פרוטאזות הן אחת הקבוצות הנחקרות ביותר של תמיכות ביומולקולריות במחקר אקדמי ותעשייתי. תפקידם רב העוצמה במספר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים הופך אותם למטרה בולטת גם בתחום גילוי הסמים. לגבי המחקר האינטנסיבי שלהם, יש ביקוש גדול ומתמשך לפיתוח פלטפורמות מבדיקה פלואורסצנטיות תואמות תפוקה גבוהה וחיסכון בעלויות.
כאן, ברצוננו להציג פרוטוקול עבור היישום של פלטפורמת מבדיקה פלואורסצנטית תואמת סינון תפוקה גבוהה המבוססת על הפרדה באמצעות שני mTurquoise2-ו mApple מותך מצעים פרוטאז היתוך רקומביננטי. בנוסף, ברצוננו להדגים שיטה לריבוי בג'ל של המצעים ושברי המחשוף של דגימות ההתקנה לאחר ביטול ה- SDS-PAGE גם כן. כל הניסויים מתבצעים על הדוגמה של פרוטאז וירוס HIV-1.
הביטוי פלסמיד נושא את רצף הקידוד של תג זיקה היסטדין הקסה וחלבון היתוך מחייב מלטוז ואחריו אתר מחשוף בקרה של פרוטאז וירוס תחריט טבק, קלטת שיבוט, וחלבון פלואורסצנטי מסוף C. ליניארי הביטוי פלסמיד על ידי Endonucleases הגבלת PacI ו- NheI. בצע את חישול של Escherichia codon קולי אופטימיזציה קדימה והפך oligonucleotide פריימרים כי קוד עבור רצף המצע של עניין ואגף על ידי PacI ו NheI קצוות מלוהמים.
בצע את הכנסת פריימרים annealed לתוך הביטוי ליניארי פלסמיד על ידי קשירה. לביטוי חלבון, הפוך תאים מוסמכים BL21(DE3) על-ידי תערובת הקשירה. החלבונים הפלואורסצנטיים יהיו באותה מסגרת קריאה פתוחה עם תגי היתוך N-terminal רק לאחר קשירה מוצלחת.
כמה ימים לאחר השינוי, המושבות המכילות את הביטוי plasmid קידוד אתר המחשוף שנוסף עניין יראה פלואורסצנטיות גלוי עם או אפילו בלי להשתמש transilluminator כחול קורא כהה. הוסף 10 מיקרוליטרים גליצרול מלאי של BL21(DE3) תאים הנושאים את הביטוי פלסמיד קידוד עבור רצף האתר מחשוף של עניין חמישה מיליליטר LB בינוני המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. דגירה ההשעיה ב 37 מעלות במשך 15 שעות תוך רעידות כל הזמן.
מעבירים חמישה מיליליטר תרבות חיידקים ל 50 מיליליטר טרי LB בינוני המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. לגדל את התאים ב 37 מעלות לספיגה של 0.6 עד 0.8 ב 600 אורכי גל ננומטר. בשלב זה, לגרום ביטוי חלבון על ידי תוספת של IPTG.
להלן, הדגירה את התרבות במשך שלוש שעות ב 37 מעלות תוך רעידות רצופות. לאחר הדגירה, להעביר 25 מיליליטר של התרבות לתוך נקי 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה. השליכו את העל-טבעי ואחסנו את כדורי התא החיידקי במינוס 70 מעלות למשך שעה לפחות.
כדורי תא המכילים את החלבונים הפלואורסצנטיים המבוטאים בהצלחה מראים בבירור פלואורסצנטיות עם או אפילו בלי להשתמש transilluminator כחול קורא כהה. מניחים את גלולת התא הקפוא על קרח ולתת לו להפשיר במשך 15 דקות. הוסף שני מיליליטר מאגר תזה לכדור ולהשעות את התאים.
