Лечение изолированных островков поджелудочной железы и измерение апоптоза

В этом исследовании используются мультиокрашивающие флуоресцентные маркеры клеточной смерти и апоптоза в сочетании с конфокальной микроскопией для оценки цитокин-индуцированного апоптоза и β-специфической гибели клеток в островках поджелудочной железы. Он выявляет пространственные и временные изменения в гибели клеток и апоптозе в ответ на внеклеточные стимулы.

В этом исследовании изучается влияние провоспалительных цитокинов на островки поджелудочной железы, особенно на инсулин-продуцирующие β-клетки, с использованием комбинации методов флуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии для оценки жизнеспособности клеток, апоптоза и β-специфической гибели клеток. Изолированные островки мышей обрабатывали различными концентрациями цитокинового коктейля, включая TNF-α, IL-1β и ИФН-γ, для имитации иммуноопосредованного апоптоза во время развития сахарного диабета 1 типа. Жизнеспособность островковых клеток оценивали с помощью двойного окрашивания FDA/PI, где превращение FDA во флуоресцеин указывало на жизнеспособные клетки, а PI маркировало мембранные клетки. YOPRO-1 и ядерное окрашивание предоставили дополнительные данные об апоптозе, а Аннексин-V подтвердил ранний апоптотический состав клеток. Количественный анализ выявил значительное увеличение показателей апоптоза и гибели клеток в островках, обработанных цитокинами. Для специфической оценки воздействия на β-клетки использовали селективное окрашивание Zn²⁺ для мечения инсулин-продуцирующих клеток через цинковую ассоциацию в гранулах инсулина, что выявило значительную потерю β-клеток после обработки островков провоспалительными цитокинами в течение 24 ч. Эти протоколы множественного окрашивания эффективно фиксируют и количественно оценивают степень цитокин-индуцированного повреждения островков и могут быть использованы для оценки терапевтических средств, разработанных для предотвращения апоптоза β-клеток при раннем сахарном диабете 1 типа.

Островки поджелудочной железы, также известные как островки Лангерганса, представляют собой совокупность эндокринных клеток, расположенных в поджелудочной железе. Инсулин-продуцирующие β-клетки являются наиболее распространенным и функционально значимым компонентом островков поджелудочной железы. Эти β-клетки секретируют инсулин, гормон, который играет решающую роль в поддержании гомеостаза глюкозы^. При диабете 1 типа (СД1) иммунная система нацеливается на островки поджелудочной железы и проникает в них, разрушая инсулин-продуцирующие β-клетки. Эта аутоиммунная атака в первую очередь опосредована провоспалительными цитокинами, включая интерлейкин-1β (IL-1β), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) и интерферон-гамма (ИФН-γ⁾². Эти цитокины инициируют каскад сигнальных событий в β-клетках, которые в конечном итоге запускают апоптоз³. Апоптоз, запрограммированная гибель клеток, представляет собой строго регулируемый процесс, включающий активацию каспаз, фрагментацию ДНК и клеточную дезинтеграцию. Он способствует постепенной потере массы и функции β-клеток во время наступления СД1³.

Понимание молекулярных механизмов, которые управляют апоптозом β-клеток, имеет решающее значение для определения стратегий предотвращения или смягчения разрушения β-клеток при СД1. Для достижения этой цели изолированные островки поджелудочной железы из экспериментальных моделей или человеческих трупов служат надежной и хорошо зарекомендовавшей себя модельной системой для изучения β-клеточной патологии ^2,3. Обрабатывая эти изолированные островки провоспалительными цитокинами, исследователи могут воспроизвести среду, которая характеризует ранний СД1, что позволяет детально изучить дисфункцию и смерть β-клеток in vitro ^4,5. Эти эксперименты дают ключевое представление об уязвимости и выживаемости β-клеток в условиях, связанных с заболеванием, а также служат платформой для тестирования терапевтических вмешательств, направленных на защиту или спасение β-клеток от апоптоза, вызванного цитокинами. Используя эту систему in vitro, мы можем эффективно анализировать, как островки разных видов реагируют на различные условия, обеспечивая лучшее понимание функциональных и апоптотических вариаций у разных видов.

