Tratamiento de islotes pancreáticos aislados y medición de la apoptosis

Este estudio utiliza marcadores de muerte celular y apoptosis basados en fluorescencia de tinción múltiple combinados con microscopía confocal para evaluar la apoptosis inducida por citocinas y la muerte β celular específica en islotes pancreáticos. Revela cambios espaciales y temporales en la muerte celular y la apoptosis en respuesta a estímulos extracelulares.

Este estudio investiga el efecto de las citocinas proinflamatorias en los islotes pancreáticos, en particular en las células β productoras de insulina, utilizando una combinación de técnicas de tinción de fluorescencia y microscopía confocal para evaluar la viabilidad celular, la apoptosis y la muerte específica de las células β. Los islotes aislados de ratón se trataron con concentraciones variables de un cóctel de citocinas, incluyendo TNF-α, IL-1β e IFN-γ, para imitar la apoptosis inmunomediada durante el desarrollo de la diabetes tipo 1. La viabilidad de las células de los islotes se evaluó con tinción dual FDA/PI, donde la conversión de FDA a fluoresceína indicó células viables y células marcadas con PI comprometidas en la membrana. YOPRO-1 y la tinción nuclear proporcionaron datos adicionales sobre la apoptosis, con la anexina-V confirmando las células apoptóticas tempranas. El análisis cuantitativo reveló aumentos significativos en las tasas de apoptosis y muerte celular en los islotes tratados con citocinas. Para evaluar específicamente los efectos sobre las células β, se utilizó la tinción indicadora selectiva de Zn²⁺ para marcar las células productoras de insulina a través de la asociación de zinc en gránulos de insulina, revelando una pérdida sustancial de células β después del tratamiento de los islotes con citocinas proinflamatorias durante 24 h. Estos protocolos de tinción múltiple capturan y cuantifican eficazmente el alcance del daño inducido por citocinas en los islotes y se pueden utilizar para evaluar terapias diseñadas para prevenir la apoptosis de células β en la diabetes tipo 1 temprana.

Los islotes pancreáticos, también conocidos como islotes de Langerhans, son una colección de células endocrinas ubicadas dentro del páncreas. Las células β productoras de insulina son el componente más abundante y funcionalmente significativo de los islotes pancreáticos. Estas células β secretan insulina, una hormona que desempeña un papel fundamental en el mantenimiento^{de la} homeostasis de la glucosa. En la diabetes tipo 1 (DT1), el sistema inmunitario ataca e infiltra los islotes pancreáticos, destruyendo las células β productoras de insulina. Este ataque autoinmune está mediado principalmente por citocinas proinflamatorias, como la interleucina-1β (IL-1β), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y el interferón gamma (IFN-γ)². Estas citocinas inician una cascada de eventos de señalización dentro de las células β que, en última instancia, desencadenan la apoptosis³. La apoptosis, la muerte celular programada, es un proceso estrictamente regulado que implica la activación de caspasas, la fragmentación del ADN y la desintegración celular. Contribuye a la pérdida gradual de la masa y la función de las células β durante el inicio de la diabetes tipo^{1 3}.

Comprender los mecanismos moleculares que impulsan la apoptosis de las células β es fundamental para identificar estrategias para prevenir o mitigar la destrucción de las células β en la diabetes tipo 1. Para lograr esto, los islotes pancreáticos aislados de modelos experimentales o cadáveres humanos sirven como un sistema modelo robusto y bien establecido para el estudio de la patología de células^{β 2,3}. Al tratar estos islotes aislados con citocinas proinflamatorias, los investigadores pueden replicar el entorno que caracteriza a la diabetes tipo 1 temprana, lo que permite el estudio detallado de la disfunción y muerte de las células β in vitro ^4,5. Estos experimentos proporcionan información clave sobre la vulnerabilidad y la supervivencia de las células β en condiciones asociadas a la enfermedad, y también sirven como plataforma para probar intervenciones terapéuticas destinadas a proteger o rescatar a las células β de la apoptosis inducida por citocinas. Al utilizar este sistema in vitro, podemos analizar de manera efectiva cómo los islotes de diferentes especies responden a diversas condiciones, proporcionando una mejor comprensión de las variaciones funcionales y apoptóticas entre especies.

