Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Протеасы являются одной из наиболее исследованных групп биомолекулярных опор в научных и промышленных исследованиях. Их мощная роль в нескольких физиологических и патологических процессах делает их заметной мишенью в области обнаружения наркотиков, а также. Что касается их интенсивных исследований, существует большой и постоянный спрос на разработку времени и экономии высокой пропускной способности скрининга совместимых флуоресценции протеазы анализ платформ.

Здесь мы хотели бы ввести протокол для применения на основе разделения высокой пропускной способности скрининга совместимых флуоресценции анализ платформы с использованием как mTurquoise2-и mApple-сплавленных рекомбинантных синтеза протеазы субстратов. Кроме того, мы хотели бы продемонстрировать метод в-гель ренатурации субстратов и расщепления фрагментов образцов анализа после денатурации SDS-PAGE, а также. Все эксперименты проводятся на примере протеазы вируса ВИЧ-1.

Выражение плазмид несет в себе последовательность кодирования гекса гистадина сродство теги и мальтозы связывания синтеза белка следуют контроль расщепления участка табака etch вирус протеазы, клонирование кассеты, и C-терминал флуоресцентный белок. Линейное выражение плазмида PacI и NheI ограничения эндонуклейсов. Выполните annealing Escherichia coli кодон оптимизирован вперед и обратного oligonucleotide грунтовки, что код для субстрата последовательность интересов и фланг PacI и NheI сплоченных концов.

Выполните вставку анналированных грунтовок в линейное выражение плазмида путем перевязки. Для экспрессии белка, трансформировать BL21(DE3) компетентных клеток по перевязке смеси. Флуоресцентные белки будут в том же открытом считывании с N-терминальными тегами синтеза только после успешной перевязки.

Через несколько дней после преобразования колонии, содержащие плазмидное выражение, кодирующие вставленный участок расщепления, представляющий интерес, покажут видимую флуоресценцию с или даже без использования синего трансиллюминатора Dark Reader. Добавьте 10 микролитров глицеролового запаса клеток BL21(DE3), несущих плазмидное кодирование экспрессии для последовательности участка расщепления, представляющих интерес для пяти миллилитров LB среды, содержащей 100 микрограммов на миллилитр ампициллина в 50 миллилитровой центрифуге трубки. Инкубировать подвеску при 37 градусах в течение 15 часов, постоянно встряхивая.

Перенесите пятимиллилитровую бактериальную культуру на 50 миллилитров свежей среды LB, содержащей 100 микрограмм на миллилитр ампициллина. Выращиваем клетки на 37 градусов до поглощения от 0,6 до 0,8 на 600 длинах волн нанометров. На этом этапе индуцировать экспрессию белка путем добавления IPTG.

После этого инкубировать культуру в течение трех часов при 37 градусах, непрерывно встряхивая. После инкубации перенесите 25 миллилитров культуры в чистые 50 миллилитровых центрифугных трубок и соберите клетки путем центрифугации. Откажитесь от супернатанта и храните гранулы бактериальных клеток при температуре минус 70 градусов в течение по крайней мере часа.

Клеточные гранулы, содержащие успешно выраженные флуоресцентные белки, ясно показывают флуоресценцию с или даже без использования синего трансиллюминатора Dark Reader. Поместите замороженные гранулы клетки на лед и дайте ему оттаять в течение 15 минут. Добавьте два миллилитров лиза буфера гранулы и приостановить клетки.

После этого добавьте ингибитор протеазы, освободите суспензию от лизозима и DNase, приостановите клетки и инкубировать суспензию на льду в течение 15 минут. Передача два раза один миллилитр подвески в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и sonicate подвески в течение трех минут в раундах 10 секунд sonication и пять секунд перерыва. Центрифуга труб при температуре 10 000 г в течение 20 минут при комнатной температуре.

Очищенные лизаты бактериальных клеток, содержащие флуоресцентный субстрат интереса, показывают видимую флуоресценцию с или даже без использования синего трансиллюминатора Dark Reader. Процедура разработанного анализа протеазы начинается с подготовки образцов анализа. Во-первых, рекомбинантные субстраты инкубируются магнитными бусинками сродства, и образуются магнитные бусинки, прикрепленные к субстрату, сокращенно SAMB.