Предыдущие исследования показали, что мышиные и человеческие островки, обработанные в течение 24 ч коктейлем (1x = 10 нг/мл TNF-α, 5 нг/мл IL-1β и 100 нг/мл ИФН-γ) мышиных и человеческих цитокинов, соответственно, приводили к значительной гибели островковых клеток ^4,5,6. Жизнеспособность островков была подтверждена окрашиванием обработанных цитокинами клеток флуоресцеина диацетатом (FDA) и йодидом пропидия (PI)^5,6. Во всем мире жизнеспособность островков оценивается с использованием стандартного метода исключения красителей, связывающих дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), с FDA и PI⁷. Флуоресцентные красители или субстраты, сопряженные с красителем, оценивают жизнеспособность клеток на основе целостности и проницаемости мембраны. FDA, проникающий в клетки краситель, преобразуется живыми клетками в зеленую флуоресценцию (флуоресцеин). Напротив, PI, непроницаемый для клеток краситель, окрашивает только ядра мертвых клеток с поврежденными^{мембранами.} Затем клетки анализируются с помощью двухцветной визуализации на конфокальном микроскопе, где зелеными и красными флуоресцентными изображениями отмечаются жизнеспособные и мертвые клетки соответственно.

Ограничением протокола окрашивания FDA/PI является то, что PI проникает только в клетки, которые потеряли мембранную селективность, что означает, что он не может различить ранние апоптотические клетки. Кроме того, этот метод не позволяет дифференцировать подмножества клеток, что делает его непригодным для селективной оценки жизнеспособности β-клеток. Протокол Annexin V/PI обычно используется для изучения апоптотических клеток, и протокол был модифицирован для повышения его^{точности8}. Ранние стадии апоптоза включают транслокацию фосфатидилсерина из внутреннего слоя плазматической мембраны во внешний. Аннексин V, кальций-зависимый белок, связывается с высоким сродством к этому подвергнутому воздействию фосфатидилсерину. Окрашивание ПИ проводится вместе с аннексином-V для отличия апоптотических клеток (только аннексин V-положительный) от некротических клеток (положительных как на аннексин-V, так и на ПИ), поскольку некротические клетки также проявляют фосфатидилсерин из-за нарушенной целостности мембраны⁹. Другие красители, такие как YOPRO-1, также используются для количественной оценки апоптоза островковых клеток. Клеточная мембрана жизнеспособных клеток непроницаема для YOPRO-1, в отличие от аннексина-V, который не может количественно определить живые клетки, подвергающиеся апоптозу.

Для оценки гибели β-клеток поджелудочной железы необходимы специфические красители, нацеленные только на инсулин-продуцирующие клетки. Отличительной особенностью β-клеток поджелудочной железы является то, что часть внутриклеточного Zn²⁺ хранится в везикулах в виде комплекса Zn²⁺-инсулина (соотношение 2:1)¹⁰. Свободный Zn²⁺ также существует во внезернистом пространстве вокруг β-ячеек в качестве резервуаров. Свободные Zn²⁺ и Zn²⁺, слабо связанные с инсулином в секреторных гранулах, могут быть визуализированы с помощью цинк-связывающих красителей. Дитизон, цинк-связывающий краситель, обычно используется для оценки чистоты островковых клеток, но его нельзя сочетать с флуоресцентными красителями, используемыми для оценки жизнеспособности^{и функции} β-клеток. УФ-зонды, такие как TSQ и Zinquin, обладающие высокой селективностью по отношению к Zn²⁺, были разработаны для количественного определения β-клеток путем визуализации и измерения свободного внутриклеточного Zn^{2+; 12,13}. Однако их использование ограничено плохой растворимостью, неравномерной нагрузкой на клетки, потребностью в возбуждении ультрафиолетом и компартментализацией в кислые везикулы¹⁴. Флуоресцентные зонды видимой длины волны, такие как Newport green и селективный индикатор Zn²⁺, также были разработаны для преодоления этих ограничений и в настоящее время широко используются для обнаружения β-клеток в изолированных островках человека^15,16. Флуозин-3 (селективный индикатор Zn²⁺) имеет более высокое сродство Zn²⁺ и превосходный квантовый выход, чем Newport Green, и доказал свою эффективность для визуализации Zn²⁺ совместно с инсулином в изолированных островках^14,17.

