Восстановление клеток трофобласта с помощью анализа ангиогенеза-образования трубок для анализа экспрессии маркеров дифференцировки

Настоящий протокол позволяет восстанавливать трубчатые структуры, образованные в классическом анализе ангиогенеза in vitro , где клетки, такие как клетки трофобласта, организуются в капилляроподобные структуры поверх слоя матрикса внеклеточной базальной мембраны. Восстановленные структуры используются для выделения РНК и белков для различных биохимических анализов.

Во время развития плаценты экстраворсинчатые клетки трофобласта (EVT) проникают в материнский децидуальный мозг для ремоделирования спиральных артерий матки в процессе мезенхимального перехода к эндотелиальному. Традиционно этот процесс оценивается с помощью анализа формирования трубок in vitro, где клетки организуются в трубчатые структуры при посеве на полимеризованный препарат базальной мембраны. Несмотря на то, что на микрофотографиях структур можно измерить некоторые структурные особенности, для оценки реальной приверженности ЭВТ к фенотипу эндотелиального типа требуется биохимический анализ клеточных экстрактов. Соскоб клеток из чашки для культивирования для получения РНК и/или белковых экстрактов не является альтернативой, поскольку трубчатые структуры сильно загрязнены массой белков из полимеризованной базальной мембраны. Таким образом, необходима стратегия отделения клеток от белков базальной мембраны до получения клеточных экстрактов. Здесь представлен простой, быстрый и экономически эффективный метод восстановления трубчатых структур из анализа формирования трубок in vitro и последующего анализа с помощью биохимических методов. Трубчатые структуры, образованные клетками HTR8/SVneo, клеточной линией EVT, были освобождены от полимеризованной базальной мембраны путем короткой инкубации с PBS с добавлением этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). После серийных промывок можно получить готовую к применению гранулу очищенных трубчатых структур. Эта гранула может быть впоследствии переработана для получения РНК и белковых экстрактов. Анализ количественной ПЦР показал индуцированную экспрессию VE-кадгерина и альфа-v-интегрина, двух маркеров эндотелиальных клеток, в трубчатых структурах, полученных от EVT, по сравнению с контрольными клетками, что согласуется с индукцией маркера эндотелиальных клеток, CD31, оцениваемой с помощью иммунофлюоресценции. Вестерн-блоттинг белковых экстрактов трубчатых структур выявил сверхэкспрессию RECK в трансфицированных клетках HTR8/SVneo. Таким образом, этот простой метод позволяет получать клеточные экстракты из анализа формирования пробирок in vitro для последующего анализа РНК и экспрессии белков.

Успех беременности зависит от правильного развития плаценты и налаживания плацентарного кровообращения. Одним из ключевых событий, связанных с этим процессом, является ремоделирование спиральных артерий матки (uSA)¹ из кровеносных сосудов с высоким сопротивлением и низким потоком в кровеносный сосуд с низким сопротивлением и высоким потоком, увеличивая перфузию материнской крови в плаценту².

Ремоделирование uSA достигается за счет специализированных клеток трофобласта, полученных из бластоцисты. После имплантации эмбриона экстраворсинозный трофобласт плода (ЭВТ) мигрирует из места имплантации через децидуальную мышцу матери и матку в направлении uSA³. Оказавшись там, ЭВТ индуцируют миграцию и апоптоз материнских сосудистых гладкомышечных клеток (VSMC) и эндотелиальных клеток (EC)⁴. Впоследствии EVT приобретают эндотелиальноподобный фенотип через мезенхимальный переход в эндотелиальноподобный (MELT)^5,6, замещая VSMC и EC сосуда⁷.

Преэклампсия (ТЭЛА) – это специфический для беременности синдром, характеризующийся возникновением материнской гипертензии, сопровождающейся протеинурией и/или другими симптомами дисфункции материнских конечных органов, определяемый с^20-й недели беременности⁸. Хотя точная этиология ТЭЛА до конца не изучена, наиболее распространенная гипотеза связана с дефектным ремоделированием uSA9, вызывающим постоянное состояние недостаточного притока крови к плаценте, сопровождающееся повреждением плаценты ишемией-реперфузией, гипоксией и окислительным стрессом, активирующим высвобождение плацентарных факторов в материнский кровоток, вызывая характерные материнские симптомы ТЭЛА⁹. Таким образом, крайне важно определить ключевые клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в ремоделировании uSA клетками трофобласта.

