単離された膵島治療とアポトーシス測定

この研究では、細胞死とアポトーシスのマルチ染色蛍光ベースのマーカーを共焦点顕微鏡と組み合わせて使用し、膵島におけるサイトカイン誘発性アポトーシスとβ細胞特異的死を評価します。細胞外刺激に応答した細胞死とアポトーシスの空間的および時間的変化を明らかにします。

この研究では、蛍光染色技術と共焦点顕微鏡法を組み合わせて細胞生存率、アポトーシス、およびβ細胞特異的死を評価するために、膵島、特にインスリン産生β細胞に対する炎症誘発性サイトカインの影響を調査します。単離されたマウス膵島は、1型糖尿病の発症時に免疫介在性アポトーシスを模倣するために、TNF-α、IL-1β、IFN-γなどのさまざまな濃度のサイトカインカクテルで処理されました。膵島細胞の生存率は、FDA/PIデュアル染色で評価され、FDAのフルオレセインへの変換は生存細胞を示し、PIは膜損傷細胞をマークしました。YOPRO-1と核染色はアポトーシスに関する追加データを提供し、Annexin-Vは初期のアポトーシス細胞を確認しました。定量分析により、サイトカイン処理された膵島におけるアポトーシスと細胞死率の有意な増加が明らかになりました。β細胞への影響を特異的に評価するために、Zn²⁺ 選択的インジケーター染色を使用して、インスリン顆粒中の亜鉛会合を通じてインスリン産生細胞を標識し、炎症誘発性サイトカインで膵島を24時間処理した後、β細胞の大幅な損失を明らかにしました。これらのマルチ染色プロトコルは、サイトカイン誘発性膵島における損傷の程度を効果的に捕捉し、定量化し、初期の1型糖尿病におけるβ細胞アポトーシスを予防するように設計された治療法の評価に使用できます。

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、膵臓内にある内分泌細胞の集まりです。インスリン産生β細胞は、膵島で最も豊富で機能的に重要な成分です。これらのβ細胞は、グルコースの恒常性を維持する上で重要な役割を果たすホルモンであるインスリンを分泌します¹。1型糖尿病(T1D)では、免疫系が膵島を標的にして浸潤し、インスリン産生β細胞を破壊します。この自己免疫攻撃は、主にインターロイキン-1β(IL-1β)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターフェロンガンマ(IFN-γ)²などの炎症誘発性サイトカインによって媒介されます。これらのサイトカインは、β細胞内で一連のシグナル伝達イベントを開始し、最終的にアポトーシス³を引き起こします。アポトーシス(プログラムされた細胞死)は、カスパーゼの活性化、DNA断片化、細胞崩壊など、厳密に制御されたプロセスです。これは、T1D³の発症中にβ細胞の質量と機能が徐々に失われる原因となります。

β細胞アポトーシスを促進する分子メカニズムを理解することは、T1Dにおけるβ細胞破壊を予防または軽減する戦略を特定するために重要です。これを達成するために、実験モデルまたはヒトの死体から単離された膵島は、β細胞病理を研究するための堅牢で確立されたモデルシステムとして機能します^2,3。これらの単離された膵島を炎症誘発性サイトカインで処理することにより、研究者は初期のT1Dを特徴付ける環境を再現することができ、β細胞の機能不全とin vitroでの死の詳細な研究が可能になります^4,5。これらの実験は、疾患関連条件下でのβ細胞の脆弱性と生存に関する重要な洞察を提供するとともに、サイトカイン誘発性アポトーシスからβ細胞を保護または救出することを目的とした治療的介入をテストするためのプラットフォームとしても機能します。このin vitroシステムを利用することで、異なる種の膵島がさまざまな条件にどのように応答するかを効果的に解析することができ、種間の機能的およびアポトーシス的な変動をより深く理解することができます。

これまでの研究では、マウス由来のサイトカインとヒト由来のサイトカインをそれぞれカクテル(1x = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β、100 ng/mL IFN-γ)で24時間処理すると、膵島細胞が有意に死滅することが示されている^4,5,6。サイトカイン処理した細胞をフルオレセインジアセテート(FDA)およびヨウ化プロピジウム(PI)^5,6で染色することにより、膵島の生存率を確認しました。世界的に、膵島の生存率は、FDAおよび^PI7に準拠した標準的なデオキシリボ核酸(DNA)結合色素排除技術を使用して評価されています。蛍光染色剤または色素標識基質は、膜の完全性と透過性に基づいて細胞の生存率を評価します。細胞透過性色素であるFDAは、生細胞によって緑色蛍光(フルオレセイン)に変換されます。対照的に、細胞不透過性色素であるPIは、膜が損なわれた死細胞の核のみを染色します⁷。次に、細胞を共焦点顕微鏡で2色イメージングして分析し、緑色と赤色の蛍光灯がそれぞれ生存細胞と死細胞をマークします。