Estudios previos han demostrado que los islotes de ratón y humanos tratados durante 24 h con un cóctel (1x = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL de IL-1β y 100 ng/mL de IFN-γ) de citocinas derivadas de ratones y humanos, respectivamente, resultaron en una muerte significativa de las células de los islotes ^4,5,6. La viabilidad de los islotes se confirmó mediante la tinción de las células tratadas con citocinas con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI)^5,6. A nivel mundial, la viabilidad de los islotes se evalúa mediante la técnica estándar de exclusión de colorantes de unión al ácido desoxirribonucleico (ADN) con FDA y PI⁷. Las tinciones fluorescentes o los sustratos conjugados con colorantes evalúan la viabilidad celular en función de la integridad y permeabilidad de la membrana. La FDA, un tinte permeable a las células, es convertida por las células vivas en fluorescencia verde (fluoresceína). Por el contrario, el PI, un colorante impermeable a las células, tiñe solo los núcleos de las células muertas con membranas comprometidas⁷. Luego, las células se analizan a través de imágenes de dos colores en un microscopio confocal, donde los fluorescentes verdes y rojos marcan las células viables y muertas, respectivamente.

La limitación del protocolo de tinción FDA/PI es que PI solo ingresa a las células que han perdido la selectividad de la membrana, lo que significa que no puede distinguir las células apoptóticas tempranas. Además, este método no puede diferenciar entre subconjuntos de células, por lo que no es adecuado para evaluar selectivamente la viabilidad de β células. El protocolo de anexina V/PI se utiliza habitualmente para el estudio de las células apoptóticas, y el protocolo ha sido modificado para mejorar su precisión⁸. Las primeras etapas de la apoptosis implican la translocación de fosfatidilserina de la capa interna a la externa de la membrana plasmática. La anexina V, una proteína dependiente del calcio, se une con alta afinidad a esta fosfatidilserina expuesta. La tinción con PI se lleva a cabo junto con la anexina-V para distinguir las células apoptóticas (anexina V positiva solamente) de las células necróticas (positivas tanto para la anexina-V como para la PI), ya que las células necróticas también muestran fosfatidilserina debido a la integridad comprometida de la membrana⁹. Otros colorantes, como el YOPRO-1, también se utilizan para cuantificar la apoptosis de las células de los islotes. La membrana celular de las células viables es impermeable a YOPRO-1, a diferencia de la anexina-V, que no puede cuantificar las células vivas en apoptosis.

Para evaluar la muerte de las células β pancreáticas, se necesitan tintes específicos dirigidos solo a las células productoras de insulina. Una característica distintiva de las células β pancreáticas es que una porción de Zn²⁺ intracelular se almacena en vesículas como un complejo Zn²⁺-insulina (proporción 2:1)¹⁰. El Zn²⁺ libre también existe en el espacio extragranular alrededor de las células β como reservorios. El Zn²⁺ y el Zn²⁺ libres unidos a la insulina en gránulos secretores se pueden visualizar utilizando tintes fijadores de zinc. La ditionera, un colorante que se une al zinc, se usa comúnmente para evaluar la pureza de los islotes, pero no se puede combinar con los tintes fluorescentes utilizados para evaluar la viabilidad y función de las células β¹¹. Se han desarrollado sondas UV como TSQ y Zinquin, que son altamente selectivas hacia el Zn²⁺, para cuantificar las células β mediante imágenes y medición del Zn²⁺ intracelular libre^{; 12,13}. Sin embargo, su uso está limitado por la escasa solubilidad, la carga desigual de las células, la necesidad de excitación UV y la compartimentación en vesículas ácidas¹⁴. Las sondas fluorescentes de longitud de onda visible, como el verde de Newport y el indicador selectivo de Zn²⁺, también se han desarrollado para superar estas limitaciones y ahora se utilizan ampliamente para detectar células β en islotes humanos aislados^15,16. FluoZin-3 (indicador selectivo de Zn²⁺) tiene una mayor afinidad por el Zn²⁺ y un rendimiento cuántico superior al de Newport Green y ha demostrado ser eficaz para obtener imágenes de Zn²⁺ co-liberado con insulina en islotes aislados^14,17.

