Наш метод помогает изучить кинетику формирования белкового комплекса. В нем описывается, насколько плотным является белковый комплекс, и если образованию белкового комплекса мешают другие белки. Этот метод позволяет изучать белково-белковое взаимодействие в количественном выражении, используя флуоресценцию в качестве репортера, наш анализ может контролировать ассоциацию и диссоциацию белкового комплекса в режиме реального времени.
Для начала спроектировать анализ FRET, начиная с данных для комплекса COL1 CAND1 из базы данных белков. Загрузите структуру в PyMOL, а затем перейдите в меню мастера и используйте функцию измерения для оценки расстояния между первой аминокислотой CAND1 и последней аминокислотой COL1. Затем загрузите онлайн-зрителя спектра и просматривать возбуждение и выброс спектры 7-амино-4-метилкумарин и FlASH одновременно.
AMC является донором FRET, а FlASH является принимаеттелем FRET. Подготовка клеток с донорским белком FRET, следуя вместе в сопроводительном текстовом протоколе. Затем очистите комплекс сортазы COL1 RBX1, сначала добавив 50 миллилитров буфера лиза в гранулы клеток E.Coli, выражаюющих комплекс сортазы COL1 RBX1.
Лед клеток на льду с sonication на 50%амплитуды. Чередуйте питание в течение трех минут, чтобы он был на одну секунду, а затем одну секунду, чтобы предотвратить перегрев образца. Перенесите полученный лисат клетки в 50-миллилитровую центрифугирующую трубку и удалите клеточный мусор путем центрифугации при 25 000 раз г в течение 45 минут.
Затем добавьте супернатант в пять миллилитров глутатиона и инкубировать их при четырех градусах по Цельсию, чтобы очистить клетку лизатом. После инкубации центрифуга бисерной лисной смеси при 1500 раз г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите супернатант.
Затем вымойте бусинки 5 миллилитров буфера лиза, не имеющих ингибитора протеазы. После центрифугирования раствора удалите супернатант. Теперь добавьте три миллилитров буфера лиза в вымытые бусы и перенесите суспензию из бисера в пустую колонку.
К новому столбецу также добавьте пять миллилитров буфера elution, а затем инкубировать столбец в течение 10 минут и соберите элуат. Затем добавьте 200 микролитров тромбина по пять миллиграммов на миллилитр в элуат из глутатиона. После ночной инкубации при четырех градусах цельсия разбавляют образец белка в три раза буфером A.Load образец белка в буфер равновесный катионный столб обмена хроматографии в нулевой точке пять миллилитров в минуту.
Затем добавьте градиент от нуля до 50% буфера B в буферЕ А, чтобы утоить белок со скоростью потока 1 миллилитр в минуту. Затем объединить элуатные фракции, содержащие донорский белок FRET, и сконцентрировать его до двух точки пять миллилитров с помощью ультрафильтрационной мембраны с 30 килодальтон отсечения. Теперь добавьте 7-амино-4-метилкумарин в c-терминус COL1 через сортированную опосредованную транспептидуцию, сначала изменив буфер в образце донорского белка FRET в буфер сорта с помощью демаркации колонки.
Для этого сначала обвясть десалирование столбца с 25 миллилитров буфера сортировки. Затем загрузите две точки пять миллилитров раствора белка донора FRET в столбец и отбросьте поток через. Далее, elute образец с тремя точками пять миллилитров буфера сортировки и собирать поток через.
В 900 микролитров элуата добавьте 100 микролитров 600 микромоляров очищенного раствора сорта А и 10 микролитров пептида 25 миллимолярной GGGG-AMC. Инкубировать реакционной смеси при 30 градусах по Цельсию в темное время суток для создания COL1-AMC-RBX1. Теперь загрузите весь образец на столбец хроматографии исключения размера и уроните его одной точкой, в пять раз больше объема буфера столбца.
В конце концов, объединить eluate фракций, содержащих COL1-AMC-RBX1. Следуйте вместе в текстовом протоколе, чтобы подготовить белок-приемник FRET. Многие из этих шагов аналогичны препарату белка донора FRET.
После завершения подготовки решения FlASH CAND1. Во-первых, добавьте один микролитр раствора FlASH в 50 микролитров свежеприготовленного раствора tetra-cys-CAND1. Смешайте комбинированные растворы хорошо и инкубировать смесь при комнатной температуре в темноте в течение одного-двух часов, чтобы сформировать раствор FlASH CAND1.