FDA/PI染色プロトコルの限界は、PIが膜選択性を失った細胞にのみ侵入するため、初期のアポトーシス細胞を区別できないことです。さらに、この方法では細胞サブセットを区別できないため、β細胞の生存率を選択的に評価するのには適していません。アネキシンV / PIプロトコルは、アポトーシス細胞の研究に一般的に使用され、プロトコルはその精度を向上させるために変更されています⁸。アポトーシスの初期段階には、原形質膜の内層から外層へのホスファチジルセリンの転座が含まれます。カルシウム依存性タンパク質であるアネキシンVは、この曝露されたホスファチジルセリンに高い親和性で結合します。アポトーシス細胞(アネキシンV陽性のみ)と壊死細胞(アネキシンV陽性のみ)を区別するために、アネキシンVによるPIによる染色が行われます。これは、壊死細胞は膜の完全性が損なわれているためにホスファチジルセリンも示します⁹。YOPRO-1などの他の色素も、膵島細胞のアポトーシスを定量するために使用されます。生細胞の細胞膜は、アポトーシスを受けている生細胞を定量化できないアネキシンVとは異なり、YOPRO-1に対して不透過性です。

膵臓β細胞死を評価するには、インスリン産生細胞のみを標的とする特異的な色素が必要です。膵臓β細胞の明確な特徴は、細胞内Zn²⁺の一部がZn²⁺-インスリン複合体(2:1比)として小胞に貯蔵されていることである¹⁰。遊離Zn²⁺は、リザーバーとしてβ細胞の周りの粒外空間にも存在します。分泌顆粒中のインスリンに緩く結合した遊離Zn²⁺およびZn²⁺は、亜鉛結合色素を用いて可視化することができます。ジンク結合性色素であるジチゾンは、膵島の純度を評価するために一般的に使用されますが、β細胞の生存率と機能を評価するために使用される蛍光色素と組み合わせることはできません¹¹。Zn²⁺に対して高い選択性を持つTSQやZinquinのようなUVプローブは、遊離細胞内Zn²⁺のイメージングと測定によりβ細胞を定量するために開発されました^。12,13.しかし、それらの使用は、溶解性が悪いこと、細胞負荷が不均一であること、UV励起要件、および酸性小胞¹⁴への区画化によって制限されている。ニューポートグリーンやZn²⁺選択的インジケーターなどの可視波長蛍光プローブも、これらの制限を克服するために開発され、現在、単離されたヒト膵島^15,16のβ細胞を検出するために広く使用されています。FluoZin-3(Zn²⁺選択的指標)は、ニューポートグリーンよりも高いZn²⁺親和性と優れた量子収率を有し、単離された島^14,17でインスリンと共放出されたZn²⁺のイメージングに効果的であることが証明されています。

FDA、PI、アネキシンV、YOPRO-1、Zn²⁺ 選択的インジケーターなどの蛍光色素を使用することで、生細胞、アポトーシス細胞、および全死細胞の測定と鑑別が可能になります。適合する高選択性プローブを組み合わせることで、糖尿病研究や医薬品開発におけるβ細胞破壊の理解と軽減に不可欠な、β細胞生存率とアポトーシスの評価と定量化のための標的法も提供されます。

マウスを用いたすべての実験は、コロラド大学デンバー校の動物管理および使用委員会(Protocols 000929)によって承認されました。この実験に使用したC57Bl/6マウスは、ジャクソン研究所から購入し、12時間の明暗サイクルの温度制御施設に収容し、餌と水を自由に利用できるようにしました。単離されたマウス膵島は、以前に報告されたコラゲナーゼ消化プロトコルを使用して取得されました^5,18。

1.溶液と培地の調製

注:培地、サイトカインストック、およびその他の試薬は、滅菌条件下で調製する必要があります。

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、10,000 U/mLペニシリン、および10,000 μg/mLストレプトマイシンを500 mLの1640 RPMI培地に添加して、膵島培養培地を調製します。
2. 1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4を調製します。0.1% ウシ血清アルブミン(BSA)を含む滅菌 PBS 中のマウスサイトカインカクテル、10 μg/mL TNF-α 10μg/mL、5 μg/mL IL-1β、および 100 μg/mL IFN-γ の 1000x ストック溶液を調製し、溶液を 10 μL アリコートで -20 °C で保存します。
3. アセトンに溶かした46 μM(50x)のFDAストック溶液を調製し、1 mLアリコートに-20°Cで保存します。 1.434 mM(50x)PIストック溶液をPBSに調製し、1 mLアリコートに4°Cで保存します。
4. 500 mLの重炭酸塩修飾Krebs-Henseleit HEPES(BMHH)緩衝液500 mLを、125 mM NaCl、5.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM MgCl₂、および10 mM HEPESを含む500 mLの重炭酸塩修飾Krebs-Henseleit HEPES(BMHH)バッファー500 mLを調製し、500 mLのdH₂Oに調製します。
5. 100 mLのdH₂O中に10 mM HEPES、140 mM NaCl、および2.5 mM CaCl₂を入れた100 mLのAnnexin-V結合緩衝液を調製し、pHを7.4に調整します。
6. 1mM Zn²⁺ 選択的インジケーターストック溶液をDMSOに調製し、-20°Cで10μLアリコートで保存します。
   注:蛍光色素は光に敏感であるため、保管とインキュベーションは暗闇で行う必要があります。