לאחר מכן, להוסיף מעכב פרוטאז, לשחרר את ההשעיה על ידי lyzozyme ו DNase, להשעות את התאים, דגירה ההשעיה על הקרח במשך 15 דקות. מעבירים פעמיים מתלים מיליליטר אחד לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ו sonicate המתלים במשך שלוש דקות בסיבובים של 10 שניות של sonication וחמש שניות הפסקה. צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
ליזטים של תאי חיידקים מנוקים המכילים את המצע הפלואורסצנטי של עניין מראים פלואורסצנטיות גלויה עם או אפילו בלי שימוש במשדר כחול של Dark Reader. ההליך של הבדיקה protease מפותחת מתחיל עם הכנת דגימות הבדיקה. ראשית, המצעים הרקומביננטיים מודגרים עם חרוזים מגנטיים זיקה, ואת חרוזים מגנטיים המחוברים מצע, מקוצר כמו SAMBs, נוצרים.
SAMBs נשטפים מספר פעמים, ולבסוף פתרון המניות SAMB מוכן על ידי aliquoting אשר דגימות assay נוצרים. התגובות מאותחלות על ידי תוספת של פתרון פרוטאז. עם המחשוף על ידי הפרוטאז, השברים הפרוטוקליפטיים משתחררים אל העל-טבעי.
התגובה מופסקת על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים ממאגר התגובה המכיל את מוצרי המחשוף הפלואורסצנטי ואת האנזים. העל-טבעיים מוחלים על בארות של צלחת מיקרוטיטר והנוהורסצנטיות נקבעת על ידי פלואורימטריה. עקומות כיול נוצרות באמצעות מצעים פלואורסצנטיים מטוהרים הפתרו בכל מאגרי מרשם.
ריכוז מוצרי המחשוף הפלואורסצנטי C-terminal וגם זה של המצע המוחל בדגימות ההתבססות נקבעים על סמך שיפוע עקומות הכיול. מניחים את הצינור המכיל חרוזים חדשים או ממוחזרים ניקל-NPA מגנטי agarose ברכז חלקיקים מגנטיים. חרוזים עשויים להידבק לקיר ו /או למכסה של צינור המיקרוצנטריפוגה.
לכן, להפוך את הקונצנטרי הפוך לכל כיוון כדי לוודא כי כל חרוזים נאספים. הסר את העל-טבעי והשליך אותו. הוסף חיץ תזה 1.8 מיליליטר אל חרוזים ולהסיר את הצינורות הסגורים מן הקונצנטרי.
להשעות את חרוזים בצינור על ידי טלטול ו / או הפיכת הצינור במהופך עד חרוזים הם הומוגניים לחלוטין. מניחים את הצינורות בחזרה במרכז ולהפוך אותו במהופך לכל כיוון כדי לוודא כי כל חרוזים נאספים. פתח את הצינור והשליך את העל-טבעי.
מוסיפים ליסט חיידקים סטריליים מנוקים המכילים את מצע העניין ומסירים את הצינור הסגור מהרכז. להפוך את הצינורות במהופך עד חרוזים הם הומוגניים לחלוטין לסובב את הצינורות על ידי מסובב, לאט, בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. SAMBs מציגים פלואורסצנטיות גלויה עם או אפילו בלי להשתמש במציל כחול של קורא כהה.
שטפו את ה-SAMBs שלוש פעמים ב-1.8 מיליליטר 1%Tween 20, חיץ כביסה ומחשוף. הוסף מאגר מחשוף ל- SAMBs השטופים כדי ליצור פתרון מניית SAMB. אם משתמשים בצינורות מיקרוצנטריפוגה עם שני מיליליטר חלבון נמוך מחייב, נפח מאגר המחשוף המוחל הוא עד 1.9 מיליליטר.
לאחר הוספת המאגר, אין לנער או להפוך את הצינור במהופך. סגור את הצינור והסר אותו מהרכז. הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה עתירי חלבון באורך שני מיליליטר לדגימות המדגמים.
