علاج جزيرة البنكرياس المعزولة وقياس موت الخلايا المبرمج

تستخدم هذه الدراسة علامات متعددة التألق قائمة على موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين والموت الخاص بالخلايا β في جزر البنكرياس. يكشف عن التغيرات المكانية والزمانية في موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج استجابة للمنبهات خارج الخلية.

تبحث هذه الدراسة في تأثير السيتوكينات المؤيدة للالتهابات على جزر البنكرياس ، وخاصة الخلايا β المنتجة للأنسولين ، باستخدام مزيج من تقنيات تلطيخ التألق والفحص المجهري متحد البؤر لتقييم صلاحية الخلية ، موت الخلايا المبرمج ، والموت الخاص بالخلايا β. تمت معالجة جزر الفئران المعزولة بتركيزات متفاوتة من كوكتيل السيتوكين ، بما في ذلك TNF-α و IL-1β و IFN-γ ، لتقليد موت الخلايا المبرمج بوساطة المناعة أثناء تطور مرض السكري من النوع 1. تم تقييم جدوى خلايا الجزر من خلال التلوين المزدوج FDA / PI ، حيث أشار تحويل إدارة الغذاء والدواء إلى فلورسين إلى خلايا قابلة للحياة ، وخلايا معرضة للخطر بالغشاء بعلامة PI. قدم YOPRO-1 والتلوين النووي بيانات إضافية عن موت الخلايا المبرمج ، مع تأكيد الملحق الخامس للخلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة. كشف التحليل الكمي عن زيادات كبيرة في معدلات موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا في الجزر المعالجة بالسيتوكينات. لتقييم التأثيرات على الخلايا β على وجه التحديد ، تم استخدام تلطيخ مؤشر Zn²⁺ الانتقائي لتسمية الخلايا المنتجة للأنسولين من خلال ارتباط الزنك في حبيبات الأنسولين ، مما يكشف عن فقدان كبير للخلايا β بعد معالجة الجزر بالسيتوكينات المؤيدة للالتهابات لمدة 24 ساعة. تلتقط بروتوكولات التلطيخ المتعددة هذه بشكل فعال وتحدد مدى الضرر الناجم عن السيتوكين في الجزر الصغيرة ويمكن استخدامها لتقييم العلاجات المصممة لمنع موت الخلايا المبرمج β الخلايا في مرض السكري من النوع 1 المبكر.

جزر البنكرياس ، والمعروفة أيضا باسم جزر لانجرهانز ، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء الموجودة داخل البنكرياس. الخلايا β المنتجة للأنسولين هي المكون الأكثر وفرة وأهمية وظيفية في جزر البنكرياس. تفرز هذه الخلايا β الأنسولين ، وهو هرمون يلعب دورا مهما في الحفاظ على توازن الجلوكوز¹. في مرض السكري من النوع 1 (T1D) ، يستهدف الجهاز المناعي جزر البنكرياس ويتسلل إليها ، مما يؤدي إلى تدمير الخلايا β المنتجة للأنسولين. يتم التوسط في هجوم المناعة الذاتية هذا بشكل أساسي عن طريق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك إنترلوكين -1β (IL-1β) ، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وإنترفيرون جاما (IFN-γ) ². تبدأ هذه السيتوكينات سلسلة من أحداث الإشارات داخل الخلايا β التي تؤدي في النهاية إلى موت الخلايا^{المبرمج 3}. موت الخلايا المبرمج ، موت الخلايا المبرمج ، هو عملية منظمة بإحكام تنطوي على تنشيط الكاسباسات وتجزئة الحمض النووي والتفكك الخلوي. يساهم في الفقدان التدريجي لكتلة الخلايا β ووظيفتها أثناء ظهور T1D³.

