Recupero delle cellule del trofoblasto dall'angiogenesi - Saggio di formazione di provette per l'analisi dell'espressione del marcatore di differenziazione

Il presente protocollo consente il recupero di strutture tubolari formate nel classico saggio di angiogenesi in vitro di formazione di tubi in cui le cellule, come le cellule del trofoblasto, si organizzano in strutture capillari su uno strato di matrice di membrana basale extracellulare. Le strutture recuperate vengono utilizzate per l'isolamento di RNA e proteine per varie analisi biochimiche.

Durante lo sviluppo della placenta, le cellule del trofoblasto extravilloso (EVT) invadono la decidua materna per rimodellare le arterie spirali uterine attraverso un processo di transizione da mesenchimale a endoteliale. Tradizionalmente, questo processo viene valutato mediante un saggio di formazione di tubi in vitro , in cui le cellule si organizzano in strutture simili a tubi quando vengono seminate su una preparazione di membrana basale polimerizzata. Sebbene diverse caratteristiche strutturali possano essere misurate nelle fotomicrografie delle strutture, per valutare il reale impegno dell'EVT nel fenotipo di tipo endoteliale, è necessaria l'analisi biochimica degli estratti cellulari. Raschiare le cellule dalla piastra di coltura per ottenere RNA e/o estratti proteici non è un'alternativa poiché le strutture tubolari sono gravemente contaminate dalla maggior parte delle proteine della membrana basale polimerizzata. Pertanto, è necessaria una strategia per separare le cellule dalle proteine della membrana basale prima della preparazione degli estratti cellulari. Qui viene presentato un metodo semplice, veloce ed economico per recuperare le strutture tubolari dal saggio di formazione del tubo in vitro e dalla successiva analisi con tecniche biochimiche. Le strutture tubolari formate da cellule HTR8/SVneo, una linea cellulare EVT, sono state liberate dalla membrana basale polimerizzata mediante una breve incubazione con PBS integrato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Dopo lavaggi seriali, è possibile ottenere un pellet pronto all'uso di strutture tubolari purificate. Questo pellet può essere successivamente lavorato per ottenere estratti di RNA e proteine. L'analisi qPCR ha evidenziato l'espressione indotta di VE-caderina e alfa_v-integrina, due marcatori di cellule endoteliali, in strutture tubolari derivate da EVT rispetto alle cellule di controllo, che era coerente con l'induzione del marcatore di cellule endoteliali, CD31, valutato mediante immunofluorescenza. L'analisi Western blot degli estratti proteici delle strutture tubolari ha rivelato la sovraespressione di RECK nelle cellule HTR8/SVneo trasfettate. Pertanto, questo semplice metodo consente di ottenere estratti cellulari dal saggio di formazione di provette in vitro per la successiva analisi degli RNA e dell'espressione proteica.

Il successo di una gravidanza dipende dal corretto sviluppo della placenta e dall'instaurazione della circolazione placentare. Uno degli eventi chiave associati a questo processo è il rimodellamento delle arterie spirali uterine (uSA)¹, da un vaso sanguigno ad alta resistenza e basso flusso a un vaso sanguigno a bassa resistenza e alto flusso, aumentando la perfusione del sangue materno nella placenta².

Il rimodellamento dell'uSA è ottenuto da cellule specializzate del trofoblasto derivate dalla blastocisti. Dopo l'impianto dell'embrione, il trofoblasto fetale extravilloso (EVT) migra dal sito di impianto attraverso la decidua materna e l'utero verso l'uSA³. Una volta lì, le EVT inducono la migrazione e l'apoptosi delle cellule muscolari lisce associate al vascolare materno (VSMC) e delle cellule endoteliali (EC)⁴. Successivamente, le EVT acquisiscono un fenotipo endoteliale attraverso una transizione da mesenchima a endoteliale (MELT)^5,6, sostituendo la VSMC e l'EC del vaso⁷.