Использование флуоресцентных красителей, таких как FDA, PI, аннексин V, YOPRO-1 и селективный индикатор Zn²⁺ , позволяет измерять и дифференцировать жизнеспособные, апоптотические и полные мертвые клетки. Сочетание совместимых и высокоселективных зондов также предлагает целевой метод оценки и количественной оценки жизнеспособности β-клеток и апоптоза, что имеет решающее значение для понимания и смягчения разрушения β-клеток в исследованиях диабета и разработке лекарств.

Все эксперименты на мышах были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо в Денвере (Протоколы 000929). Мыши C57Bl/6, использованные для этого эксперимента, были приобретены в лаборатории Джексона и помещены в помещение с контролируемой температурой в 12-часовом цикле свет/темнота с доступом к пище и воде в неограниченном количестве. Выделенные мышиные островки были получены с использованием протокола расщепления коллагеназы, который был описан ранее ^5,18.

1. Приготовление растворов и питательных сред

Примечание: Питательные среды, запасы цитокинов и другие реагенты должны быть приготовлены в стерильных условиях.

1. Готовят островковую питательную среду путем добавления 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 000 мкг/мл стрептомицина к 500 мл среды 1640 RPMI.
2. Приготовьте 1x фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), pH 7,4. Приготовьте 1000-кратный стоковый раствор коктейля цитокинов мыши, 10 мкг/мл TNF-α 10 мкг/мл, 5 мкг/мл IL-1β и 100 мкг/мл ИФН-γ в стерильном PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и храните раствор в 10 мкл аликвот при -20 °C.
3. Приготовьте стоковый раствор FDA в концентрации 46 мкМ (50x) в ацетоне и храните его в 1 мл аликвот при -20°C. Приготовьте 1,434 мМ (50x) стокового раствора PI в PBS и храните его в 1 мл аликвот при 4 °C.
4. Приготовьте 500 мл бикарбонат-модифицированного буфера Krebs-Henseleit HEPES (BMHH) с 125 мМ NaCl, 5,7 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl₂, 1,2 мМ MgCl₂ и 10 мМ HEPES в 500 мл_dH2O. Отрегулируйте pH до 7,4.
5. Приготовьте 100 мл связывающего буфера Аннексин-V с 10 мМ HEPES, 140 мМ NaCl и 2,5 мМ CaCl₂ в 100 мл dH₂O. Отрегулируйте pH до 7,4.
6. Приготовьте 1mM Zn²⁺ селективный индикаторный раствор в ДМСО и храните в 10 мкл аликвот при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные красители светочувствительны, поэтому хранение и инкубация должны проводиться в темноте.

2. Лечение изолированных островков цитокинами

1. Выделите островки мышей с помощью микропипетки объемом 10 мкл в питательную среду и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5%_CO2 для восстановления после изоляционного стресса перед обработкой цитокинами.
2. Добавьте 2 мл стерилизованной среды для островковых культур в чашки Петри диаметром 35 мм, не обработанные тканевой культурой, и промаркируйте их соответствующим образом, чтобы дифференцировать обработанные цитокинами и необработанные чашки без цитокинов.
3. Для посуды, обработанной цитокинами, удалите 6 мкл питательной среды и замените ее 2 мкл каждого цитокина из исходного раствора, чтобы получить конечную относительную концентрацию цитокинов 10 нг/мл, 5 нг/мл IL-1β и 100 нг/мл ИФН-γ (1x RCC).
   Примечание: Более низкие ПКР 0,5x и 0,1x могут быть получены путем разбавления исходных растворов стерильным PBS, содержащим 0,1% BSA в соотношении 1:1 и 1:9 соответственно.
4. Через 12-24 ч после изоляции соберите 10-20 островков с помощью микропипетки под световым микроскопом, переложите их в чашки и инкубируйте во влажном инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от конкретных целей эксперимента.