El uso de colorantes fluorescentes como el indicador selectivo FDA, PI, Anexina V, YOPRO-1 y Zn²⁺ permite la medición y diferenciación entre células muertas viables, apoptóticas y totales. La combinación de sondas compatibles y altamente selectivas también ofrece un método específico para evaluar y cuantificar la viabilidad y la apoptosis de las células β, que es fundamental para comprender y mitigar la destrucción de las células β en la investigación de la diabetes y el desarrollo de fármacos.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado en Denver (Protocolos 000929). Los ratones C57Bl/6 utilizados para este experimento se compraron en el Laboratorio Jackson y se alojaron en una instalación de temperatura controlada en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso a alimentos y agua ad libitum. Los islotes aislados de ratón se obtuvieron utilizando el protocolo de digestión de colagenasa, previamente descrito ^5,18.

1. Preparación de soluciones y medios de cultivo

NOTA: Los medios de cultivo, las cepas de citocinas y otros reactivos deben prepararse en condiciones estériles.

1. Prepare un medio de cultivo de islotes agregando 10% de suero fetal bovino (FBS), 10,000 U/mL de penicilina y 10,000 μg/mL de estreptomicina a 500 mL de medio 1640 RPMI.
2. Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Prepare una solución madre 1000x de cóctel de citocinas de ratón, 10 μg/mL de TNF-α 10 μg/mL, 5 μg/mL de IL-1β y 100 μg/mL de IFN-γ en PBS estéril que contenga 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) y almacene la solución en alícuotas de 10 μL a -20 °C.
3. Prepare una solución madre de 46 μM (50x) de FDA en acetona y guárdela en alícuotas de 1 mL a -20 °C. Prepare una solución madre de PI de 1,434 mM (50x) en PBS y guárdela en alícuotas de 1 mL a 4 °C.
4. Prepare 500 mL de tampón Krebs-Henseleit HEPES (BMHH) modificado con bicarbonato con 125 mM de NaCl, 5,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgCl₂ y 10 mM de HEPES en 500 mL de_dH2O. Ajuste el pH a 7,4.
5. Prepare 100 mL de tampón de unión de anexina-V con 10 mM de HEPES, 140 mM de NaCl y 2,5 mM de CaCl₂ en 100 mL de dH₂O. Ajuste el pH a 7,4.
6. Prepare una solución madre de indicador selectivo de 1 mM de Zn²⁺ en DMSO y almacene en alícuotas de 10 μL a -20 °C.
   NOTA: Los tintes fluorescentes son sensibles a la luz, por lo que el almacenamiento y la incubación deben realizarse en la oscuridad.

2. Tratamiento de islotes aislados con citocinas

1. Aísle los islotes de ratón con una micropipeta de 10 μL en el medio de cultivo e incube durante la noche a 37 °C y 5% de CO₂ para recuperarse del estrés de aislamiento antes del tratamiento con citocinas.
2. Agregue 2 mL del medio de cultivo de islotes esterilizado a placas de Petri de 35 mm tratadas con cultivo de tejidos sin tratamiento y etiquételas adecuadamente para diferenciar las placas tratadas con citocinas y las no tratadas sin citocinas.
3. En el caso de placas tratadas con citocinas, retire 6 μL de medio de cultivo y reemplácelo con 2 μL de cada citocina de la solución madre para obtener una concentración relativa final de citocinas de 10 ng/mL, 5 ng/mL de IL-1β y 100 ng/mL de IFN-γ (1x RCC).
   NOTA: Se pueden preparar RCC más bajos de 0,5x y 0,1x diluyendo soluciones madre con PBS estéril que contiene 0,1% de BSA a 1:1 y 1:9, respectivamente.
4. A las 12 h-24 h después del aislamiento, recoja 10-20 islotes con una micropipeta bajo un microscopio óptico y transfiéralo a las placas e incube en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
   NOTA: El tiempo de incubación puede variar en función de los objetivos experimentales específicos.

3. Medición de la viabilidad de los islotes con FDA/PI

1. Añadir 20 μL de soluciones madre de FDA y PI a 960 μL de tampón BMHH que contiene 0,1% de BSA para obtener una concentración final de 0,46 μM y 14,34 μM de los colorantes fluorescentes, respectivamente.
2. Alícuota 100 μL de la solución de tinción a una placa de Petri de 7 mm con fondo de vidrio no tratada con cultivo de tejidos.
3. A las 24 h después de la incubación con citocinas, transfiera cuidadosamente al menos 6 islotes de cada tratamiento a la placa de Petri con fondo de vidrio. Incubar durante 5 - 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad (cubrir con papel de aluminio).
4. Tome imágenes con microscopía de fluorescencia con un objetivo de inmersión en agua de 40x. Tome imágenes dentro de los 15 minutos posteriores a la tinción de la FDA/PI.
5. Utilice láseres de excitación a 488 nm y 514 nm para detectar las emisiones de fluorescencia de FDA (520 nm) y PI (620 nm), respectivamente.
6. Islotes de imagen como una pila z que consta de tres imágenes, separadas por 10 μm. Visualice solo el 1/3 - 1/2 inferior del islote para reducir la pérdida de señal debido a problemas de dispersión de luz en el islote.
7. Cuente manualmente las células verdes vivas (positivas para la FDA) y las rojas muertas (positivas para PI) en ImageJ (NIH) para al menos 5 islotes por ratón (n = 3). Calcule el porcentaje de muerte celular de la siguiente manera:
   Porcentaje de muerte de islotes = número de células muertas/ (número de células muertas + número de células vivas) x 100%