يعد فهم الآليات الجزيئية التي تدفع موت الخلايا المبرمج للخلايا β أمرا بالغ الأهمية لتحديد استراتيجيات منع أو تخفيف تدمير الخلايا β في T1D. لتحقيق ذلك ، تعمل جزر البنكرياس المعزولة من النماذج التجريبية أو الجثث البشرية كنظام نموذجي قوي وراسخ لدراسة أمراض الخلايا β^2،3. من خلال معالجة هذه الجزر المعزولة بالسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، يمكن للباحثين تكرار البيئة التي تميز T1D المبكر ، مما يسمح بدراسة مفصلة لخلل الخلايا β والموت في المختبر^4،5. توفر هذه التجارب رؤى رئيسية حول ضعف الخلايا β وبقائها في ظل الظروف المرتبطة بالأمراض ، كما أنها تعمل كمنصة لاختبار التدخلات العلاجية التي تهدف إلى حماية أو إنقاذ الخلايا β من موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين. من خلال استخدام هذا النظام في المختبر ، يمكننا تحليل كيفية استجابة الجزر الصغيرة من الأنواع المختلفة للظروف المختلفة بشكل فعال ، مما يوفر فهما أفضل للاختلافات الوظيفية وموت الخلايا المبرمج عبر الأنواع.

أظهرت الدراسات السابقة أن الفئران والجزر الصغيرة البشرية عولجت لمدة 24 ساعة بكوكتيل (1x = 10 نانوغرام / مل TNF-α ، و 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ) من السيتوكينات المشتقة من الفئران والإنسان ، على التوالي ، أدت إلى موت كبير لخلايا الجزر^4،5،6. تم تأكيد صلاحية الجزيرة عن طريق تلطيخ الخلايا المعالجة بالسيتوكين بثنائي أسيتات الفلورسين (FDA) ويوديد البروبيديوم (PI) ^5،6. على الصعيد العالمي ، يتم تقييم جدوى الجزر باستخدام تقنية استبعاد الصبغة القياسية المرتبطة بحمض الديوكسي ريبونوكلييك (DNA) مع FDA و PI⁷. تقوم بقع الفلورسنت أو الركائز المترافقة بالصبغة بتقييم صلاحية الخلية بناء على سلامة الغشاء ونفاذيته. يتم تحويل FDA ، وهي صبغة منفذة للخلايا ، بواسطة الخلايا الحية إلى مضان أخضر (فلورسين). في المقابل ، PI ، وهي صبغة غير منفذة للخلية ، تلطخ فقط نوى الخلايا الميتة ذات الأغشية المعرضة^{للخطر 7}. ثم يتم تحليل الخلايا من خلال التصوير ثنائي اللون على مجهر متحد البؤر ، حيث تشير الفلورسنت الأخضر والأحمر إلى الخلايا القابلة للحياة والميتة ، على التوالي.

يتمثل الحد من بروتوكول تلطيخ FDA / PI في أن PI يدخل فقط الخلايا التي فقدت انتقائية الغشاء ، مما يعني أنه لا يمكنه التمييز بين الخلايا المبرمجة المبكرة. علاوة على ذلك ، لا يمكن لهذه الطريقة التمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا ، مما يجعلها غير مناسبة لتقييم قابلية β للخلايا بقاء بشكل انتقائي. يشيع استخدام بروتوكول Annexin V / PI لدراسة الخلايا المبرمجة ، وقد تم تعديل البروتوكول لتحسين دقته⁸. تتضمن المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج نقل الفوسفاتيديل سيرين من الطبقة الداخلية إلى الطبقة الخارجية لغشاء البلازما. يرتبط Annexin V ، وهو بروتين يعتمد على الكالسيوم ، بتقارب عال مع هذا الفوسفاتيديل سيرين المكشوف. يتم إجراء التلوين باستخدام PI جنبا إلى جنب مع الملحق V لتمييز الخلايا المبرمج (الملحق الإيجابي V فقط) من الخلايا الميتة (إيجابية لكل من الملحق-V و PI) ، حيث تعرض الخلايا النخرية أيضا الفوسفاتيديل سيرين بسبب سلامة الغشاء^{المعرضة للخطر 9}. تستخدم الأصباغ الأخرى ، مثل YOPRO-1 ، أيضا لتحديد موت الخلايا المبرمج لخلايا الجزر. غشاء الخلية للخلايا القابلة للحياة غير منفذ ل YOPRO-1 ، على عكس Annexin-V ، الذي لا يمكنه تحديد الخلايا الحية التي تخضع لموت الخلايا المبرمج.