3. Измерение жизнеспособности островков с помощью FDA/PI

1. Добавьте по 20 мкл исходных растворов FDA и PI к 960 мкл буфера BMHH, содержащего 0,1% БСА, чтобы получить конечную концентрацию 0,46 мкМ и 14,34 мкМ флуоресцентных красителей соответственно.
2. Аликвоту 100 мкл красящего раствора в чашку Петри со стеклянным дном толщиной 7 мм, не обработанную тканевой культурой.
3. Через 24 ч после инкубации с цитокинами осторожно перенесите не менее 6 островков из каждой обработки в чашку Петри со стеклянным дном. Выдерживать 5 - 10 мин при комнатной температуре в темноте (накрыть пленкой).
4. Получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии с 40-кратным объективом погружения в воду. Сделайте снимки в течение 15 минут после окрашивания FDA/PI.
5. Используйте возбуждающие лазеры на длинах волн 488 нм и 514 нм для детектирования флуоресцентного излучения для FDA (520 нм) и PI (620 нм) соответственно.
6. Островки изображений в виде z-стека, состоящего из трех изображений, удаленных друг от друга на 10 мкм. Визуализируйте только дно 1/3 - 1/2 островка, чтобы уменьшить потерю сигнала из-за проблем с рассеянием света на островке.
7. Подсчитайте живые зеленые (FDA-положительные) и мертвые красные (PI-положительные) клетки вручную в ImageJ (NIH) для не менее 5 островков на мышь (n = 3). Рассчитайте процент гибели клеток следующим образом:
   Процент гибели островков = Количество мертвых клеток/ (Количество мертвых клеток + Количество живых клеток) x 100%

4. Измерение апоптоза с помощью окрашивания

1. Добавьте 8 μL YOPRO-1 (1 мМ раствор) к 992 μL буфера для визуализации BMHH для получения конечной концентрации 0,8 μM.
2. Добавьте 500 мкл окрашивающего раствора в чашку Петри диаметром 14 мм со стеклянным дном, не обработанную тканевой культурой.
3. Через 24 ч после инкубации с цитокинами осторожно перенесите не менее 6 островков после каждой обработки в чашку Петри со стеклянным дном и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C в темноте (накройте пленкой).
4. После 20 минут инкубации добавьте каплю NucBlue (ядерный краситель, 20 мкл) в каждую чашку Петри со стеклянным дном и продолжайте инкубацию. Общее время инкубации составляет 1 ч для YOPRO-1 и 40 мин для ядерного окрашивания.
5. Через 1 ч инкубации перенесите островки в свежий буфер для визуализации BMHH, содержащий 0,1% BSA (100 μл) в чашке Петри со стеклянным дном диаметром 7 мм, не обработанной тканевой культурой.
6. Получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии с 40-кратным объективом погружения в воду. Используйте возбуждающие лазеры на длинах волн 405 нм и 488 нм для детектирования флуоресцентного излучения ядерного пятна (460 нм) и YOPRO-1 (509 нм) соответственно.
7. Островки изображений в виде z-стека, состоящего из трех изображений, удаленных друг от друга на 10 мкм. Визуализируйте только дно 1/3 - 1/2 островка, чтобы уменьшить потерю сигнала из-за проблем с рассеянием света на островке.
8. Подсчитайте живые синие (ядерно-пятящие) и апоптотические зеленые (YOPRO-1-положительные) клетки вручную в ImageJ (NIH) для не менее 5 островков на мышь (n = 3). Рассчитайте процентное содержание островковых клеток апоптоза следующим образом:
   Процент апоптотических островковых клеток = Количество апоптотических клеток / (Количество апоптотических клеток + Количество живых клеток) x 100%

5. Измерение апоптоза с помощью Аннексина V / ядерного окрашивания

1. Добавьте 2 капли ядерного красителя (40 μл) в 1 мл буфера для связывания аннексина. Внесите 100 мкл раствора в чашку Петри со стеклянным дном толщиной 7 мм, не обработанную тканевой культурой.
2. Через 24 ч после инкубации с цитокинами тщательно промыть пипетированием вверх и вниз 3 раза по меньшей мере 6 островков от каждой обработки в PBS путем трижды пипетирования вверх и вниз с помощью микропипетки объемом 10 мкл. Переложите островки в чашку Петри со стеклянным дном с раствором ядерного красителя и выдержите их в течение 40 минут при температуре 37 °C в темноте (накройте пленкой).
3. После 25 минут инкубации добавьте 5 μL конъюгата Annexin V Alexa Flour 488 в каждую чашку Петри со стеклянным дном и продолжайте инкубацию. Общее время инкубации составляет 40 мин для ядерного пятна и 15 мин для Аннексина V.
4. Через 40 минут инкубации перенесите островки в свежий буфер для визуализации BMHH (без аннексина V или ядерного окрашивания) в чашке Петри со стеклянным дном диаметром 7 мм.
5. Получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии с 40-кратным объективом погружения в воду. Используйте возбуждающие лазеры на длинах волн 405 нм и 488 нм для детектирования флуоресцентного излучения ядерного окрашивания (460 нм) и конъюгата аннексина V (515 нм) соответственно.
6. Островки изображений в виде z-стека, состоящего из трех изображений, удаленных друг от друга на 10 мкм. Визуализируйте только дно 1/3 - 1/2 островка, чтобы уменьшить потерю сигнала из-за проблем с рассеянием света на островке.
7. Подсчитайте живые синие (ядерно-позитивные) и апоптотические зеленые (аннексин V-положительные) клетки вручную в ImageJ (NIH) для не менее 5 островков на мышь (n = 3). Рассчитайте процентное содержание островковых клеток апоптоза следующим образом:
   Процент апоптотических клеток = Количество апоптотических клеток / (Количество апоптотических клеток + Количество живых клеток) x 100%

