Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

Les protéases sont l’un des groupes les plus étudiés de soutiens biomoléculaires dans la recherche universitaire et industrielle. Leur rôle puissant dans plusieurs processus physiologiques et pathologiques en fait également une cible de premier plan dans le domaine de la découverte de médicaments. En ce qui concerne leurs recherches intensives, il existe une forte demande continue pour le développement de plates-formes d’analyse de la fluorescence compatibles avec le dépistage à haut débit et à haut débit.

Ici, nous aimerions introduire un protocole pour l’application d’une plate-forme d’analyse de fluorescence compatible au criblage à haut débit basée sur la séparation utilisant à la fois des substrats de protéase de fusion recombinants fusionnés mTurquoise2 et mApple. En outre, nous aimerions démontrer une méthode pour la renaturation en gel des substrats et les fragments de clivage des échantillons d’essai après avoir dénaturé SDS-PAGE ainsi. Toutes les expériences sont menées sur l’exemple de la protéase virale du VIH-1.

Le plasmide d’expression porte la séquence de codage d’une étiquette d’affinité d’histadine d’hexa et d’une protéine de fusion liant maltose suivie d’un emplacement de clivage de contrôle de la protéase de virus d’etch de tabac, d’une cassette de clonage, et d’une protéine fluorescente de C-terminal. Linéariser l’expression plasmide par PacI et NheI restriction endonucleases. Effectuez l’annealing du codon Escherichia coli optimisé vers l’avant et vers l’arrière des amorces oligonucléotides qui codent pour la séquence de substrat d’intérêt et le flanc par PacI et NheI extrémités cohésives.

Effectuer l’insertion des amorce annelés dans l’expression linéarisée plasmide par ligature. Pour l’expression des protéines, transformer les cellules compétentes BL21(DE3) par le mélange de ligature. Les protéines fluorescentes seront dans le même cadre de lecture ouvert avec les balises de fusion N-terminal seulement après une ligature réussie.

Quelques jours après la transformation, les colonies contenant l’expression plasmide codant le site inséré de clivage d’intérêt montreront une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. Ajouter 10 microlitres de stock de glycérol des cellules BL21(DE3) transportant le codage plasmide d’expression pour la séquence du site de clivage d’intérêt à cinq millilitres LB moyen contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Incuber la suspension à 37 degrés pendant 15 heures tout en secouant constamment.

Transférer la culture bactérienne de cinq millilitres à 50 millilitres de milieu LB frais contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre. Faire croître les cellules à 37 degrés à une absorption de 0,6 à 0,8 à 600 longueurs d’onde nanométriques. À ce stade, induire l’expression des protéines par l’ajout d’IPTG.

Par la suite, incuber la culture pendant trois heures à 37 degrés tout en secouant continuellement. Après l’incubation, transférer 25 millilitres de la culture dans des tubes de centrifugeuse propres de 50 millilitres et récolter les cellules par centrifugation. Jetez le supernatant et conservez les granulés de cellules bactériennes à moins 70 degrés pendant au moins une heure.

Les granulés cellulaires contenant les protéines fluorescentes exprimées avec succès montrent clairement une fluorescence avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. Déposer la pastille de cellules congelées sur la glace et laisser décongeler pendant 15 minutes. Ajouter deux millilitres tampon de lyse à la pastille et suspendre les cellules.

Par la suite, ajouter l’inhibiteur de la protéase, libérer la suspension par lyzozyme et DNase, suspendre les cellules, et incuber la suspension sur la glace pendant 15 minutes. Transférer deux fois une suspension millilitre dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et sonifier les suspensions pendant trois minutes en rondelles de 10 secondes de sonication et de pause de cinq secondes. Centrifuger les tubes à 10 000 g pendant 20 minutes à température ambiante.

Les lysates de cellules bactériennes déblayés contenant le substrat fluorescent d’intérêt montrent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. La procédure de l’analyse de protéase développée commence par la préparation des échantillons d’analyse. Tout d’abord, les substrats recombinants sont incubés avec les perles magnétiques d’affinité, et les perles magnétiques attachées au substrat, abrégées en SAMBs, sont formées.

SamBs sont lavés plusieurs fois, et enfin la solution de stock SAMB est préparé par l’aliquoting dont les échantillons d’analyse sont créés. Les réactions sont paraphées par l’ajout de la solution de protéase. Au clivage par la protéase, les fragments protéolytiques sont libérés dans le surnatant.

