Isolated Pancreatic Islet Treatment 및 Apoptosis 측정

이 연구는 췌장섬에서 사이토카인 유도 세포사멸 및 세포 특이적 사멸을 평가하기 위해 컨포칼 현미경과 결합된 세포 사멸 및 세포자멸사에 대한 다중 염색 형광 기반 마커β 활용합니다. 그것은 세포 외 자극에 대한 반응으로 세포 사멸과 세포 사멸의 공간적, 시간적 변화를 보여줍니다.

이 연구는 세포 생존력, 세포사멸 및 β세포 특이적 사멸을 평가하기 위해 형광 염색 기술과 컨포칼 현미경의 조합을 사용하여 췌장섬, 특히 인슐린 생성 β세포에 대한 전염증성 사이토카인의 효과를 조사합니다. 고립된 마우스 섬은 제1형 당뇨병 발병 중 면역 매개 세포사멸을 모방하기 위해 TNF-α, IL-1β 및 IFN-γ를 포함한 다양한 농도의 사이토카인 칵테일로 처리되었습니다. 섬 세포의 생존력은 FDA/PI 이중 염색으로 평가되었으며, FDA에서 플루오레세인으로 전환하면 생존 가능한 세포가 표시되고 PI가 표시된 막 손상 세포가 표시되었습니다. YOPRO-1 및 핵 염색은 세포사멸에 대한 추가 데이터를 제공했으며, Annexin-V는 초기 세포사멸 세포를 확인했습니다. 정량적 분석은 사이토카인 처리된 섬에서 세포사멸과 세포 사멸률이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. β세포에 대한 효과를 구체적으로 평가하기 위해 Zn²⁺ 선택적 지표 염색을 사용하여 인슐린 과립의 아연 결합을 통해 인슐린 생성 세포를 라벨링하여 24시간 동안 전염증성 사이토카인으로 섬을 처리한 후 상당한 β세포 손실을 밝혔습니다. 이러한 다중 염색 프로토콜은 섬에서 사이토카인으로 인한 손상 정도를 효과적으로 포착하고 정량화하며 초기 제1형 당뇨병에서 β세포 자멸사를 예방하도록 설계된 치료법을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

랑게르한스 섬(islets of Langerhans)으로도 알려진 췌장 섬은 췌장 내에 위치한 내분비 세포의 집합체입니다. 인슐린을 생산하는 β세포는 췌장도에서 가장 풍부하고 기능적으로 중요한 구성 요소입니다. 이 β세포는 포도당 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 호르몬인 인슐린을 분비합니다¹. 제1형 당뇨병(T1D)에서 면역 체계는 췌장도를 표적으로 삼고 침투하여 인슐린을 생산하는 β세포를 파괴합니다. 이 자가면역 공격은 주로 인터루킨-1β(IL-1β), 종양괴사인자-알파(TNF-α) 및 인터페론-감마(IFN-γ)²를 포함한 전염증성 사이토카인에 의해 매개됩니다. 이러한 사이토카인은 β세포 내에서 연속적인 신호 전달 이벤트를 시작하여 궁극적으로 세포사멸³을 유발합니다. 프로그램된 세포 사멸인 세포사멸(Apoptosis)은 카스파제(caspase)의 활성화, DNA 단편화, 세포 붕괴를 포함하는 엄격하게 조절되는 과정입니다. 이는 T1D³ 발병 기간 동안 β세포 질량 및 기능의 점진적인 손실에 기여합니다.

β세포 사멸을 유도하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 T1D에서 β세포 파괴를 예방하거나 완화하기 위한 전략을 식별하는 데 중요합니다. 이를 달성하기 위해 실험 모델 또는 인간 시체에서 분리된 췌장도는 β세포 병리학 ^2,3을 연구하기 위한 견고하고 잘 정립된 모델 시스템 역할을 합니다. 이러한 고립된 섬을 전염증성 사이토카인으로 처리함으로써 연구자들은 초기 T1D를 특징짓는 환경을 복제할 수 있으므로 β세포 기능 장애 및 체외^사멸에 대한 자세한 연구를 수행할 수 있습니다 ^4,5. 이러한 실험은 질병 관련 조건에서 β세포의 취약성과 생존에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 사이토카인 유도 세포사멸로부터 β세포를 보호하거나 구출하기 위한 치료 개입을 테스트하기 위한 플랫폼 역할도 합니다. 이를 in vitro 시스템을 활용함으로써 서로 다른 종의 섬이 다양한 조건에 어떻게 반응하는지 효과적으로 분석할 수 있으며, 종 간의 기능적 및 자가사멸적 변이를 더 잘 이해할 수 있습니다.