Оценка MELT EVT классически достигается с помощью анализа формирования трубки in vitro на основе базальной мембраны¹⁰, с помощью которого отдельные клетки мигрируют и организуются в двумерные структуры, напоминающие кровеносные сосуды. Этот протокол требует посева клеточных линий EVT на тонкий слой полимеризованного внеклеточного матрикса, обычно называемого матриксом базальной мембраны, который представляет собой коммерчески доступный внеклеточный матрикс, состоящий из солюбилизированной базальной мембраны, выделенной из саркомы мышей Энгельбрет-Холм-Рой, обогащенной ламинином, а также коллагена IV, протеогликанов сульфата гепарана и энтактина/нидогена¹⁰. Анализ сформированных трубчатых структур обычно достигается путем идентификации установленных характеристик на микрофотографиях (например, количества ветвей или индекса сетки) и их количественной оценки с помощью программного обеспечения ImageJ (плагин анализатора ангиогенеза)¹¹. Хотя этот метод широко используется для описания формирования трубчатых структур ^12,13,14, он ограничен характеристикой организации клеток, так как собрать эти структуры для биохимического анализа не представляется возможным 12,13,14, в основном из-за невозможности отделить клетки/трубки от матрицы базальной мембраны, которая содержит большое количество различных белков. Таким образом, определить реальный вклад белков клеточного происхождения не представляется возможным, что необходимо для правильного понимания экспрессии клеточных белков. Поскольку большая часть белков в этих экстрактах поступает из матрицы базальной мембраны, представленность клеточных белков оказывается очень низкой, поэтому большое количество белков должно быть загружено в гель SDS-страницы для анализа методом вестерн-блоттинга, что влияет на разрешение и перенос белков. Сделать правильный анализ практически невозможным. Этот избыток белков, полученных из базальной мембраны, также оказывает глубокое влияние на экстракцию РНК с требуемой чистотой для дальнейшего анализа.

В этом отчете мы описываем простой, быстрый и экономически эффективный метод, основанный на обработке PBS-EDTA, который позволяет высвобождать трубчатые структуры из матрицы базальной мембраны, которые могут быть обработаны для биохимического анализа клеточных экстрактов. Этот метод позволяет получить большое количество биомолекул, РНК и белков и совместим с классическим биохимическим анализом, количественной ПЦР и вестерн-блоттингом. Мы предполагаем, что эта стратегия может быть применима к другим анализам, таким как субклеточное фракционирование, определение эпигенетических маркеров методом пиросеквенирования или анализы иммунной преципитации хроматина. Вкратце, протокол состоит из инкубации трубчатых структур в чашке для культивирования с PBS с добавлением 50 мМ ЭДТА при 4 °C для растворения матрицы базальной мембраны. При такой простой инкубации трубчатые структуры остаются в суспензии, которая после серии промывок PBS для устранения ЭДТА и избытка разбавленной матрицы базальной мембраны может быть получена в виде готовых к использованию гранул трубчатых структур и/или отдельных клеток. В последующих разделах описываются протоколы анализа MELT и восстановления трубчатых структур.

1. Подготовка к анализу

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны проводиться в стерильных условиях. Все пластиковые материалы должны быть стерильными и абсолютно новыми. Стеклянные бутылки должны быть стерилизованы методом автоклавирования. Все материалы должны быть стерилизованы 70% раствором этанола перед их использованием в ламинарном шкафу. Минимальная клеточная культуральная среда (RPMI) должна быть стерилизована путем фильтрации с фильтром 0,22 мкМ перед добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS). При работе с биологически опасными отходами всегда надевайте средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, длинные волосы, завязанные назад и т.д.).

1. Приготовьте среду RPMI-1640 (5% полной питательной среды FBS) путем добавления стерилизованных RPMI 1640 и FBS в стерильную стеклянную бутылку в ламинарном шкафу. Для 5% раствора FBS добавьте 190 мл RPMI-1640 и 10 мл FBS. Нагрейте RPMI-1640 Media-5% FBS на водяной бане с регулируемой температурой до 37 °C.
2. Подготавливают матрицу базальной мембраны следующим образом. Медленно разморозьте матрицу базальной мембраны, поместив бутылку при температуре 4 °C на 3-4 часа, и охладите чашку MW-6 до -20 °C в течение 1 часа перед использованием. После размораживания поддержите матрицу базальной мембраны на льду. В ламинарном шкафу разбавить матрицу базальной мембраны до 70% ледяным RPMI1640 без FBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица базальной мембраны должна храниться при температуре -80 °C до использования. После размораживания все необходимо обработать при температуре 4 °C, чтобы избежать преждевременной полимеризации матрицы.
3. Приготовьте PBS-EDTA, растворив соответствующее количество ЭДТА в PBS до конечной концентрации 50 мМ ЭДТА. Поддерживайте PBS-EDTA на уровне 4 °C.