להשעות את פתרון המלאי SAMB עד שהוא הומוגני לחלוטין ולמדוד את כמות המצע כדי להיות מנותח בתגובות על ידי העברה מיידית של פתרון המלאי SAMB לתוך בקבוקונים מדגם. הנפח של פתרון המלאי SAMB להיות מועבר מומלץ להיות 25 כדי 300 microliters, אבל זה צריך להיות מוגדר על פי עיצוב ניסיוני בודדים. מניחים את צינורות הדגימה המכילים את מתלי SAMB האליקוטיים לתוך הקונצנטרי.
בזהירות להסיר את supernatant מן SAMBs ולהשליך אותו. הסר את הצינורות מהרכז והוסף בזהירות את מאגר התגובות ל- SAMBs. יש לחשב את נפח מאגר התגובה הנוסף על פי התכנון הניסיוני הבודד, אך מומלץ להגדיר את הנפח הסופי של תערובת התגובה בין 50 ל -150 מיקרוליטרים אם נעשה שימוש בשני צינורות מיליליטר.
סגור את מכסי הצינורות. עכשיו, הדגימות מוכנות לאתחול. הוסף את פתרון האנזים לדגימות התגובה.
מערבבים את חרוזים בזהירות על ידי הזזה עדינה של הצינורות ומ מניחים את הצינורות מיד לתוך תרמושאקר רועד כבר. במקרה של דגימות ריקות מצע ודגימות בקרת מצע, הוסף מאגר מחשוף ומאגר אלוטיון בהתאמה. שלושים שניות לפני סוף הדגירה, מוציאים את הדגימה מהתרמושאקר ומסובבים אותה מיד.
מניחים את הצינור על הקונצנטרי ולתת את הצינור לעמוד במשך 15 שניות. האוסף של SAMBs ניתן להקל על ידי הזזה קלה של הקונצנטרי קדימה ואחורה. פתח את המכסה ולהעביר את supernatant בזהירות לתוך צלחת או צינור חדש.
אל תיגעו גם עם חרוזים מרוכזים בקצה הפיפיט. העל-טבעי שנאסף של דגימות בקרת המצע ודגימות התגובה עם רמה גבוהה של מחשוף עשויים להראות פלואורסצנטיות גלויה עם או אפילו בלי להשתמש transilluminator כחול קורא כהה. מעבירים פעמיים 30 מיקרוליטרים של העל-טבעיים המופרדים למיקרו-לוחית שחורה בחצי שטח.
למדוד את הפלואורסצנטיות על ידי פלואורימטר באמצעות המסננים המתאימים על פי חלבון פלואורסצנטי להחיל. לטיהור המצעים הפלואורסצנטיים, הכינו את אותו פתרון כמתואר קודם לכן, והשליכו את העל-טבעי. הוסף 400 עד 600 מאגר אלוט של מיקרוליטרים ל- SAMBs וסובב את הצינורות על-ידי סיבוב איטי בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
מעבירים את ה-eluate לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים בעלי חלבון נמוך. זה מראה פלואורסצנטיות גלויה בבירור עם או בלי שימוש transilluminator כחול קורא כהה. לאחר הטיהור, חילופי החיצים ומדידת תוכן החלבון, הכינו דילול סדרתי כפול בשמונה שלבים לפחות, הן מפתרונות המצעים הפתורים באמצעות מאגר מחשוף או מחשוף לדילול בהתאמה.
מעבירים 30 מיקרוליטרים של כל נקודת דילול למיקרופלסטיק שחור בחצי שטח. למדוד את הפלואורסצנטיות על ידי פלואורימטר באמצעות אותן הגדרות שהוחלו במדידת העל-טבעיים מדגם ההתמדה. כדוגמה לעיבוד נתונים, המדידות הקינטיות התלויות במצעים של פרוטאז HIV-1 בוצעו בצורה מותכת mTurquoise2 של המצע הרקומביננטי המקידוד של אתר המחשוף בין המטריצה לחלבונים הפלפלים במבשר החלבון הפערי הטבעי.