لتقييم موت خلايا البنكرياس β ، هناك حاجة إلى أصباغ محددة تستهدف الخلايا المنتجة للأنسولين فقط. السمة المميزة لخلايا البنكرياس β هي أن جزءا من Zn²⁺ داخل الخلايا يتم تخزينه في حويصلات كمركب الأنسولين Zn^{2 +} (نسبة 2: 1) ¹⁰. يوجد الزنك^{الحر 2+} أيضا في المساحة الحبيبية حول الخلايا β كخزانات. يمكن تصور Zn²⁺ و Zn²⁺ المرتبط بشكل فضفاض بالأنسولين في حبيبات إفرازية باستخدام أصباغ ملزمة بالزنك. يستخدم Dithizone ، وهو صبغة ملزمة بالزنك ، بشكل شائع لتقييم نقاء الجزيرة ، ولكن لا يمكن دمجها مع الأصباغ الفلورية المستخدمة لتقييم صلاحية الخلايا β ووظيفتها¹¹. تم تطوير مجسات الأشعة فوق البنفسجية مثل TSQ و Zinquin الانتقائية للغاية تجاه Zn²⁺ لتحديد الخلايا β عن طريق تصوير وقياس Zn 2⁺ الحرة ^{داخل الخلايا. 12،13}. ومع ذلك ، فإن استخدامها محدود بسبب ضعف الذوبان ، والتحميل غير المتكافئ للخلايا ، ومتطلبات الإثارة للأشعة فوق البنفسجية ، والتقسيم إلى حويصلات حمضية¹⁴. كما تم تطوير مجسات الفلورسنت ذات الطول الموجي المرئي ، مثل مؤشر نيوبورت الأخضر والزنك²⁺ الانتقائي للتغلب على هذه القيود وتستخدم الآن على نطاق واسع للكشف عن الخلايا β في الجزر البشرية المعزولة^15،16. يحتوي FluoZin-3 (مؤشر Zn^{2 +} الانتقائي) على تقارب أعلى من Zn^{2 +} وعائد كمي فائق من Newport Green وقد أثبت فعاليته في تصوير Zn^{2 +} الذي تم إطلاقه مع الأنسولين في الجزر الصغيرة^{المعزولة 14،17}.

يتيح استخدام الأصباغ الفلورية مثل FDA و PI و Annexin V و YOPRO-1 و Zn^{2 +} المؤشر الانتقائي القياس والتمايز بين الخلايا الميتة القابلة للحياة والخلايا المبرمجة والكلية. يوفر الجمع بين المجسات المتوافقة والانتقائية للغاية أيضا طريقة مستهدفة لتقييم وقياس قابلية الخلايا β وموت الخلايا المبرمج ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم وتخفف تدمير الخلايا β في أبحاث مرض السكري وتطوير الأدوية.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة كولورادو دنفر (البروتوكولات 000929). تم شراء الفئران C57Bl / 6 المستخدمة في هذه التجربة من مختبر جاكسون وتم إيواؤها في منشأة يتم التحكم في درجة حرارتها في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل خاص. تم الحصول على جزر الفئران المعزولة باستخدام بروتوكول هضم الكولاجيناز ، والذي تم وصفه سابقا^5،18.

1. إعداد الحلول والإعلام الثقافي

ملاحظة: يجب تحضير وسائط الاستزراع ومخزونات السيتوكين والكواشف الأخرى في ظروف معقمة.