SAMB промывают несколько раз, и, наконец, решение SAMB запаса готовится aliquoting которых анализ образцов создаются. Реакции инициализируются добавлением раствора протеазы. После расщепления протеазой протеолитические фрагменты высвобождаются в супернатант.

Реакция прекращается отделением магнитных бусин от буфера реакции, который содержит флуоресцентные продукты расщепления и фермент. Супернатанты применяются к скважинам микротитровой пластины, а флуоресценция определяется флуориметрией. Кривые калибровки генерируются с использованием очищенных флуоресцентных субстратов, решенных в каждом анализе буферов.

Концентрация C-терминальных флуоресцентных продуктов расщепления, а также прикладного субстрата в образцах анализа определяется на основе наклона кривых калибровки. Поместите трубку, содержащую новые или переработанные никель-NPA магнитных агарозных бусин в концентратор магнитных частиц. Бусы могут прилипать к стене и/или в крышку микроцентрифугной трубки.

Поэтому переключите концентратор вверх дном во всех направлениях, чтобы убедиться, что все бусы собраны. Удалите супернатант и отбросьте его. Добавьте буфер лиза 1,8 миллилитров в бусины и удалите закрытые трубки из концентратора.

Приостанавливать бисер в трубке, встряхивая и / или переворачивая трубку вверх дном, пока бисер полностью однородным. Поместите трубки обратно в концентратор и переверните его вверх дном во всех направлениях, чтобы убедиться, что все бусы собраны. Откройте трубку и отбросьте супернатант.

Добавьте очищенную бактерию-стерильную лизат, содержащую подложку интереса, и удалите закрытую трубку из концентратора. Переверни трубки вверх дном, пока шарики не будут полностью однородны и не повернут трубки на ротатор, медленно, при комнатной температуре в течение 30 минут. SAMB показывают видимую флуоресценцию с или даже без использования синего трансиллюминатора Dark Reader.

Вымойте SAMBs три раза на 1,8 миллилитра 1%Tween 20, стиральный буфер, и буфер расщепления. Добавьте буфер расщепления в промытые SAMB для создания решения SAMB. При использовании двухмилитровых белково-низкообязательных микроцентрифугных трубок объем применяемого буфера расщепления составляет до 1,9 миллилитров.

После добавления буфера не встряхивать и не переворачивать трубку вверх дном. Закройте трубку и удалите ее из концентратора. Подготовка двухми миллилитров белка-низкообязательной микроцентрифуг трубки для анализа образцов.

Приостанавливать решение SAMB акций до тех пор, пока оно не станет полностью однородным и не измерит количество субстрата, который будет проанализирован в реакциях, немедленно передав решение samB в пробные флаконы. Объем переданного решения samB рекомендуется использовать в размере от 25 до 300 микролитров, но он должен устанавливаться в соответствии с индивидуальным экспериментальным дизайном. Поместите пробные трубки, содержащие алиментные подвески SAMB, в концентратор.

Аккуратно удалите супернатант из SAMB и отбросьте его. Снимите трубки с концентратора и аккуратно добавьте буфер реакции в SAMB. Объем дополнительного буфера реакции должен быть рассчитан в соответствии с индивидуальной экспериментальной конструкцией, но рекомендуется установить окончательный объем реакционной смеси между 50 и 150 микролитров, если используются двухми миллилитровые трубки.

Закройте крышки труб. Теперь образцы готовы к инициализированию. Добавьте ферментный раствор в образцы реакции.

Тщательно размешайте бисер, аккуратно перемещая трубки и поместите трубки сразу в уже дрожащийся термошакер. В случае субстратных пустых образцов и образцов контроля субстрата добавьте буфер расщепления и буфер элюции соответственно. За тридцать секунд до окончания инкубации вынюхив образец из термошакера и быстро закрути его.

Поместите трубку на концентратор и дайте трубке стоять в течение 15 секунд. Сбору САМБ может способствовать слегкае перемещение концентратора туда-сюда. Откройте крышку и перенесите супернатант тщательно в тарелку или новую трубку.