4. Medición de la apoptosis mediante tinción

1. Agregue 8 μL de YOPRO-1 (solución de 1 mM) a 992 μL de tampón de imagen BMHH para obtener una concentración final de 0,8 μM.
2. Alícuota 500 μL de la solución de tinción a una placa de Petri de 14 mm con fondo de vidrio no tratada con cultivo de tejidos.
3. A las 24 h después de la incubación con citoquinas, transfiera cuidadosamente al menos 6 islotes de cada tratamiento a la placa de Petri con fondo de vidrio e incube durante 1 h a 37 °C en la oscuridad (cubra con papel de aluminio).
4. Después de 20 minutos de incubación, agregue una gota de NucBlue (tinción nuclear, 20 μL) a cada placa de Petri con fondo de vidrio y continúe con la incubación. El tiempo total de incubación es de 1 h para YOPRO-1 y de 40 min para la tinción nuclear.
5. Después de 1 h de incubación, transfiera los islotes a un tampón de imagen BMHH fresco que contenga 0,1% de BSA (100 μL) en una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos sin fondo de vidrio de 7 mm.
6. Tome imágenes con microscopía de fluorescencia con un objetivo de inmersión en agua de 40x. Utilice láseres de excitación a 405 nm y 488 nm para detectar las emisiones de fluorescencia de la tinción nuclear (460 nm) y YOPRO-1 (509 nm), respectivamente.
7. Islotes de imagen como una pila z que consta de tres imágenes, separadas por 10 μm. Visualice solo el 1/3 - 1/2 inferior del islote para reducir la pérdida de señal debido a problemas de dispersión de luz en el islote.
8. Cuente manualmente las células vivas azules (con tinción nuclear positiva) y verde apoptóticas (YOPRO-1 positivas) en ImageJ (NIH) para al menos 5 islotes por ratón (n = 3). Calcule el porcentaje de células de los islotes apoptóticos de la siguiente manera:
   Porcentaje de células de los islotes apoptóticos = número de células apoptóticas / (número de células apoptóticas + número de células vivas) x 100%

5. Medición de la apoptosis con anexina V/tinción nuclear

1. Añadir 2 gotas de tinción nuclear (40 μL) a 1 mL de tampón fijador de anexina. Alícuota 100 μL de la solución en una placa de Petri de 7 mm con fondo de vidrio sin tratamiento con cultivo de tejidos.
2. A las 24 h después de la incubación con citocinas, enjuague cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces al menos 6 islotes de cada tratamiento en PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces con la micropipeta de 10 μl. Transfiera los islotes a la placa de Petri con fondo de vidrio con la solución de tinción nuclear e incube durante 40 minutos a 37 °C en la oscuridad (cúbralos con papel de aluminio).
3. Después de 25 minutos de incubación, agregue 5 μL de anexina V Alexa Flour 488 conjugado a cada placa de Petri con fondo de vidrio y continúe con la incubación. El tiempo total de incubación es de 40 min para la tinción nuclear y de 15 min para la anexina V.
4. Después de 40 minutos de incubación, transfiera los islotes a un tampón de imagen BMHH fresco (sin anexina V ni tinción nuclear) en una placa de Petri con fondo de vidrio de 7 mm.
5. Tome imágenes con microscopía de fluorescencia con un objetivo de inmersión en agua de 40x. Utilice láseres de excitación a 405 nm y 488 nm para detectar las emisiones de fluorescencia de la tinción nuclear (460 nm) y el conjugado de anexina V (515 nm), respectivamente.
6. Islotes de imagen como una pila z que consta de tres imágenes, separadas por 10 μm. Visualice solo el 1/3 - 1/2 inferior del islote para reducir la pérdida de señal debido a problemas de dispersión de luz en el islote.
7. Cuente manualmente las células vivas de azul (tinción nuclear positiva) y verde apoptótica (anexina V positiva) en ImageJ (NIH) para al menos 5 islotes por ratón (n = 3). Calcule el porcentaje de células de los islotes apoptóticos de la siguiente manera:
   Porcentaje de células apoptóticas = número de células apoptóticas / (número de células apoptóticas + número de células vivas) x 100%