התווה את ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית מתוקנים כנגד הריכוז הטוחן של המצעים המטוהרים, פתור את מאגר המחשוף או האלוטיון ובצע רגרסיה ליניארית. חישבו את הריכוז הטוחן של מוצרי המחשוף של מסוף C בדגימות התגובה באמצעות השיפוע של עקומת הכיול המבוססת על חיץ מחשוף. כמו כן לחשב את ריכוז המצע להחיל בדגימות התגובה מבוסס על הריכוז הטוחנת של המצע אלוט בדגימות בקרת המצע באמצעות השיפוע של עקומת כיול מבוססת מאגר אלוטיון.
ערכי מהירות ראשוניים חושבו מכמות שברי המחשוף של מסוף C ולאחר מכן התווה כנגד ריכוז המצע המוחל. גם פרמטרים קינטיים נקבעו על ידי ניתוח רגרסיה לא ליניארי מיכאליס-מטן. לאחר ביצוע בדיקת חרוזים מגנטיים ניקל-NTA, על-טבעיים הסתערות ניתן לנתח על ידי אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide גם כן.
עם זאת, לצד ניתוח דגימות ההטעיה, ניתן גם לנתח את המצעים הפלואורסצנטיים המטוהרים ו/או את שברי המחשוף לאחר עיכול בפתרון. לעיכול בתמיסה, יש לעכל את המצעים הפלואורסצנטיים המטוהרים המומסים במאגר המחשוף לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ומוסיפים את תמיסת האנזים לדגימות. הדגירה את הדגימות על פי העיצוב הניסיוני ולסיים את התגובות על ידי ההליך של הכנת המדגם עבור PAGE.
להכנת מדגם ללא זיהוי, מערבבים את הדגימות שיש לנתח עם מאגר טעינה מדגם nondenaturing המכיל ללא סוכנים מפחיתים. במקרה של הכנת מדגם denatured, מערבבים את הדגימות שיש לנתח עם חיץ טעינת מדגם denaturing ולחשוף את הדגימות לטיפול בחום ב 95 מעלות במשך 10 דקות. החל את הדגימות שאינן denatured ואת denatured לתוך בארות של ג'ל SDS-polyacrylamide ולבצע אלקטרופורזה.
הסר את קלטת הג'ל מהמודול הפועל. דגימות שאינן denatured כבר גלויים בג'ל אפילו בעין בלתי או עם transilluminator כחול קורא כהה. על מנת לזהות את הרכיבים הפלואורסצנטיים של הדגימות denatured על transilluminator, לבצע את renaturation בג'ל על ידי שטיפת SDS מתוך הג'ל.
מוסיפים 100 מיליליטר מים מזוקקים לג'ל ושטיפתו לפחות במשך 30 דקות. דמיינו את החלבונים הפלואורסצנטיים על ידי הנחת הג'ל הבלתי נגוע על המשדר הכחול של הקורא האפל. חלבוני ההיתוך הפלואורסצנטיים הרקומביננטיים תוכננו לשמש כמצעים במשטחים פרוטאוליטיים.
עם המחשוף על ידי הפרוטאז באתר המחשוף הספציפי, שבר המחשוף הפלואורסצנטי C-terminal משתחרר ונוהג ניתן לזהות את הפלואורסצנטיות שלו. השימוש שלהם בבדיקות מבוססות חרוזים מגנטיים ניקל-NTA וזיהוי פלואורסצנטי על ידי ניתוח PAGE כבר אופטימיזציה באמצעות פרוטאז HIV-1. עם זאת, פלטפורמת ההתזה המפותחת יכולה להתאים גם לפרוטאזות אחרות.
עקומות הכיול של המצעים המטוהרים הפתירים במאגר המחשוף או האלוטיון מודגמות בדוגמאות של הצורה המותכת mTurquoise2 ו- mEYFP של המצע הרקומביננטי המקידוד את צד המחשוף בין המטריצה לחלבונים הפלפלים של החלבון האנצ'ואאיפי הטבעי HIV. בדיקת חרוזים מגנטיים ניקל-NTA היא כלי שימושי לבחינת ההשפעה של ריכוז מצע על מהירות התגובה ובכך גם עושה את קביעת הפרמטרים הקינטיים האנזים כגון Vmax ו ק"מ אפשרי. דיאגרמה א' מציגה תוצאה מיטבית המתקבלת לאחר ניתוח שבוצע בהצלחה של פעילות תלוית מצע במצע מותך-mApple.