Не прикасайтесь к концентрированным бусинкам кончиком пипетки. Собранный супернатант образцов контроля субстрата и образцов реакции с высокой степенью расщепления может показать видимую флуоресценцию с или даже без использования синего трансиллюминатора Dark Reader. Перенесите два раза 30 микролитров разделенных образцов супернатантов в черную микроплюй половины площади.

Измерьте флуоресценцию с помощью флуориметра с помощью соответствующих фильтров в соответствии с применяемым флуоресцентным белком. Для очистки флуоресцентных субстратов подготовьте тот же раствор, что и описано ранее, и отбросьте супернатант. Добавьте от 400 до 600 микролитров элюционного буфера в SAMBs и медленно поверните трубки на ротатор при комнатной температуре в течение пяти минут.

Перенесите элуат в новые белково-низкообязательное микроцентрифуговые трубки. Он показывает хорошо видимую флуоресценцию с или без использования синего трансиллюминатора Dark Reader. После очистки, буферного обмена и измерения содержания белка, подготовить двукратное последовательное разбавление, по крайней мере восемь шагов, как от elution-буфер-и расщепления буфера решены субстрат решений, используя elution или расщепления буфера для разбавления соответственно.

Перенесите 30 микролитров каждой точки разбавления в черную микроплюй половины площади. Измерьте флуоресценцию с помощью флуориметра с помощью тех же параметров, которые были применены при измерении анализа образцов супернатантов. В качестве примера для обработки данных, субстрат-зависимых кинетических измерений ВИЧ-1 протеазы была выполнена на mTurquoise2-сплавленной форме рекомбинантного субстрата кодирования расщепления сайта между матрицей и капсидных белков в естественном gapic белка предшественника.

Участок исправленных относительных значений интенсивности флуоресценции против молярной концентрации очищенных субстратов, решить либо расщепления или элюционного буфера, и выполнить линейную регрессию. Рассчитайте концентрацию моляра продуктов расщепления C-терминала в образцах реакции с помощью наклона кривой калибровки на основе расщепления буфера. Также вычислите прикладную концентрацию субстрата в образцах реакции на основе концентрации моляра элератного субстрата в образцах управления субстратом с использованием наклона кривой калибровки на основе элюционного буфера.

Первоначальные значения скорости были рассчитаны из количества фрагментов расщепления C-терминала, а затем построены на основе применяемой концентрации субстрата. Также кинетические параметры определялись нелинейным регрессионный анализом Михаэлиса-Ментена. После выполнения никеля-НТА магнитной бисером на основе анализа, анализ supernatants могут быть проанализированы полиакриламинид гель электрофорез, а также.

Однако, помимо анализа образцов анализа, можно также проанализировать очищенные флуоресцентные субстраты и/или фрагменты расщепления после пищеварения в растворе. Для пищеварения в растворе, aliquote очищенные флуоресцентные субстраты, которые будут усваивается растворяется в буфере расщепления в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, и добавить ферментный раствор в образцах. Инкубировать образцы в соответствии с экспериментальным дизайном и прекратить реакции по процедуре подготовки образца для PAGE.

Для неденатурированной подготовки образца смешайте образцы, которые будут проанализированы, с неденатурированным буфером загрузки образца, не содержащим никаких уменьшающих агентов. В случае подготовки денатурированного образца смешайте образцы, которые будут проанализированы, с буфером загрузки образца и подвергайте образцы тепловой обработке при температуре 95 градусов в течение 10 минут. Нанесите неденатурированные и денатурированные образцы в скважины геля SDS-полякриламид и выполняя электрофорез.

Удалите гелевую кассету из запущенного модуля. Не денатурированные образцы уже видны в гель даже невооруженным глазом или с темным читателем синий трансиллюминатор. Для того, чтобы обнаружить флуоресцентные компоненты денатурированных образцов на трансиллюминаторе, выполните в-гель ренатурации путем мытья SDS из геля.

Добавьте 100 миллилитров дистиллированной воды в гель и промойте его по крайней мере в течение 30 минут. Визуализууте флуоресцентные белки, поместив необлядный гель на синий трансиллюминатор Dark Reader. Рекомбинантные флуоресцентные белки синтеза были разработаны для использования в качестве субстратов в протеолитических анализах.