6. Измерение гибели β-клеток с помощью селективного индикатора Zn²⁺ / ядерного окрашивания / PI

1. Добавьте 2 мкл стокового раствора Zn²⁺ селективного индикатора AM к 998 мкл буфера для визуализации BMHH, чтобы получить конечную концентрацию 0,2 мкм. Аликвота 500 мкл окрашивающего раствора в чашку Петри со стеклянным дном без обработки тканевой культурой размером 14 мм.
2. Через 24 ч после инкубации с цитокинами осторожно перенесите не менее 6 островков из каждой обработки в чашку Петри со стеклянным дном. Выдерживать в течение 1 ч при температуре 37 °C в темноте с помощью раствора селективного индикатора Zn²⁺ AM (накрыть пленкой).
3. После 20 минут инкубации добавьте каплю ядерного красителя (20 мкл) в каждую чашку Петри со стеклянным дном в соответствии с инструкциями производителя и продолжайте инкубацию. Общее время инкубации составляет 1 ч для селективного индикатора Zn²⁺ и 40 мин для ядерного окрашивания.
4. Через 1 ч инкубации перенесите островки в свежий буфер для визуализации BMHH, содержащий 0,1% BSA (100 μл) в чашке Петри со стеклянным дном диаметром 7 мм, не обработанной тканевой культурой. Добавьте 2 мкл стокового раствора PI на 10 мин до получения конечной концентрации 20 мкг/мл.
5. Сделайте снимки в течение 15 минут после окрашивания ПИ с помощью флуоресцентной микроскопии с 40-кратным объективом погружения в воду. С помощью возбуждающих лазеров на длинах волн 405 нм, 488 нм и 514 нм можно обнаружить флуоресцентное излучение ядерного окрашивания (460 нм), селективного индикатора Zn²⁺ (516 нм) и PI (620 нм) соответственно.
6. Островки изображений в виде z-стека, состоящего из трех изображений, удаленных друг от друга на 10 мкм. Визуализируйте только дно 1/3 - 1/2 островка, чтобы уменьшить потерю сигнала из-за проблем с рассеянием света на островке.
7. Подсчитайте живые синие (ядерно-пятенные), цинковые зеленые (Zn²⁺ селективные индикатор-положительные) и мертвенно-красные (PI-положительные) клетки вручную в ImageJ (NIH) для не менее 5 островков на мышь (n = 3). Рассчитайте процент гибели β-клеток следующим образом:
   процент гибели β-клеток = количество цинк-положительных и PI-положительных клеток / (количество погибших + живых островковых клеток) x 100%
   или
   процент гибели β-клеток = количество цинк-положительных и PI-положительных клеток / (количество цинк-положительных клеток) x 100%

Двойное окрашивание FDA и PI использовали для оценки жизнеспособности островков, обработанных цитокинами. Все эксперименты проводились в трех экземплярах (n = 3), и данные были получены из нескольких изображений z-стека на расстоянии 10 мкм друг от друга, причем каждая репл...

Данное исследование демонстрирует эффективность методов множественного окрашивания флуоресцентными красителями и конфокальной микроскопии в оценке жизнеспособности островковых клеток, апоптоза и выживаемости β-клеток в условиях цитокин-индуцированного стресса....

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Средства на эту работу были предоставлены следующими грантами: NIDDK award R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B для N.L.F. и ADA 7-20-JDF-020 для N.L.F. Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку со стороны Исследовательского центра диабета при Университете Колорадо Anschutz Campus P30-DK116073 и связанных с ним основных объектов, используемых для поддержки этой работы.