이전 연구에서는 마우스와 인간 유래 사이토카인을 각각 칵테일(1x = 10ng/mL TNF-α, 5ng/mL IL-1β 및 100ng/mL IFN-γ)로 24시간 동안 처리한 마우스 및 인간 섬은 섬 세포의 상당한 사멸을 초래하는 것으로 나타났습니다 ^4,5,6. 사이토카인 처리된 세포를 플루오레세인 디아세테이트(FDA)와 프로피듐 요오드화물(^PI)5,6으로 염색하여 섬 생존율을 확인했습니다. 전 세계적으로 Islet 생존율은 FDA 및 PI⁷의 표준 디옥시리보 핵산(DNA) 결합 염료 배제 기술을 사용하여 평가됩니다. 형광 염색 또는 염료 접합 기질은 멤브레인 무결성과 투과성을 기반으로 세포 생존율을 평가합니다. 세포 투과성 염료인 FDA는 살아있는 세포에 의해 녹색 형광(플루오레세인)으로 전환됩니다. 대조적으로, 세포 침투성 염료인 PI는 손상된 막이 있는 죽은 세포의 핵만 염색합니다⁷. 그런 다음 컨포칼 현미경에서 2색 이미징을 통해 세포를 분석하며, 여기서 녹색 및 빨간색 형광은 각각 생존 가능한 세포와 죽은 세포를 표시합니다.

FDA/PI 염색 프로토콜의 한계는 PI가 막 선택성을 상실한 세포에만 침투한다는 것인데, 이는 초기 세포사멸 세포를 구별할 수 없다는 것을 의미합니다. 또한 이 방법은 세포 하위 집합을 구별할 수 없으므로 β세포 생존율을 선택적으로 평가하는 데 적합하지 않습니다. Annexin V/PI 프로토콜은 세포사멸 세포를 연구하는 데 일반적으로 사용되며, 이 프로토콜은 정확도를 높이기 위해 수정되었습니다⁸. 세포사멸의 초기 단계는 포스파티딜세린이 원형질막의 내층에서 외층으로 전위되는 것을 포함합니다. 칼슘 의존성 단백질인 Annexin V는 이렇게 노출된 포스파티딜세린에 높은 친화력으로 결합합니다. PI를 사용한 염색은 세포사멸세포(annexin-V 양성만 해당)와 괴사 세포(annexin-V 및 PI 모두에 대해 양성)를 구별하기 위해 annexin-V와 함께 수행되며, 괴사 세포는 membrane integrity의 손상으로 인해 phosphatidylserine을 나타냅니다⁹. YOPRO-1과 같은 다른 염료도 섬 세포의 세포사멸을 정량화하는 데 사용됩니다. 생존 가능한 세포의 세포막은 세포사멸을 겪는 살아있는 세포를 정량화할 수 없는 annexin-V와 달리 YOPRO-1에 불투과성입니다.

췌장 β세포 사멸을 평가하려면 인슐린 생산 세포만 표적으로 하는 특정 염료가 필요합니다. 췌장 β세포의 뚜렷한 특징은 세포 내 Zn²⁺의 일부가 Zn²⁺ 인슐린 복합체(2:1 비율)로 소포에 저장된다는 것입니다¹⁰. Free Zn²⁺는 또한 β-셀 주변의 입계 공간에도 저장소로 존재합니다. 분비 과립에서 인슐린에 느슨하게 결합된 유리 Zn²⁺ 및 Zn²⁺는 아연 결합 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 아연 결합 염료인 디티존(Dithizone)은 섬의 순도를 평가하는 데 일반적으로 사용되지만, β세포 생존율 및 기능¹¹을 평가하는 데 사용되는 형광 염료와 결합할 수 없습니다. Zn²⁺에 대해 매우 선택적인 TSQ 및 Zinquin과 같은 UV 프로브는 유리 세포 내 Zn²⁺의 이미징 및 측정을 통해 β 세포를 정량화하기 위해 개발되었습니다^{. 12,13}. 그러나 이들의 사용은 낮은 용해도, 불균일한 세포 로딩, UV 여기 요구 사항 및 산성 소포로의 구획화로 인해 제한됩니다¹⁴. Newport green 및 Zn²⁺ 선택적 지표와 같은 가시 파장 형광 프로브도 이러한 한계를 극복하기 위해 개발되었으며 현재 고립된 인간 섬^15,16에서 β-세포를 검출하는 데 널리 사용됩니다. FluoZin-3 (Zn²⁺ 선택적 지표)는 Newport Green보다 Zn²⁺ 친화도가 높고 양자 수율이 우수하며 고립 된 섬에서 인슐린과 함께 방출 된 Zn^{2 +} 이미징에 효과적 인 것으로 입증되었습니다^{14 , 17}.

FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 및 Zn²⁺ 선택적 지표와 같은 형광 염료를 사용하여 생존 세포, 자가사멸 세포 및 총 사멸 세포를 측정하고 구별할 수 있습니다. 호환 가능하고 선택성이 높은 프로브를 결합하면 당뇨병 연구 및 약물 개발에서 β세포 파괴를 이해하고 완화하는 데 중요한 β세포 생존율 및 세포사멸을 평가하고 정량화하기 위한 표적 방법을 제공합니다.

쥐를 사용한 모든 실험은 콜로라도 대학교 덴버 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Protocols 000929)의 승인을 받았습니다. 이 실험에 사용된 C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여 12시간 라이트/다크 주기로 온도 제어 시설에 수용하고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 분리된 마우스 섬은 이전에 기술된 콜라겐분해효소 소화 프로토콜을 사용하여 수득하였다 ^5,18.

1. 용액 및 배양 배지 준비

참고: 배양 배지, 사이토카인 스톡, 기타 시약은 멸균 조건에서 준비해야 합니다.

1. 1640 RPMI 배지 500mL에 소 태아 혈청(FBS), 10,000 U/mL 페니실린 및 10,000 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가하여 섬 배양 배지를 준비합니다.
2. pH 7.4의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 멸균 PBS에 마우스 사이토카인 칵테일, 10μg/mL TNF-α 10μg/mL, IL-1β 5μg/mL 및 IFN-γ 1000μg/mL의 1000x 스톡 용액을 준비하고 -20°C에서 10μL 분취량에 용액을 보관합니다.
3. 아세톤에 46μM(50x) FDA 원액을 준비하고 -20°C에서 1mL 분취액에 보관합니다. PBS에서 1.434 mM(50x) PI 원액을 준비하고 4°C에서 1mL 분취액에 보관합니다.
4. 500mL의 dH₂O에서 125mM NaCl, 5.7mM KCl, 2.5mM CaCl₂, 1.2mM MgCl₂ 및 10mM HEPES가 포함된 500mL의 중탄산염 변형 Krebs-Henseleit HEPES(BMHH) 완충액을 준비합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
5. 100mL의 dH₂O에서 10mM HEPES, 140mM NaCl 및 2.5mM CaCl₂가 포함된 Annexin-V 결합 완충액 100mL를 준비합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
6. DMSO에서 1mM Zn²⁺ 선택적 지시약 원액을 준비하고 -20°C에서 10μL 분취량에 보관합니다.
   참고: 형광 염료는 빛에 민감하므로 보관 및 배양은 어두운 곳에서 이루어져야 합니다.

2. 사이토카인으로 고립된 섬의 처리

1. 10 μL 마이크로피펫으로 마우스 섬을 배양 배지에 분리하고 37 °C 및 5% CO₂ 에서 하룻밤 동안 배양하여 사이토카인으로 처리하기 전에 분리 스트레스를 회복합니다.
2. 멸균된 섬 배양 배지 2mL를 35mm 비조직 배양 처리된 Petri 접시에 추가하고 사이토카인이 없는 사이토카인 처리된 접시와 처리되지 않은 접시를 구별하기 위해 적절하게 라벨링합니다.
3. 사이토카인 처리 접시의 경우, 6 μL의 배양 배지를 제거하고 원액에서 각 사이토카인 2 μL로 대체하여 최종 상대 사이토카인 농도가 10 ng/mL, 5 ng/mL IL-1β 및 100 ng/mL IFN-γ(1x RCC)입니다.
   참고: 0.5x 및 0.1x의 더 낮은 RCC는 각각 1:1 및 1:9에서 0.1% BSA를 함유하는 멸균 PBS로 원액을 희석하여 준비할 수 있습니다.
4. 격리 후 12시간-24시간 후에 광학 현미경으로 마이크로피펫을 사용하여 10-20개의 섬을 집어 접시에 옮기고 가습된 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
   참고: 배양 시간은 특정 실험 목표에 따라 달라질 수 있습니다.