La réaction est terminée par la séparation des perles magnétiques du tampon de réaction qui contient les produits fluorescents de clivage et l’enzyme. Les supernatants sont appliqués sur les puits d’une plaque de microtiter et la fluorescence est déterminée par fluorure. Les courbes d’étalonnage sont générées à l’aide de substrats fluorescents purifiés résolus dans chaque tampon d’essai.

La concentration des produits de clivage fluorescent du terminal C et aussi celle du substrat appliqué dans les échantillons d’analyse sont déterminées en fonction de la pente des courbes d’étalonnage. Placer le tube contenant des perles d’agarose magnétiques nickel-NPA neuves ou recyclées dans un concentrateur de particules magnétiques. Les perles peuvent coller au mur et/ou dans le couvercle du tube de microcentrifugeuse.

Par conséquent, tournez le concentrateur à l’envers dans toutes les directions pour s’assurer que toutes les perles sont collectées. Retirer le surnatant et le jeter. Ajouter un tampon de lyse de 1,8 millilitres aux perles et retirer les tubes fermés du concentrateur.

Suspendre les perles dans le tube en secouant et/ou en retournant le tube à l’envers jusqu’à ce que les perles soient complètement homogènes. Placez les tubes dans le concentrateur et tournez-le à l’envers dans toutes les directions pour vous assurer que toutes les perles sont collectées. Ouvrez le tube et jetez le surnatant.

Ajouter le lysate bactérien autorisé contenant le substrat d’intérêt et retirer le tube fermé du concentrateur. Retourner les tubes à l’envers jusqu’à ce que les perles soient complètement homogènes et faire pivoter les tubes par rotateur, lentement, à température ambiante pendant 30 minutes. Les SAMBs affichent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader.

Lavez les SAMBs trois fois par 1,8 millilitre 1%Tween 20, tampon de lavage, et tampon de clivage. Ajoutez un tampon de clivage aux SAMB lavés pour créer une solution de stock SAMB. Si vous utilisez des tubes de microcentrifugeuse à faible liaison protéique de deux millilitres, le volume du tampon de clivage appliqué peut aller jusqu’à 1,9 millilitres.

Après l’ajout du tampon, ne secouez pas ou ne retournez pas le tube à l’envers. Fermez le tube et retirez-le du concentrateur. Préparez des tubes de microcentrifugeuse à faible liaison protéique de deux millilitres pour les échantillons d’analyse.

Suspendre la solution de stock SAMB jusqu’à ce qu’elle soit complètement homogène et mesurer la quantité de substrat à analyser dans les réactions en transférant immédiatement la solution de stock SAMB dans les flacons d’échantillon. Le volume de la solution de stock SAMB à transférer est recommandé d’être de 25 à 300 microlitres, mais il doit être fixé selon la conception expérimentale individuelle. Placez les tubes d’échantillon contenant les suspensions SAMB aliquoted dans le concentrateur.

Retirez soigneusement le surnatant des SAMBs et jetez-le. Retirez les tubes du concentrateur et ajoutez soigneusement le tampon de réaction aux SAMBs. Le volume du tampon de réaction supplémentaire doit être calculé en fonction de la conception expérimentale individuelle, mais il est recommandé de définir le volume final du mélange de réaction entre 50 et 150 microlitres si des tubes de deux millilitres sont utilisés.

Fermer les couvercles des tubes. Maintenant, les échantillons sont prêts à être paramé paramésiés. Ajouter la solution enzymatique aux échantillons de réaction.

Remuer soigneusement les perles en déplaçant doucement les tubes et placer les tubes immédiatement dans le thermoshaker déjà en secousses. Dans le cas d’échantillons vierges de substrat et d’échantillons de contrôle du substrat, ajoutez respectivement un tampon de clivage et un tampon d’élitution. Trente secondes avant la fin de l’incubation, sortez l’échantillon du thermoshaker et faites-le tourner rapidement.

Placez le tube sur le concentrateur et laissez reposer le tube pendant 15 secondes. La collecte des SAMBs peut être facilitée en déplaçant légèrement le concentrateur d’avant en arrière. Ouvrez le couvercle et transférez soigneusement le surnatant dans une assiette ou un nouveau tube.