1. قم بإعداد وسط استزراع جزيري عن طريق إضافة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS)، و10,000 وحدة / مل من البنسلين و10,000 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين إلى 500 مل من 1640 دورة في البوصة متوسطة.
2. تحضير 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4. قم بإعداد محلول مخزون 1000x من كوكتيل السيتوكينات الفأرية ، 10 ميكروغرام / مل TNF-α 10 ميكروغرام / مل ، 5 ميكروغرام / مل IL-1β ، و 100 ميكروغرام / مل IFN-γ في PBS معقم يحتوي على 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) وتخزين المحلول في 10 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية.
3. قم بإعداد محلول مخزون 46 ميكرومتر (50x) من FDA في الأسيتون وتخزينه في 1 مل عند -20 درجة مئوية. قم بإعداد محلول مخزون PI 1.434 ملي مولار (50x) في PBS وقم بتخزينه في حصص 1 مل عند 4 درجات مئوية.
4. قم بإعداد 500 مل من المخزن المؤقت Krebs-Henseleit HEPES المعدل بالبيكربونات (BMHH) مع 125 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 2.5 ملي كلوريد_{الملطيوس 2} ، و 1.2 ملي مللي كلوريد₂ ، و 10 ملي مولار HEPES في 500 مل من dH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4.
5. قم بإعداد 100 مل من المخزن المؤقت الملزم Annexin-V مع 10 ملي مولار HEPES و 140 ملي كلوريد الصوديوم و 2.5 ملي كلوريد_{الملليوم 2} في 100 مل من dH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4.
6. قم بإعداد محلول مخزون مؤشر انتقائي 1 ملي مولار Zn²⁺ في DMSO وتخزينه في 10 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: الأصباغ الفلورية حساسة للضوء ، لذلك يجب أن يكون التخزين والحضانة في الظلام.

2. علاج الجزر المعزولة بالسيتوكينات

1. اعزل جزر الفئران ب 10 ميكرولتر في وسط الاستزراع واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} للتعافي من إجهاد العزل قبل المعالجة بالسيتوكينات.
2. أضف 2 مل من وسط زراعة الجزر المعقمة إلى 35 مم من أطباق بتري غير المعالجة بزراعة الأنسجة وقم بتسميتها بشكل مناسب للتمييز بين الأطباق المعالجة بالسيتوكين وغير المعالجة بدون السيتوكينات.
3. بالنسبة للأطباق المعالجة بالسيتوكين ، قم بإزالة 6 ميكرولتر من وسط الاستزراع واستبدله ب 2 ميكرولتر من كل سيتوكين من محلول المخزون لإعطاء تركيز سيتوكين نسبي نهائي يبلغ 10 نانوغرام / مل ، و 5 نانوغرام / مل IL-1β ، و 100 نانوغرام / مل IFN-γ (1x RCC).
   ملاحظة: يمكن تحضير RCC أقل من 0.5x و 0.1x عن طريق تخفيف محاليل المخزون باستخدام PBS معقم يحتوي على 0.1٪ BSA عند 1: 1 و 1: 9 ، على التوالي.
4. في 12 ساعة - 24 ساعة بعد العزل ، التقط 10-20 جزيرة صغيرة باستخدام ماصة دقيقة تحت مجهر ضوئي وانقله إلى الأطباق واحتضانه في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة اعتمادا على الأهداف التجريبية المحددة.

3. قياس جدوى الجزيرة مع FDA / PI

1. أضف 20 ميكرولتر لكل من محاليل مخزون FDA و PI إلى 960 ميكرولتر من المخزن المؤقت BMHH الذي يحتوي على 0.1٪ BSA لإعطاء تركيز نهائي قدره 0.46 ميكرومتر و 14.34 ميكرومتر من الأصباغ الفلورية ، على التوالي.
2. Aliquot 100 ميكرولتر من محلول التلوين إلى طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة بقاع زجاجي مقاس 7 مم.
3. بعد 24 ساعة من الحضانة باستخدام السيتوكينات ، انقل بعناية ما لا يقل عن 6 جزر صغيرة من كل علاج إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي. احتضن لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام (غطيه بورق الألمنيوم).
4. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. التقط الصور في غضون 15 دقيقة من تلطيخ FDA / PI.
5. استخدم ليزر الإثارة عند 488 نانومتر و 514 نانومتر للكشف عن انبعاثات التألق لإدارة الغذاء والدواء (520 نانومتر) و PI (620 نانومتر) ، على التوالي.
6. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
7. عد الخلايا الخضراء الحية (إيجابية إدارة الغذاء والدواء) والحمراء الميتة (إيجابية PI) يدويا في ImageJ (NIH) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (n = 3). احسب نسبة موت الخلايا على النحو التالي:
   النسبة المئوية لموت الجزيرة = عدد الخلايا الميتة / (عدد الخلايا الميتة + عدد الخلايا الحية) × 100٪