3. FDA/PI를 이용한 Islet 생존율 측정

1. 0.1% BSA를 함유하는 BMHH 완충액 960μL에 FDA 및 PI 원액 각각 20μL를 첨가하여 각각 0.46μM 및 14.34μM의 형광 염료 최종 농도를 제공합니다.
2. 염색 용액 100μL를 7mm 유리 바닥 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 분취합니다.
3. 사이토카인으로 배양한 후 24시간이 지나면 각 처리에서 최소 6개의 섬을 유리 바닥 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 어두운 곳에서 실온에서 5 - 10 분 동안 배양합니다 (호일로 덮으십시오).
4. 40x Water Immersion 대물렌즈가 있는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. FDA/PI 염색 후 15분 이내에 이미지를 촬영합니다.
5. 488nm 및 514nm에서 여기 레이저를 사용하여 각각 FDA(520nm) 및 PI(620nm)에 대한 형광 방출을 감지합니다.
6. 이미지 섬은 10μm 떨어진 3개의 이미지로 구성된 z-스택입니다. 섬의 광 산란 문제로 인한 신호 손실을 줄이기 위해 섬의 아래쪽 1/3 - 1/2만 이미지화하십시오.
7. 마우스당 최소 5개의 섬(n = 3)에 대해 ImageJ(NIH)에서 살아있는 녹색(FDA 양성) 및 죽은 빨간색(PI 양성) 세포를 수동으로 계수합니다. 다음과 같이 세포 사멸 비율을 계산합니다.
   Islet Death 비율 = 죽은 세포 수 / (죽은 세포 수 + 살아있는 세포 수) x 100%

4. 염색을 이용한 세포사멸 측정

1. 8μL의 YOPRO-1(1mM 용액)을 992μL의 BMHH 이미징 버퍼에 추가하여 최종 농도를 0.8μM로 만듭니다.
2. 염색 용액 500μL를 14mm 유리 바닥 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 분취합니다.
3. 사이토카인으로 배양 후 24시간이 지나면 각 처리에서 최소 6개의 섬을 유리 바닥 페트리 접시로 조심스럽게 옮기고 어둠 속에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다(호일로 덮음).
4. 20분 배양 후 NucBlue(핵 염색, 20μL) 한 방울을 각 유리 바닥 페트리 접시에 넣고 배양을 계속합니다. 총 배양 시간은 YOPRO-1의 경우 1시간, 핵 염색의 경우 40분입니다.
5. 배양 1시간 후, 7mm 유리 바닥 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 0.1% BSA(100μL)를 함유한 새로운 BMHH 이미징 버퍼로 섬을 옮깁니다.
6. 40x Water Immersion 대물렌즈가 있는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 405nm 및 488nm에서 여기 레이저를 사용하여 각각 핵 염색(460nm) 및 YOPRO-1(509nm)의 형광 방출을 감지합니다.
7. 이미지 섬은 10μm 떨어진 3개의 이미지로 구성된 z-스택입니다. 섬의 광 산란 문제로 인한 신호 손실을 줄이기 위해 섬의 아래쪽 1/3 - 1/2만 이미지화하십시오.
8. ImageJ(NIH)에서 마우스당 최소 5개의 섬(n = 3)에 대해 살아있는 파란색(핵 염색 양성) 및 세포사멸 녹색(YOPRO-1 양성) 세포를 수동으로 계산합니다. 다음과 같이 apoptotic islet cell의 백분율을 계산합니다.
   apoptotic islet 세포의 백분율 = apoptotic cell의 수 / (apoptotic cell의 수 + 살아있는 세포의 수) x 100%

5. Annexin V/nuclear stain을 이용한 Apoptosis 측정

1. 핵 염색제(40μL) 2방울을 Annexin 결합 완충액 1mL에 추가합니다. 용액 100μL를 7mm 유리 바닥 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 분취합니다.
2. 사이토카인으로 배양한 후 24시간 후에 10μl 마이크로피펫을 사용하여 위아래로 3회 피펫팅하여 PBS의 각 처리에서 최소 6개의 섬을 3배 위아래로 피펫팅하여 조심스럽게 헹굽니다. 핵 염색 용액이 있는 유리 바닥의 페트리 접시에 섬을 옮기고 어둠 속에서 37°C에서 40분 동안 배양합니다(호일로 덮음).
3. 25분 배양 후 각 유리 바닥 페트리 접시에 Annexin V Alexa Flour 488 콘주게이트 5μL를 추가하고 배양을 계속합니다. 총 배양 시간은 핵 염색의 경우 40분, Annexin V의 경우 15분입니다.
4. 40분 배양 후 7mm 유리 바닥 페트리 접시에 있는 새로운 BMHH 이미징 버퍼(Annexin V 또는 핵 염색 없음)로 섬을 옮깁니다.
5. 40x Water Immersion 대물렌즈가 있는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 405nm 및 488nm에서 여기 레이저를 사용하여 각각 핵 염색(460nm) 및 Annexin V 접합체(515nm)의 형광 방출을 검출합니다.
6. 이미지 섬은 10μm 떨어진 3개의 이미지로 구성된 z-스택입니다. 섬의 광 산란 문제로 인한 신호 손실을 줄이기 위해 섬의 아래쪽 1/3 - 1/2만 이미지화하십시오.
7. 마우스당 최소 5개의 섬(n = 3)에 대해 ImageJ(NIH)에서 살아있는 파란색(핵 염색 양성) 및 자가사멸 녹색(Annexin V-양성) 세포를 수동으로 계산합니다. 다음과 같이 apoptotic islet cell의 백분율을 계산합니다.
   apoptotic cells의 백분율 = apoptotic cell의 수 / (apoptotic cells 수 + 살아있는 세포 수) x 100%