2. Анализ формирования трубок

1. Добавьте 60 мкл/^см2 разбавленной матрицы базальной мембраны, как указано на шаге 1.2. к посуде. Избегайте образования пузырьков, которые мешают получению микрофотографии, необходимой для количественной оценки трубчатых структур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае мультилунки-6 (MW6, площадью 9,6^см2) объем составляет 580 мкл матрицы базальной мембраны -70%.
2. Перенесите чашки с базальной мембранной матрицей в клеточный инкубатор (5%_CO2 и 37 °C) на 2 ч, чтобы стимулировать полимеризацию базальной мембраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение последнего 1 часа полимеризации приготовьте клеточную суспензию клеток, которые будут использоваться для анализа, с целью завершения 2 часов полимеризации, когда клетки будут готовы к посеву.
3. Засейте 80 000 клеток/^см2 HTR8/SVneo (клеточная линия EVTs), разведенных в 2 мл RPMI-1640-5% FBS, на полимеризованную матрицу базальной мембраны, а также на чашки без покрытия в качестве контроля. Осторожно засейте клетки вдоль стенки лунки, чтобы избежать разрушения матрицы базальной мембраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте равномерное распределение клеток по матригелю, в противном случае пробирки не будут образовываться в областях, где меньше клеток или где клетки переполнены.
4. Перенесите высеянные клетки в клеточный инкубатор и культивируйте в течение 12 ч, 24 ч и 48 ч при 5%_CO2 и 37 °C.
   Примечание: Обычно для анализа структуры канальцев достаточно 24 часов, однако, если требуется экспрессия кинетического белка или РНК во время этого процесса, инкубируйте клетки в течение: 3 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч.

3. Восстановление клеток из матрикса базальной мембраны

1. По достижении выбранного времени инкубации (например, 12 ч, 24 ч, 48 ч) восстановите кондиционированную среду и выполните на ней измерения по выбору.
2. Аккуратно промойте клетки ледяным 1x PBS, не менее 3x для удаления клеточного мусора. Если нужны микрофотографии, налейте в каждую лунку по 1 мл холодного PBS и сделайте снимки в течение 10 минут.
3. Удалите PBS и добавьте 700 μL PBS-EDTA в каждую лунку и инкубируйте пластину на льду в течение 3-5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBS-EDTA растворит матрицу базальной мембраны, поэтому вся клеточная сеть останется во взвешенном состоянии.
4. Аккуратно восстановите суспензию трубчатой сетки с помощью микропипетки (p1.000) в пробирке объемом 1,5 мл.
5. Центрифугируйте суспензию при давлении 1 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. В конце должна быть видна белая гранула клеток.
6. Выводите надосадочную жидкость путем выворачивания трубки, стараясь оставить ее как можно более сухой.
7. Добавьте 1 мл PBS при температуре 4 °C и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью микропипетки p.1000 для промывания клеток и удаления растворенной матрицы базальной мембраны и ЭДТА. Повторите не менее 2 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы мойки имеют решающее значение. Оставшаяся матрица базальной мембраны может наблюдаться в виде вязкого слоя над клеточной гранулой. Повторяйте промывки до тех пор, пока большая часть слоя матрицы базальной мембраны не будет устранена.
8. После окончательной промывки используйте клеточную гранулу непосредственно для экстракции белка или РНК. В качестве альтернативы можно повторно суспендировать гранулу в 1 мл PBS и распределить по разным пробиркам, в зависимости от требований: например, 300 мкл для экстракции РНК и оставшиеся 700 мкл для экстракции белка и т. д.
9. Центрифугируйте пробирки при давлении 1 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для получения клеточной гранулы.
   Деление клеточной суспензии в PBS может быть в желаемом соотношении, например, 1:1, 1:2 или 1:3 к РНК:белок. Здесь используется соотношение 1:2 РНК:белки. На этом этапе храните гранулы ячеек, если они не нужны немедленно, как можно суше, при температуре -80 °C до месяца.

Чтобы оценить протокол, описанный в этом отчете, сначала мы сгенерировали трубчатые структуры. Как показано на рисунке 1A, клетки HTR8/SVneo (EVT) генерировали трубчатые структуры за 12 ч, 24 ч и 48 ч инкубации над матриксом базальной мембраны. Трубчатые структуры...

Трубчатый анализ образования является широко используемым инструментом для оценки взаимодействия между клетками в ангиогенных процессах¹⁹. Здесь мы описываем ангиогенные свойства неэндотелиальных клеток, таких как ЭВТ, в ремоделировании сосудистых со?...

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источник финансирования FONDECYT 1221362, ANID, для JG. Convocatoria Nacional Subvención a la Instalación en la Academia, ANID, No. SA77210087 для ICW.