4. قياس موت الخلايا المبرمج باستخدام التلوين

1. أضف 8 ميكرولتر من YOPRO-1 (محلول 1 ملليمتر) إلى 992 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير BMHH للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.8 ميكرومتر.
2. Aliquot 500 ميكرولتر من محلول التلوين إلى طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 14 مم من القاع الزجاجي.
3. بعد 24 ساعة من الحضانة بالسيتوكينات ، انقل بعناية ما لا يقل عن 6 جزر صغيرة من كل معالجة إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام (قم بتغطيته بورق الألمنيوم).
4. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف قطرة من NucBlue (بقعة نووية ، 20 ميكرولتر) إلى كل طبق بتري ذو قاع زجاجي واستمر في الحضانة. إجمالي وقت الحضانة هو 1 ساعة ل YOPRO-1 و 40 دقيقة للبقع النووية.
5. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، انقل الجزر إلى مخزن تصوير BMHH جديد يحتوي على 0.1٪ BSA (100 ميكرولتر) في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 7 مم.
6. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. استخدم ليزر الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر للكشف عن انبعاثات مضان البقع النووية (460 نانومتر) و YOPRO-1 (509 نانومتر) ، على التوالي.
7. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
8. عد الخلايا الزرقاء الحية (إيجابية البقع النووية) والخلايا المبرمجة (إيجابية YOPRO-1) يدويا في ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (ن = 3). احسب النسبة المئوية لخلايا جزيرة موت الخلايا المبرمج على النحو التالي:
   النسبة المئوية لخلايا جزر موت الخلايا المبرمج = عدد الخلايا المبرمجة / (عدد الخلايا المبرمجة + عدد الخلايا الحية) × 100٪

5. قياس موت الخلايا المبرمج باستخدام الملحق الخامس / وصمة عار نووية

1. أضف قطرتين من البقعة النووية (40 ميكرولتر) إلى 1 مل من المخزن المؤقت المرتبط ب Annexin. Aliquot 100 ميكرولتر من المحلول في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة بحجم 7 مم من الزجاج.
2. بعد 24 ساعة من الحضانة باستخدام السيتوكينات ، اشطفها بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 3 أضعاف 6 جزر على الأقل من كل معالجة في PBS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات باستخدام الماصة الدقيقة سعة 10 ميكرولتر. انقل الجزر الصغيرة إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي مع محلول البقع النووية واحتضنها لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام (قم بتغطيتها بورق الألمنيوم).
3. بعد 25 دقيقة من الحضانة ، أضف 5 ميكرولتر من دقيق Annexin V Alexa 488 إلى كل طبق بتري ذو قاع زجاجي واستمر في الحضانة. إجمالي وقت الحضانة هو 40 دقيقة للبقعة النووية و 15 دقيقة للملحق الخامس.
4. بعد 40 دقيقة من الحضانة ، انقل الجزر إلى مخزن مؤقت جديد للتصوير BMHH (بدون Annexin V أو صبغة نووية) في طبق بتري زجاجي 7 مم.
5. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. استخدم ليزر الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر للكشف عن انبعاثات مضان البقع النووية (460 نانومتر) والمترافق Annexin V (515 نانومتر) ، على التوالي.
6. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
7. عد الخلايا الزرقاء الحية (إيجابية البقع النووية) والخلايا المبرمجة (Annexin V-positive) يدويا في ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (ن = 3). احسب النسبة المئوية لخلايا جزيرة موت الخلايا المبرمج على النحو التالي:
   النسبة المئوية للخلايا المبرمجة = عدد الخلايا المبرمجة / (عدد الخلايا المبرمجة + عدد الخلايا الحية) × 100٪