La preeclampsia (EP) è una sindrome specifica della gravidanza caratterizzata dall'insorgenza di ipertensione materna, accompagnata da proteinuria e/o altri sintomi di disfunzione d'organo terminale materna, determinata a partire dalla 20a^{settimana di} gestazione⁸. Sebbene l'eziologia precisa dell'EP non sia completamente compresa, l'ipotesi più accettata si riferisce a un rimodellamento difettoso dell'uSA⁹, che genera uno stato permanente di flusso sanguigno insufficiente alla placenta, accompagnato da danno placentare da ischemia-riperfusione, ipossia e stress ossidativo, attivando il rilascio di fattori placentari nella circolazione materna, innescando i sintomi materni caratteristici dell'EP⁹. Pertanto, è fondamentale determinare i principali meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nel rimodellamento dell'uSA da parte delle cellule del trofoblasto.

La valutazione della MELT delle EVT è classicamente ottenuta con il saggio in vitro ¹⁰ di formazione di provette della matrice della membrana basale, mediante il quale le singole cellule migrano e si organizzano in strutture bidimensionali che assomigliano a vasi sanguigni. Questo protocollo richiede la semina di linee cellulari EVTs su un sottile strato di matrice extracellulare polimerizzata, solitamente indicata come matrice di membrana basale, che è una matrice extracellulare disponibile in commercio composta da una membrana basale solubilizzata estratta dal sarcoma del topo di Engelbreth-Holm-Swarm, arricchita da Laminina, nonché da Collagene IV, proteoglicani eparan solfato ed entactina/nidogeno¹⁰. L'analisi delle strutture tubolari formate si ottiene solitamente mediante l'identificazione delle caratteristiche stabilite nelle micrografie fotografiche (ad esempio, il numero di rami o l'indice di mesh) e la quantificazione di queste mediante il software ImageJ (Angiogenesis analyzer plugin)¹¹. Sebbene questo metodo sia ampiamente utilizzato per descrivere la formazione delle strutture tubolari 12,13,14, esso si limita alla caratterizzazione dell'organizzazione delle cellule, poiché non è possibile raccogliere queste strutture per l'analisi biochimica 12,13,14, in gran parte a causa dell'impossibilità di separare le cellule/tubi dalla matrice della membrana basale, che contiene un'elevata quantità di proteine diverse. Pertanto, non è possibile determinare il reale contributo delle proteine derivate dalle cellule, che è necessario per comprendere correttamente l'espressione delle proteine cellulari. Poiché la maggior parte delle proteine in questi estratti proverrebbe dalla matrice della membrana basale, la rappresentazione delle proteine cellulari risulta essere molto bassa, quindi una grande quantità di proteine deve essere caricata in un gel SDS-page per l'analisi mediante Western blot, influenzando la risoluzione e il trasferimento delle proteine. Rendendo quasi impossibile un'analisi corretta. Questo eccesso di proteine derivate dalla matrice della membrana basale influisce profondamente anche sull'estrazione dell'RNA con la purezza richiesta per ulteriori analisi.

In questo rapporto descriviamo un metodo semplice, veloce ed economico, basato sul trattamento PBS-EDTA, che consente il rilascio di strutture tubolari dalla matrice della membrana basale che potrebbero essere elaborate per l'analisi biochimica di estratti cellulari. Questo metodo produce elevate quantità di biomolecole, RNA e proteine ed è compatibile con l'analisi biochimica classica, la qPCR e il Western blot. Proponiamo che questa strategia possa essere applicata ad altri saggi, come il frazionamento subcellulare, la determinazione di marcatori epigenetici mediante pirosequenziamento o saggi di precipitazione immunitaria della cromatina. In breve, il protocollo consiste nell'incubazione delle strutture tubolari nel piatto di coltura con PBS integrato con 50 mM di EDTA a 4 °C per sciogliere la matrice della membrana basale. Con questa semplice incubazione rimangono in sospensione le strutture tubulari, che dopo una serie di lavaggi con PBS per eliminare l'EDTA e l'eccesso di matrice di membrana basale diluita, può essere ottenuta come pellet pronto all'uso di strutture tubolari e/o singole cellule. Le sezioni successive descrivono i protocolli per il saggio MELT e il recupero di strutture simili a tubi.