6. Zn²⁺ 선택적 지표 / 핵 염색 / PI를 사용한 β세포 사멸 측정

1. 2μL의 Zn²⁺ 선택적 지시약AM 원액을 998μL의 BMHH 이미징 버퍼에 추가하여 0.2μM의 최종 농도를 만듭니다. 500μL의 염색 용액을 14mm 유리 바닥 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 분취합니다.
2. 사이토카인으로 배양한 후 24시간이 지나면 각 처리에서 최소 6개의 섬을 유리 바닥 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다. Zn²⁺ 선택적 지시약 AM 용액 (호일로 덮음)을 사용하여 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
3. 배양 20분 후, 제조업체의 지침에 따라 각 유리 바닥 페트리 접시에 핵 염색제(20μl) 한 방울을 추가하고 배양을 계속합니다. 총 배양 시간은 Zn²⁺ 선택적 지표의 경우 1시간, 핵 염색의 경우 40분입니다.
4. 배양 1시간 후, 7mm 유리 바닥 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 0.1% BSA(100μL)를 함유한 새로운 BMHH 이미징 버퍼로 섬을 옮깁니다. 2μL의 PI 원액을 10분 동안 첨가하여 최종 농도 20μg/mL를 만듭니다.
5. 40x 침수 대물렌즈를 사용한 형광 현미경을 사용하여 PI 염색 후 15분 이내에 이미지를 촬영합니다. 405 nm, 488 nm 및 514 nm에서 여기 레이저를 사용하여 각각 핵 염색(460 nm), Zn²⁺ 선택적 지표(516 nm) 및 PI(620 nm)의 형광 방출을 검출합니다.
6. 이미지 섬은 10μm 떨어진 3개의 이미지로 구성된 z-스택입니다. 섬의 광 산란 문제로 인한 신호 손실을 줄이기 위해 섬의 아래쪽 1/3 - 1/2만 이미지화하십시오.
7. 마우스당 최소 5개의 섬(n = 3)에 대해 ImageJ(NIH)에서 살아있는 파란색(핵 염색 양성), 아연 녹색(Zn²⁺ 선택적 지표 양성) 및 데드 레드(PI 양성) 세포를 수동으로 계산합니다. β세포 사멸 비율을 다음과 같이 계산합니다.
   β세포 사멸 비율 = 아연 양성 및 PI 양성 세포 수 / (사멸 + 살아있는 섬 세포 수) x 100%
   또는
   β세포 사멸 비율 = 아연 양성 및 PI 양성 세포 수 / (아연 양성 세포 수) x 100%

사이토카인으로 처리된 섬의 생존력을 평가하기 위해 FDA 및 PI를 사용한 이중 염색을 사용했습니다. 모든 실험은 3회(n = 3)로 수행되었으며, 처리된 섬과 처리되지 않은 섬 간의 재현성과 통계적 비교를 보장하기 위해 5개 또는 6개의 섬의 평균 데이터를 포함하는 10μm 떨어진 여러 z-stack 이미지에서 데이터를 생성했습니다. 그림 1A 는 효소 활성 세포?...

이 연구는 사이토카인 유발 스트레스 하에서 섬세포 생존율, 세포사멸 및 β세포 생존을 평가하는 데 형광 염료 및 컨포칼 현미경을 사용한 다중 염색 방법의 효과를 보여줍니다. FDA/PI 염색은 사이토카인에 노출된 섬 내에서 세포 사멸의 용량 의존적 증가를 밝혔으며, 이는 막이 손상된 세포를 표시하는 적색 형광으로 명백히 나타나 세포 생존력에 대한 사이토카인의 세?...

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

NIDDK 어워드 R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B를 NLF에, ADA 7-20-JDF-020을 N.L.F.에 수여했습니다. 저자들은 콜로라도 대학교 앤슈츠 캠퍼스의 당뇨병 연구 센터(Diabetes Research Center) P30-DK116073 및 이 작업을 지원하는 데 활용된 관련 핵심 시설의 지원에 감사를 표합니다.