6. Medición de la muerte de β células mediante indicador selectivo de Zn²⁺ / tinción nuclear / PI

1. Añada 2 μL de solución madre de Zn²⁺ indicador selectivo a 998 μL de tampón de imagen BMHH para obtener una concentración final de 0,2 μM. Alícuota 500 μL de la solución de tinción a una placa de Petri de 14 mm con fondo de vidrio sin tratamiento de tejido tratada con cultivo de tejidos.
2. A las 24 h después de la incubación con citocinas, transfiera cuidadosamente al menos 6 islotes de cada tratamiento a la placa de Petri con fondo de vidrio. Incubar durante 1 h a 37 °C en la oscuridad con la solución AM con indicador selectivo de Zn²⁺ (cubrir con papel de aluminio).
3. Después de 20 minutos de incubación, agregue una gota de tinte nuclear (20 μl) a cada placa de Petri con fondo de vidrio, según las instrucciones del fabricante y continúe con la incubación. El tiempo total de incubación es de 1 h para el indicador selectivo de Zn²⁺ y de 40 min para la tinción nuclear.
4. Después de 1 h de incubación, transfiera los islotes a un tampón de imagen BMHH fresco que contenga 0,1% de BSA (100 μL) en una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos sin fondo de vidrio de 7 mm. Añadir 2 μL de solución madre PI durante 10 min para obtener una concentración final de 20 μg/mL.
5. Tome imágenes dentro de los 15 minutos posteriores a la tinción PI utilizando microscopía de fluorescencia con un objetivo de inmersión en agua de 40x. Utilice láseres de excitación a 405 nm, 488 nm y 514 nm para detectar las emisiones de fluorescencia de la tinción nuclear (460 nm), el indicador selectivo de Zn²⁺ (516 nm) y PI (620 nm), respectivamente.
6. Islotes de imagen como una pila z que consta de tres imágenes, separadas por 10 μm. Visualice solo el 1/3 - 1/2 inferior del islote para reducir la pérdida de señal debido a problemas de dispersión de luz en el islote.
7. Cuente manualmente las células vivas de azul (tinción nuclear positiva), verde de zinc (Zn²⁺ indicador selectivo positivo) y rojas muertas (PI positivas) en ImageJ (NIH) para al menos 5 islotes por ratón (n = 3). Calcule el porcentaje de muerte de células β de la siguiente manera:
   Porcentaje de muerte de β células = número de células positivas para zinc y PI positivas / (número de células muertas + células de islotes vivas) x 100%
   o
   Porcentaje de muerte de β células = número de células positivas para zinc y PI positivas / (número de células positivas para zinc) x 100%

Se utilizó la tinción dual con FDA e IP para evaluar la viabilidad de los islotes tratados con citocinas. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado (n = 3), y los datos se generaron a partir de múltiples imágenes de pila z de 10 μm de distancia, y cada réplica contenía datos promedio de 5 o 6 islotes, para garantizar la reproducibilidad y la comparación estadística entre los islotes tratados y no tratados. La Figura 1A muestra los isl...

Este estudio demuestra la eficacia de los métodos de tinción múltiple con tintes fluorescentes y la microscopía confocal para evaluar la viabilidad de las células de los islotes, la apoptosis y la supervivencia de las células β bajo estrés inducido por citocinas. La tinción FDA/PI reveló un aumento dependiente de la dosis en la muerte celular dentro de los islotes expuestos a las citocinas, como lo demuestra la fluorescencia roja que marca las células comprometidas con la memb...

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las siguientes subvenciones proporcionaron fondos para este trabajo: premio NIDDK R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B a N.L.F., y ADA 7-20-JDF-020 a N.L.F. Los autores desean agradecer el apoyo del Centro de Investigación de la Diabetes en el Campus P30-DK116073 de la Universidad de Colorado Anschutz y las instalaciones centrales asociadas utilizadas para apoyar este trabajo.