1. Preparazione per il test

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in condizioni sterili. Tutti i materiali plastici devono essere sterili e nuovi di zecca. Le bottiglie di vetro devono essere sterilizzate in autoclave. Tutti i materiali devono essere sterilizzati con una soluzione di etanolo al 70% prima del loro utilizzo nella cabina a flusso laminare. Il terreno di coltura cellulare minimo (RPMI) deve essere sterilizzato mediante filtrazione con un filtro da 0,22 μM prima dell'integrazione con siero fetale bovino (FBS). Indossare sempre dispositivi di protezione individuale quando si lavora con rifiuti a rischio biologico (camice da laboratorio, guanti, capelli lunghi legati all'indietro, ecc.).

1. Preparare il terreno RPMI-1640 (5% di terreno di crescita completo FBS) aggiungendo RPMI 1640 e FBS sterilizzati in un flacone di vetro sterile nella cappa a flusso laminare. Per una soluzione FBS al 5%, aggiungere 190 mL di RPMI-1640 e 10 mL di FBS. Riscaldare RPMI-1640 Media-5% FBS in un bagno d'acqua a temperatura controllata a 37 °C.
2. Preparare la matrice della membrana basale come segue. Scongelare lentamente la matrice della membrana basale posizionando la bottiglia a 4 °C per 3-4 ore e raffreddare la capsula MW-6 a -20 °C, per 1 ora prima dell'uso. Una volta scongelata, mantenere la matrice della membrana basale sul ghiaccio. Nella cabina a flusso laminare diluire la matrice della membrana basale al 70% con RPMI1640 ghiacciata senza FBS.
   NOTA: La matrice della membrana basale deve essere conservata a -80 °C fino all'uso. Dopo lo scongelamento il tutto deve essere lavorato a 4 °C per evitare la polimerizzazione prematura della matrice.
3. Preparare il PBS-EDTA sciogliendo la quantità appropriata di EDTA nel PBS per raggiungere una concentrazione finale di 50 mM di EDTA. Mantenere il PBS-EDTA a 4 °C.

2. Saggio di formazione del tubo

1. Aggiungere 60 μl/^cm2 della matrice di membrana basale diluita come indicato al punto 1.2. ai piatti. Evitare le bolle, che interferiscono con la microfotografia necessaria per la quantificazione delle strutture tubolari.
   NOTA: Nel caso di un multipozzetto-6 (MW6, con un'area di 9,6 cm²) il volume è di 580 μL di matrice a membrana basale -70%.
2. Trasferire le piastre con matrice di membrana basale in un incubatore cellulare (5% di CO₂ e 37 °C) per 2 ore per favorire la polimerizzazione della matrice di membrana basale.
   NOTA: Durante l'ultima 1 ora di polimerizzazione, preparare la sospensione cellulare delle cellule che verranno utilizzate per il saggio, con l'obiettivo di completare le 2 ore di polimerizzazione quando le cellule sono pronte per essere seminate.
3. Seminare 80.000 cellule/^cm2 di HTR8/SVneo (linea cellulare EVTs) diluite in 2 mL di RPMI-1640-5% FBS sulla matrice di membrana basale polimerizzata e anche sulle piastre non rivestite come controllo. Seminare con cura le cellule lungo la parete del pozzetto per evitare di distruggere la matrice della membrana del basamento.
   NOTA: Procurare una distribuzione omogenea delle cellule sul Matrigel, altrimenti le provette non si formeranno nelle aree dove ci sono meno cellule o dove le cellule sono sovraffollate.
4. Trasferire le cellule seminate nell'incubatore cellulare e nella coltura per 12 ore, 24 ore e 48 ore al 5% di CO₂ e 37 °C.
   NOTA: Di solito, 24 ore sono sufficienti per analizzare la struttura tubulare, tuttavia se è necessaria l'espressione cinetica di proteine o RNA durante questo processo, incubare le cellule per: 3 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore e 48 ore.

