلام مرتين مع الأسيتريتريل, تليها bicarbonate الأمونيوم 100 ملليمول, على حد سواء مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد إعادة التجفيف الثانية، جفف قطع الجل لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي فراغي. تضخّم قطع الجل مع 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من التربسين المعدلة من الدرجة التسلسلية في بيكربونات الميكرومونيوم 100 ملليمول.
بعد خمس دقائق، تغطية قطع هلام مع bicarbonate الأمونيوم 100 ملليمول، والسماح لهم لإعادة تويل تماما، مضيفا إضافية 100 ملليمول بيكربونات الهيمونيوم حتى يتم تغطية قطع هلام منتفخة تماما. ثم، احتضان القطع هلام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، ووقف التفاعل مع 1/10 من حجم العينات مع حمض فورميك 10٪ في الماء في صباح اليوم التالي، وجمع افرامن من كل أنبوب. Rev النيوليار إشارة العلم ثلاثة رئيس يمكن الكشف عنها تحت ثلاثة ظروف عازلة تحلل مختلفة تحتوي على تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم.
كما يمكن اكتشاف B23 في عازلة التحلل التي تحتوي على تركيز الملح المنخفض، وبالكاد يمكن اكتشافها في عازلة التحلل التي تحتوي على تركيز الملح المتوسط، ولا يمكن اكتشافها في عازلة التحلل التي تحتوي على تركيز عال من الملح. B23 الكشف هو الأمثل في عازلة التحلل التي تحتوي على تركيز كلوريد الصوديوم منخفضة مع البرية من نوع القس ثلاثة رئيس العلم ويفقد تقارب مع Rev النيوليار التعريب إشارة M1 العلم ثلاثة رئيس الوزراء. B23 تقارب مع البرية من نوع القس ثلاثة رئيس العلم يقلل أيضا مع تركيز الملح أعلى، والتحكم السلبي pcDNA لا تسفر عن عدم تحديد المناعة بعد التحلل المناعي في ظل كل من ظروف العازلة تحلل.
Rev nucleolar إشارة إشارة ثلاثة رئيس العلم هو الأكثر كشف بعد elution من خلال الغليان في 2x عينة تحميل العازلة، في حين B23 هو يمكن الكشف عنها تحت كل من 37-و 95 درجة مئوية ظروف الحضانة العازلة عينة. بعد الانتراس المناعي وتلطيخ الفضة، كما هو موضح، البرية من النوع القس والترجمة النيوكلار الإشارات M2، M6، و M9 قابلة للكشف في 18 كيلودالتون. كما لوحظت النطاقات المقابلة لبروتين B23 عند علامة 37 كيلودالتون.
يُظهر التلطيخ مع كاشف Coomassie إمكانية الكشف عن إشارة توطين النيوكلار Rev إشارة ثلاثة رؤساء في وجود وغياب الطفرات في 18 كيلودالتون. استخدم العديد من عناصر التحكم، الإيجابية والسلبية على حد سواء، حسب الضرورة بالنسبة للمراجع التي تتعلق بنموذج المرض أثناء عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها وفحصها بالنسبة لعوامل الربط المحتملة. ويمكن فحص جميع الحذف والطفرات أحادية نقطة للنشاط السلبي السائد من خلال تعدد الأفكار مع ريف من النوع البرية واستخدامها في القبض على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1.