6. قياس موت الخلايا β باستخدام مؤشر Zn²⁺ الانتقائي / وصمة عار نووية / PI

1. أضف 2 ميكرولتر من المؤشر الانتقائي Zn²⁺ محلول مخزون AM إلى 998 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير BMHH لعمل تركيز نهائي يبلغ 0.2 ميكرومتر. Aliquot 500 ميكرولتر من محلول التلوين إلى طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 14 مم غير معالج بزراعة الأنسجة.
2. بعد 24 ساعة من الحضانة باستخدام السيتوكينات ، انقل بعناية ما لا يقل عن 6 جزر صغيرة من كل علاج إلى طبق بتري ذو القاع الزجاجي. احتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام باستخدام محلول AM المؤشر الانتقائي Zn²⁺ (قم بتغطيته بورق الألمنيوم).
3. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف قطرة من البقعة النووية (20 ميكرولتر) إلى كل طبق بتري ذو قاع زجاجي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستمر في الحضانة. إجمالي وقت الحضانة هو 1 ساعة للمؤشر الانتقائي Zn²⁺ و 40 دقيقة للبقع النووية.
4. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، انقل الجزر إلى مخزن تصوير BMHH جديد يحتوي على 0.1٪ BSA (100 ميكرولتر) في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 7 مم. أضف 2 ميكرولتر من محلول مخزون PI لمدة 10 دقائق لعمل تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام / مل.
5. التقط صورا في غضون 15 دقيقة من تلطيخ PI باستخدام الفحص المجهري الفلوري بهدف الغمر في الماء 40x. استخدم ليزر الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر و 514 نانومتر للكشف عن انبعاثات مضان البقع النووية (460 نانومتر) ، والمؤشر الانتقائي Zn²⁺ (516 نانومتر) ، و PI (620 نانومتر) ، على التوالي.
6. جزر الصورة على شكل مكدس z يتكون من ثلاث صور ، تفصل بينها 10 ميكرومتر. قم بتصوير الجزء السفلي فقط من 1/3 - 1/2 من الجزيرة لتقليل فقدان الإشارة بسبب مشكلات تشتت الضوء في الجزيرة.
7. عد الخلايا الزرقاء الحية (إيجابية البقع النووية) ، والأخضر الزنك (Zn²⁺ المؤشر الانتقائي الإيجابي) ، والأحمر الميت (إيجابي PI) يدويا في ImageJ (NIH) لما لا يقل عن 5 جزر لكل فأر (ن = 3). احسب النسبة المئوية لموت الخلايا β على النحو التالي:
   النسبة المئوية لموت الخلايا β = عدد الخلايا الإيجابية للزنك والخلايا الإيجابية PI / (عدد الخلايا الميتة + خلايا الجزيرة الحية) × 100٪
   أو
   النسبة المئوية لموت الخلايا β = عدد الخلايا الإيجابية للزنك والخلايا الإيجابية PI / (عدد الخلايا الإيجابية للزنك) × 100٪

تم استخدام التلوين المزدوج باستخدام FDA و PI لتقييم جدوى الجزر الصغيرة المعالجة بالسيتوكينات. أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن = 3) ، وتم إنشاء البيانات من صور متعددة z-stack بمسافة 10 ميكرومتر ، مع احتواء كل نسخة مكررة على متوسط بيانات من 5 أو 6 جزر ، لضمان قابلية التكرار والمقار?...

توضح هذه الدراسة فعالية طرق التلوين المتعدد مع الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر في تقييم صلاحية الخلايا الجزرية ، وموت الخلايا المبرمج ، وبقاء الخلايا β تحت الإجهاد الناجم عن السيتوكينات. كشف تلطيخ FDA / PI عن زيادة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا داخل الجزر المع...

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

قدمت المنح التالية أموالا لهذا العمل: جائزة NIDDK R01 DK137221 ، JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B إلى NLF ، و ADA 7-20-JDF-020 إلى N.L.F. يود المؤلفون أن يشعروا بتقديرهم للدعم المقدم من مركز أبحاث مرض السكري في حرم جامعة كولورادو أنشوتز P30-DK116073 والمرافق الأساسية المرتبطة بها المستخدمة لدعم هذا العمل.