В 300 микролитров буфера FRET добавьте COL1-AMC-RBX1 в окончательную концентрацию 70 наномоляров и перенесите раствор в кюветт. Поместите кювет в образец держателя фторометра. Возбуждайте образец 350 нанометровый свет возбуждения и сканируйте сигналы излучения от 400 до 600 нанометров с шагом в один нанометр.
Затем, в 300 микролитров буфера FRET, добавьте COL1-AMC-RBX1 и FlASH-CAND1 к окончательной концентрации 70 наномоляров. Возбуждайте образец 350 нанометровый свет возбуждения и сканируйте сигналы излучения с 400-600 нанометров с шагом в один нанометр. Установите свет возбуждения на 350 нанометров и используйте фильтр пропуска полосы, который позволяет 450 нанометров излучения света пройти и блокирует от 500 до 650 нанометров излучения света.
С образцом клапанов в положении заполнения подключите трехми миллилитровый шприц, наполненный водой. Затем, мыть два образца шприцев с водой, перемещая образец шприца диск вверх и вниз несколько раз, отбрасывая воду, когда закончите. Затем соедините трехмилитрный шприц, наполненный буфером FRET.
Вымойте два образца шприцев с буфером FRET, перемещая образец шприца диск вверх и вниз несколько раз, отбрасывая воду, когда закончил. Теперь подключите трехмилитрный шприц и загрузите первый образец шприца, шприц А, со 100 наномолярными COL1-AMC-RBX1 в буфере FRET. Затем поверните образец клапана в положение привода Также, подключите трехми миллилитровый шприц к шприцу B и загрузите шприц B со 100 наномоляром FlASH CAND1 в буфере FRET и поверните его клапан в положение привода.
Откройте панель управления под приобрести в программном обеспечении и записывать выбросы COL1-AMC в течение 60 секунд. Затем сделай один выстрел. Fit снижение и флуоресцентные сигналы, измеренные с течением времени от каждого выстрела до одной экспоненциальной кривой.
Вымойте систему, как показано ранее, а затем добавить раствор из 100 наномолярных COL1-AMC-RBX1 и 100 наномолярных FlASH CAND1 в буфере FRET в шприц A.Connect его к системе, пока он находится в положении заполнения Нагрузка шприц, а затем превратить образец клапана в положение привода. Затем загрузите раствор Skp1-Skp2 в шприц B.Connect его к системе, пока он находится в положении заполнения. Загрузите шприц B, а затем поверните образец в положение привода.
В программном обеспечении, перейдите на приобретение и открыть панель управления. Настройка программы для записи выбросов COL1-AMC в течение 30 секунд. Тогда сделай один выстрел.
Сигналы флуоресценции увеличиваются с течением времени после смешивания растворов из шприца А и шприца B.When 70 наномолярных каждый из COL1-AMC и FlASH CAND1 были смешаны для генерации FRET, два пика выбросов присутствовали в спектрах выбросов. И пик COL1-AMC стал ниже, и пик FlASH CAND1 стал выше. Когда полная длина CAND1 была использована для FRET пик доноров показал 10%-ное снижение интенсивности.
Однако, когда CAND1 с его первой усеченной спирали был использован снижение пиковой интенсивности донора было увеличено до 30%, предполагая более высокую эффективность FRET Чтобы подтвердить, что изменения сигнала были результатом FRET между COL1-AMC и FlASH CAND1, донор FRET был смешан с избытком необнаменных CAND1 известный как Чейз в приемщике. В результате пик доноров был полностью восстановлен, а пик принятия был снижен. Здесь показан график среднего наблюдаемого значения K с концентрацией CAND1 после линейного регрессионного анализа.
Для измерения на постоянной основе комплекса, 50 наномолярных COL1-AMC был использован в серии наблюдаемых констант скорости диссоциации были измерены путем смешивания 50 наномолярных COL1-AMC с увеличением концентрации FlASH CAND1. Как и при измерении на постоянной, наблюдаемая диссоциация константы COL1 и CAND1 была обнаружена путем мониторинга восстановления донорского сигнала с течением времени на остановленном потоке флюорометра. Здесь сигнал донора быстро увеличился, и он показал наблюдаемое значение K нулевой точки четыре в секунду.
В отличие от этого, когда буфер был добавлен в предварительно собранный комплекс, не было отмечено увеличения сигнала, предполагая, что быстрая диссоциация COL1 CAND1 была вызвана Skp1 Skp2. Убедитесь в том, чтобы свести к минимуму количество света донора и принимает белка подвергаются воздействию. Старайтесь держать фторфоры в темноте как можно больше.