3. Recupero cellulare dalla matrice della membrana basale

1. Una volta raggiunto il tempo di incubazione selezionato (ad esempio, 12 h, 24 h, 48 h), recuperare il terreno condizionato per eseguire la misurazione di scelta su di esso.
2. Lavare delicatamente le celle con 1 PBS ghiacciato, almeno 3 volte per eliminare i detriti cellulari. Se sono necessarie microfotografie, versare 1 mL di PBS freddo in ogni pozzetto e scattare le foto entro 10 minuti.
3. Rimuovere il PBS e aggiungere 700 μL di PBS-EDTA a ciascun pozzetto e incubare la piastra su ghiaccio per 3-5 minuti.
   NOTA: PBS-EDTA dissolverà la matrice della membrana basale, quindi l'intera rete cellulare rimarrà in sospensione.
4. Recuperare delicatamente la sospensione della rete tubulare con una micropipetta (p1.000) in una provetta da 1,5 mL.
5. Centrifugare la sospensione a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Alla fine, dovrebbe essere visibile un pellet bianco di cellule.
6. Eliminare il surnatante per inversione del tubetto, cercando di lasciarlo il più asciutto possibile.
7. Aggiungere 1 mL di PBS a 4 °C e risospendere delicatamente il pellet cellulare con una micropipetta p.1000 per lavare le cellule e rimuovere la matrice della membrana basale disciolta e l'EDTA. Ripetere almeno 2 volte.
   NOTA: Queste fasi di lavaggio sono fondamentali. La matrice residua della membrana basale potrebbe essere osservata come uno strato viscoso sopra il pellet cellulare. Ripetere i lavaggi fino a eliminare la maggior parte dello strato di matrice della membrana basale.
8. Dopo il lavaggio finale, utilizzare direttamente il pellet cellulare per l'estrazione di proteine o RNA. In alternativa, risospendere il pellet in 1 mL di PBS e distribuirlo in diverse provette, a seconda delle esigenze: ad esempio, 300 μL per l'estrazione dell'RNA e i restanti 700 μL per l'estrazione delle proteine, ecc.
9. Centrifugare le provette a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il pellet della cella.
   NOTA: La divisione della sospensione cellulare in PBS può essere nel rapporto desiderato, ad esempio, 1:1, 1:2 o 1:3 per RNA:proteina. Qui viene utilizzato un rapporto di 1:2 RNA:proteine. A questo punto, conservare i pellet delle celle se non sono immediatamente necessari, il più asciutti possibile, a -80 °C fino a un mese.

Per valutare il protocollo descritto in questo rapporto, abbiamo prima generato le strutture tubolari. Come mostrato nella Figura 1A, le cellule HTR8/SVneo (EVT) hanno generato strutture tubolari a 12 ore, 24 ore e 48 ore di incubazione sulla matrice della membrana basale. Non sono state osservate strutture tubolari nelle piastre di controllo in cui HTR8/SVneo sono stati seminati su plastica all'intervallo di tempo analizzato. Dopo l'acquisizione con fotomic...

Il saggio di formazione tubolare è uno strumento ampiamente utilizzato per valutare l'interazione tra le cellule nei processi angiogenici¹⁹. Qui descriviamo le proprietà angiogeniche delle cellule non endoteliali, come le EVT, nel rimodellamento dei vasi vascolari uterini, un evento critico durante la placentazione⁶. Sebbene la formazione tubolare sia molto istruttiva sull'interazione tra le cellule, è necessaria un'analisi più approfon...

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Fonte di finanziamento FONDECYT 1221362, ANID, per JG. Convocatoria Nacional Subvención a la Instalación en la Academia, ANID, No. SA77210087 per ICW.