לעומת זאת, דיאגרמה ב' מציגה תוצאה תת-אופטימלית שבה ההומוגניזציה הלא מספקת של פתרון המלאי SAMB גורמת לבעיות בהגדרת ריכוזי המצע הנכונים, בעוד שסיום לא תקין של דגימות התגובה גורם לשגיאות גבוהות יחסית. ההתמדה מספקת גם כלי מתאים לביצוע קורסי זמן ועיכובים גם כן. דיאגרמה א' מדגימה את תלות הזמן של המחשוף הפרוטאוליטי של פרוטאז HIV-1 על מצע מותך mEYFP, בעוד שדיאגרמה B מייצגת את ההשפעה המעכבת של אמפיר על תגובת המחשוף.
מהנתונים המתקבלים על ידי המחקר המעכב, ניתן לקבוע הן את ריכוז האנזים הפעיל והן את הקבוע המעכב. ניתן גם לייעל את המבחן כדי לחקור את התלות של פעילות האנזים ב- pH, מכיוון שהוא מיוצג על ידי דיאגרמה A על הדוגמה של פרוטאז וירוס תחריט טבק. דיאגרמה B מציינת מגבלה של ההתמדה על ידי pH ומראה כי pH ניטרלי או מעט אלקלית תואם באופן מלא עם המדידות, בעוד חומצי pH מקל על דיסוציאציה ספונטנית של המצעים מפני השטח של חרוזים מגנטיים.
הנתון הנוכחי מראה את המצעים הפלואורסצנטיים המטוהרים ללא פגע, שברי המחשוף הפלואורסצנטיים של מסוף C, הנוצרים על ידי עיכול בתת-פתרון על ידי פרוטאז HIV-1. ניתן לזהות את הרכיבים הפלואורסצנטיים בג'ל פוליאקרילמיד המכיל SDS על ידי טרנסילומינציה של אור כחול מיד לאחר האלקטרופורזה אם התנאים שאינם denaturing יוחלו במהלך הכנת המדגם. חלבונים פלואורסצנטיים שונים ניתן להבדיל על סמך הצבע שלהם.
לאחר ההתמדה המגנטית המבוססת על חרוזים, ניתן לזהות את החלבונים הפלואורסצנטיים שאינם מנוכרים בדגימה גם בג'ל על ידי תאורת UV. לעומת זאת, אם תנאי denaturing מוחלים במהלך הכנת מדגם, חלבונים denatured לא ניתן לזהות את הג'ל מיד לאחר דף SDS. עם זאת, חלבונים פלואורסצנטיים denatured ניתן ללמוד מחדש חלקית על ידי הסרת SDS מן הג'ל ולהיות לזיהוי.
לכן, דף SDS ואחריו הליך renaturation in-gel. יכולת ההשמדה מחדש של החלבונים הפלואורסצנטיים מאפשרת את זיהוים לא רק על סמך הפלואורסצנטיות שלהם, אלא גם על סמך משקלם המולקולרי. כאן הדגמנו את הפרוטוקול לשימוש בפלטפורמת ההתמדה הפלואורסצנטית שלנו המבוססת על חרוזים מגנטיים שפותחה לאחרונה.
הדגמנו את השימוש במערכת זו על הדוגמה של מחקרים קינטיים אנזים על HIV-1 פרוטאז. השתמשנו בצורות mTurquoise-ו- mApple מותכות של מצע ההתזה הרקומביננטי, שהכיל את רצף אתר המחשוף של הפרוטאז. מלבד הניתוח הפלורימטרי, דגימות ההתזה נותחו לאחר מכן גם על ידי SDS PAGE.
הוכחנו כי חלבונים פלואורסצנטיים denatured ניתן לנהור חלקית בג'ל לאחר SDS PAGE אשר מספק הן זיהוי פלורסנט ומשקל מולקולרי מבוסס של המצע ואת שברי פרוטאוליטי.