2. 単離された膵島のサイトカインによる治療

1. 10 μLのマイクロピペットでマウス膵島を培養培地に単離し、37°Cおよび5%CO₂ で一晩インキュベートして、サイトカインで処理する前に単離ストレスから回復します。
2. 滅菌した膵島培養培地2 mLを35 mmの非組織培養シャーレに添加し、適切に標識して、サイトカイン処理済みディッシュとサイトカインなしの未処理ディッシュを区別します。
3. サイトカイン処理した皿の場合は、6 μL の培地を取り出し、ストック溶液から各サイトカインを 2 μL と交換して、10 ng/mL、5 ng/mL IL-1β、および 100 ng/mL IFN-γ (1x RCC) の最終相対サイトカイン濃度を得ます。
   注:0.5倍および0.1倍の低いRCCは、0.1%BSAを含む滅菌PBSでストック溶液をそれぞれ1:1および1:9で希釈することにより調製できます。
4. 分離後12時間〜24時間で、光学顕微鏡下のマイクロピペットを使用して10〜20個の島をピックアップし、皿に移し、加湿した37°C、5%_CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
   注:インキュベーション時間は、特定の実験目的によって異なる場合があります。

3. FDA/PIによる膵島の生存率測定

1. 0.1% BSAを含むBMHHバッファー960 μLに、FDAストック溶液とPIストック溶液をそれぞれ20 μL加えると、最終濃度はそれぞれ0.46 μMおよび14.34 μMの蛍光色素が得られます。
2. 染色液100 μLを7 mmのガラス底非組織培養処理シャーレに分注します。
3. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、各処理から少なくとも6つの小島をガラス底のペトリ皿に慎重に移します。暗所で室温で5〜10分間インキュベートします(ホイルで覆います)。
4. 40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。FDA/PI染色後15分以内に画像を撮影してください。
5. 488 nmと514 nmの励起レーザーを使用して、それぞれFDA(520 nm)とPI(620 nm)の蛍光発光を検出します。
6. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
7. ImageJ(NIH)で、マウスあたり少なくとも5つの島(n = 3)について、生きた緑色(FDA陽性)および死死(PI陽性)細胞を手動でカウントします。細胞死の割合を次のように計算します。
   膵島死の割合 = 死細胞数/(死細胞数 + 生細胞数) x 100%

4. 染色法によるアポトーシス測定

1. 8 μLのYOPRO-1(1 mM溶液)を992 μLのBMHHイメージングバッファーに加えて、最終濃度を0.8 μMにします。
2. 染色液500 μLを14 mmのガラス底非組織培養処理シャーレに分注します。
3. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、各処理の少なくとも6つの膵島をガラス底のペトリ皿に慎重に移し、暗所で37°Cで1時間インキュベートします(ホイルで覆います)。
4. 20分間のインキュベーション後、NucBlue(核染色剤、20 μL)を各ガラス底シャーレに一滴加え、インキュベーションを続けます。総インキュベーション時間は、YOPRO-1では1時間、核染色では40分です。
5. インキュベーションの1時間後、7 mmガラス底の非組織培養処理シャーレ中の0.1% BSA(100 μL)を含む新鮮なBMHHイメージングバッファーに膵島を移します。
6. 40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。405 nmと488 nmの励起レーザーを使用して、それぞれ核染色(460 nm)とYOPRO-1(509 nm)の蛍光発光を検出します。
7. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
8. ImageJ(NIH)で、生きた青色(核染色陽性)およびアポトーシス緑色(YOPRO-1陽性)細胞を、マウスあたり少なくとも5つの島(n = 3)について手動でカウントします。アポトーシス膵島細胞の割合を次のように計算します。
   アポトーシス膵島細胞の割合 = アポトーシス細胞数 / (アポトーシス細胞数 + 生細胞数) x 100%