При расщеплении протеазой в конкретном месте расщепления высвобождается фрагмент флуоресцентного расщепления C-терминала и обнаруживается его флуоресценция. Их использование в никель-NTA магнитного бисера на основе анализа и флуоресцентного обнаружения с помощью анализа PAGE были оптимизированы с помощью ВИЧ-1 протеазы. Тем не менее, разработанная платформа анализа может быть подходящим для других proteases, а также.

Кривые калибровки очищенных субстратов, решенных в буфере расщепления или элюции, иллюстрируются на примерах как mTurquoise2-, так и mEYFP-сплавленной формы рекомбинантного субстрата, кодирующей сторону расщепления между матрицей и капсидными белками естественного анехового белка ВИЧ. Анализ на основе магнитного шарика на основе никеля-НТА является полезным инструментом для изучения влияния концентрации субстрата на скорость реакции и тем самым также делает возможным определение кинетических параметров фермента, таких как Vmax и Km. Диаграмма А показывает оптимальный результат, полученный после успешно выполненного анализа субстрат-зависимой активности на субстрате, сплавленной mApple.

Диаграмма B, напротив, представляет собой неоптимальный результат, при котором недостаточная гомогенизация решения по запасу SAMB создает проблемы при настройке надлежащих концентраций субстрата, в то время как неправильное прекращение образцов реакции приводит к относительно высоким ошибкам. Анализ также является подходящим инструментом для выполнения тайм-курса и ингибирующие исследования, а также. Диаграмма А демонстрирует зависимость времени протеолитического расщепления протеазы ВИЧ-1 от субстрата mEYFP, в то время как диаграмма B представляет собой ингибирующее влияние амперренавира на реакцию расщепления.

Из данных, полученных в результате ингибирующего исследования, можно определить как активную концентрацию ферментов, так и ингибирующую константу. Анализ также может быть оптимизирован для изучения зависимости ферментной активности от рН, так как он представлен диаграммой А на примере протеазы вируса etch табака. Диаграмма B указывает на ограничение анализа рН и показывает, что нейтральный или слегка щелочный рН полностью совместим с измерениями, в то время как кислый рН облегчает спонтанное разобщение субстратов с поверхности магнитных бусин.

Нынешняя цифра показывает очищенные нетронутые флуоресцентные субстраты, флуоресцентные фрагменты расщепления C-терминала, генерируемые пищеварением в растворе протеазой ВИЧ-1. Флуоресцентные компоненты могут быть обнаружены в SDS-содержащих полиакриламинид гель синий свет трансиллюминации сразу после электрофорез, если не-денатурации условия были применены во время подготовки образца. Различные флуоресцентные белки могут быть дифференцированы в зависимости от их цвета.

После анализа на основе магнитного бисера, не денатурированные флуоресцентные белки в образце супернатантов могут быть обнаружены в гель с помощью УФ-освещения, а также. В отличие от этого, если условия денатурации применяются во время подготовки образца, денатурированные белки не могут быть обнаружены в геле сразу после SDS PAGE. Тем не менее, денатурированные флуоресцентные белки могут быть частично отречены от удаления SDS из геля и стать обнаруживаемыми.

Таким образом, SDS PAGE сопровождается процедурой ренатурации в геле. Способность ренатурации флуоресцентных белков делает их идентификацию возможной не только на основе их флуоресценции, но и на основе их молекулярного веса. Здесь мы продемонстрировали протокол использования нашей недавно разработанной магнитной платформы анализа флуоресцентных протеаз на основе бисера.

Мы продемонстрировали использование этой системы на примере ферментных кинетических исследований протеазы ВИЧ-1. Мы использовали mTurquoise-и mApple-сплавленные формы рекомбинантного субстрата анализа, который содержал последовательность места расщепления протеазы. Помимо фторметрического анализа, анализ образцов были впоследствии проанализированы SDS PAGE, а также.

Мы показали, что денатурированные флуоресцентные белки могут быть частично ренатурированы в геле после SDS PAGE, который обеспечивает как флуоресцентную, так и молекулярно-весовую идентификацию субстрата и протеолитических фрагментов.