Ne touchez pas les perles concentrées par la pointe de la pipette. Le supernatant recueilli des échantillons de contrôle du substrat et les échantillons de réaction avec un degré élevé de clivage peuvent montrer une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un transilluminateur bleu Dark Reader. Transférer deux fois 30 microlitres des supernatants d’échantillon séparés dans une microplaque noire de demi-surface.

Mesurer la fluorescence par fluorure à l’aide des filtres appropriés en fonction de la protéine fluorescente appliquée. Pour la purification des substrats fluorescents, préparez la même solution que décrite précédemment et jetez le surnatant. Ajouter 400 à 600 microlitres tampon d’élitution aux SAMBs et faire pivoter les tubes par rotateur lentement à température ambiante pendant cinq minutes.

Transférer l’élitate dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse à faible liaison protéique. Il montre une fluorescence clairement visible avec ou sans l’aide d’un transilluminateur bleu Dark Reader. Après purification, échange tampon et mesure de la teneur en protéines, préparez une double dilution en série en au moins huit étapes, à la fois à partir des solutions de substrat résolus par l’elution-buffer et le tampon de clivage, en utilisant respectivement l’élitution ou le tampon de clivage pour la dilution.

Transférer 30 microlitres de chaque point de dilution dans une microplaque noire de demi-surface. Mesurer la fluorescence par fluorure en utilisant les mêmes paramètres qui ont été appliqués dans la mesure des surnatants de l’échantillon d’analyse. À titre d’exemple pour le traitement des données, les mesures cinétiques dépendantes du substrat de la protéase VIH-1 ont été effectuées sur une forme fusionnée mTurquoise2 du substrat recombinant codant le site de clivage entre la matrice et les protéines capsides dans le précurseur naturel des protéines gapiques.

Tracez les valeurs d’intensité de fluorescence relative corrigées par rapport à la concentration molaire des substrats purifiés, résolvez le clivage ou le tampon d’élitution et effectuez une régression linéaire. Calculer la concentration molaire des produits de clivage du terminal C dans les échantillons de réaction à l’aide de la pente de la courbe d’étalonnage à base de tampon de clivage. Calculez également la concentration de substrat appliquée dans les échantillons de réaction en fonction de la concentration molaire du substrat élulisé dans les échantillons de contrôle du substrat à l’aide de la pente de la courbe d’étalonnage à base d’élitution-tampon.

Les valeurs initiales de vitesse ont été calculées à partir de la quantité des fragments de clivage du terminal C, puis tracées par rapport à la concentration appliquée du substrat. Des paramètres cinétiques ont également été déterminés par l’analyse de régression non linéaire de Michaelis-Menten. Après avoir effectué l’analyse à base de perles magnétiques nickel-NTA, les surnatants d’essai peuvent également être analysés par électrophoresis de gel de polyacrylamide.

Cependant, en plus de l’analyse des échantillons d’analyse, il est également possible d’analyser les substrats fluorescents purifiés et/ou les fragments de clivage après digestion en solution. Pour la digestion en solution, aliquote les substrats fluorescents purifiés à digérer dissous dans le tampon de clivage en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, et ajouter la solution enzymatique aux échantillons. Incuber les échantillons selon la conception expérimentale et mettre fin aux réactions par la procédure de préparation de l’échantillon pour PAGE.

Pour la préparation de l’échantillon non dénaturé, mélanger les échantillons à analyser avec un tampon de chargement d’échantillons non dénaturant ne contenant aucun agent réducteur. Dans le cas de la préparation dénaturée de l’échantillon, mélanger les échantillons à analyser avec le tampon de chargement de l’échantillon dénaturant et exposer les échantillons au traitement thermique à 95 degrés pendant 10 minutes. Appliquer les échantillons non dénaturés et dénaturés dans les puits du gel SDS-polyacrylamide et effectuer l’électrophoresis.

Retirez la cassette gel du module en cours d’exécution. Des échantillons non dénaturés sont déjà visibles dans le gel même à l’œil nu ou avec le transilluminateur bleu Dark Reader. Afin de détecter les composants fluorescents des échantillons dénaturés sur le transilluminateur, effectuer la renaturation dans le gel en lavant le SDS à partir du gel.

Ajouter 100 millilitres d’eau distillée au gel et rincer au moins pendant 30 minutes. Visualisez les protéines fluorescentes en plaçant le gel non taché sur le transilluminateur bleu Dark Reader. Les protéines de fusion fluorescente recombinantes ont été conçues pour être utilisées comme substrats dans les analyses protéolytiques.