5. アネキシンV/核染色によるアポトーシス測定

1. 2滴の核染色剤(40 μL)を1 mLのアネキシン結合バッファーに加えます。溶液100μLを7 mmガラス底の非組織培養処理シャーレに分注します。
2. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、PBSの各処理から少なくとも6つの島を3回ピペッティングして、10μlのマイクロピペットを使用して3回ピペッティングして慎重にすすぎます。膵島を核染色液を入れたガラス底のシャーレに移し、暗所で37°Cで40分間インキュベートします(ホイルで覆います)。
3. 25分間のインキュベーション後、各ガラス底シャーレに5 μLのAnnexin V Alexa Flour 488コンジュゲートを加え、インキュベーションを続けます。総インキュベーション時間は、核染色で40分、アネキシンVで15分です。
4. インキュベーションの40分後、7 mmガラス底シャーレ内の新鮮なBMHHイメージングバッファー(Annexin Vまたは核染色なし)に膵島を移します。
5. 40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。405 nmと488 nmの励起レーザーを使用して、それぞれ核染色(460 nm)とアネキシンVコンジュゲート(515 nm)の蛍光発光を検出します。
6. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
7. ImageJ(NIH)で、生きた青色細胞(核染色陽性)およびアポトーシス緑色細胞(アネキシンV陽性)を、マウスあたり少なくとも5個の島(n = 3)について手動でカウントします。アポトーシス膵島細胞の割合を次のように計算します。
   アポトーシス細胞の割合 = アポトーシス細胞数 / (アポトーシス細胞数 + 生細胞数) x 100%

6. Zn²⁺ 選択的指示薬/核染色/PIを用いたβ細胞死測定

1. 2 μL の Zn²⁺ 選択的インジケーター AM ストック溶液を 998 μL の BMHH イメージングバッファーに加え、最終濃度を 0.2 μM にします。14 mm のガラス底非組織培養処理シャーレに 500 μL の染色溶液を分注します。
2. サイトカインとのインキュベーション後24時間で、各処理から少なくとも6つの小島をガラス底のペトリ皿に慎重に移します。暗所でZn²⁺ 選択的インジケーターAM溶液(ホイルで覆う)を使用して、暗所で1時間インキュベートします。
3. 20分間のインキュベーション後、製造元の指示に従って、各ガラス底のシャーレに核染色剤(20 μl)を1滴加え、インキュベーションを続けます。総インキュベーション時間は、Zn²⁺ 選択的インジケーターで1時間、核染色で40分です。
4. インキュベーションの1時間後、7 mmガラス底の非組織培養処理シャーレ中の0.1% BSA(100 μL)を含む新鮮なBMHHイメージングバッファーに膵島を移します。PIストック溶液2 μLを10分間加えて、最終濃度を20 μg/mLにします。
5. PI染色後15分以内に、40倍水浸対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影します。405 nm、488 nm、514 nmの励起レーザーを使用して、それぞれ核染色(460 nm)、Zn²⁺ 選択的インジケーター(516 nm)、PI(620 nm)の蛍光発光を検出します。
6. 10 μm 間隔の 3 つの画像で構成される z スタックとしての画像島。小島の底部の1/3〜1/2のみを画像化して、小島の光散乱の問題による信号の損失を減らします。
7. ImageJ(NIH)で、生きた青色(核染色陽性)、亜鉛緑色(Zn²⁺ 選択的インジケーター陽性)、および死んだ赤色(PI陽性)の細胞を、マウスあたり少なくとも5つの島(n = 3)について手動でカウントします。β細胞死の割合を次のように計算します。
   β細胞死の割合=亜鉛陽性細胞およびPI陽性細胞の数/(死細胞+生膵島細胞の数)x 100%
   又は
   β細胞死の割合=亜鉛陽性細胞およびPI陽性細胞の数/(亜鉛陽性細胞の数)×100%

FDAとPIによる二重染色は、サイトカインで処理された膵島の生存率を評価するために使用されました。すべての実験はトリプリケート(n = 3)で実施され、データは10 μm離れた複数のzスタック画像から生成され、各反復には5つまたは6つの島からの平均データが含まれていました。 図1A は、酵素活性細胞によるFDAのフルオレセインへの変換により?...

この研究は、サイトカイン誘発ストレス下での膵島細胞の生存率、アポトーシス、およびβ細胞生存の評価における蛍光色素と共焦点顕微鏡法によるマルチ染色法の有効性を示しています。FDA/PI染色では、サイトカインに曝露された膵島内での細胞死が用量依存的に増加していることが明らかになり、膜損傷細胞をマーキングする赤色蛍光によって明らかなように、?...

著者には、開示すべき利益相反はありません。

この作業には、NIDDK賞R01 DK137221、N.L.F.へのJDRF 3-SRA-2023-1367-S-B、およびN.L.F.へのADA 7-20-JDF-020の助成金が提供されました。著者らは、コロラド大学アンシュッツキャンパスP30-DK116073の糖尿病研究センターからの支援と、この研究を支援するために利用された関連コア施設に感謝したいと思います。