Lors du clivage par la protéase au site de clivage spécifique, le fragment de clivage fluorescent du terminal C est libéré et sa fluorescence peut être détectée. Leur utilisation dans l’analyse à base de perles magnétiques nickel-NTA et la détection fluorescente par l’analyse PAGE ont été optimisées à l’aide de la protéase VIH-1. Cependant, la plate-forme d’essai développée peut être appropriée à d’autres protéases aussi bien.

Les courbes d’étalonnage des substrats purifiés résolus dans le tampon de clivage ou d’élitution sont illustrées sur les exemples de la forme fusionnée mTurquoise2 et mEYFP du substrat recombinant codant le côté clivage entre la matrice et les protéines capsidiques de la protéine anechoïque naturelle du VIH. L’analyse à base de perles magnétiques nickel-NTA est un outil utile pour examiner l’effet de la concentration du substrat sur la vitesse de réaction et rend ainsi possible la détermination des paramètres cinétiques enzymatiques tels que Vmax et Km. Le diagramme A montre un résultat optimal obtenu après une analyse réussie de l’activité substrat-dépendante sur un substrat mApple-fusionné.

En revanche, le diagramme B présente un résultat sous-optimal où l’homogénéisation insuffisante de la solution de stock SAMB cause des problèmes dans la mise en place des concentrations de substrat appropriées tandis que l’arrêt inadéquat des échantillons de réaction entraîne des erreurs relativement élevées. L’essai fournit également un outil approprié pour exécuter des études de temps-cours et inhibitrices aussi bien. Le diagramme A démontre la dépendance au temps du clivage protéolytique de la protéase HIV-1 sur un substrat fusionné par mEYFP, tandis que le diagramme B représente l’effet inhibiteur de l’amprévir sur la réaction de clivage.

À partir des données obtenues par l’étude inhibitrice, la concentration active d’enzymes et la constante inhibitrice peuvent être déterminées. L’essai peut également être optimisé pour étudier la dépendance de l’activité enzymatique sur le pH, car il est représenté par le diagramme A sur l’exemple de la protéase du virus de l’etch du tabac. Le diagramme B indique une limitation de l’analyse par pH et montre que le pH neutre ou légèrement alcalin est entièrement compatible avec les mesures, tandis que le pH acide facilite la dissociation spontanée des substrats de la surface des perles magnétiques.

La figure actuelle montre les substrats fluorescents intacts purifiés, les fragments fluorescents de clivage du terminal C, générés par la digestion in-solution par la protéase VIH-1. Les composants fluorescents peuvent être détectés dans le gel de polyacrylamide contenant du SDD par transillumination de lumière bleue juste après l’électrophorèse si des conditions non dénaturantes ont été appliquées pendant la préparation de l’échantillon. Les différentes protéines fluorescentes peuvent être différenciées en fonction de leur couleur.

Après l’analyse à base de perles magnétiques, les protéines fluorescentes non dénaturées dans les supernatants de l’échantillon peuvent également être détectées dans le gel par illumination UV. En revanche, si des conditions de dénaturation sont appliquées pendant la préparation de l’échantillon, les protéines dénaturées ne peuvent pas être détectées dans le gel immédiatement après la PAGE SDS. Cependant, les protéines fluorescentes dénaturées peuvent être partiellement renaturées par l’élimination du SDS du gel et devenir détectables.

Par conséquent, la PAGE SDS est suivie de la procédure de renaturation en gel. La capacité de renaturation des protéines fluorescentes permet leur identification non seulement en fonction de leur fluorescence, mais aussi en fonction de leur poids moléculaire. Ici, nous avons démontré le protocole pour l’utilisation de notre plate-forme d’analyse fluorescente à base de perles magnétiques récemment développée.

Nous avons démontré l’utilisation de ce système sur l’exemple d’études cinétiques enzymatiques sur la protéase VIH-1. Nous avons utilisé des formes fusionnées mTurquoise et mApple du substrat d’essai recombinant, qui contenait la séquence du site de clivage de la protéase. Outre l’analyse fluorimétrique, les échantillons d’analyse ont ensuite été analysés par SDS PAGE ainsi.

Nous avons démontré que les protéines fluorescentes dénaturées peuvent être partiellement renaturées dans le gel après SDS PAGE qui fournit à la fois l’identification fluorescente et moléculaire basée sur le poids du substrat et les fragments protéolytiques.