从血管生成-管形成测定中回收滋养层细胞，用于分化标志物表达分析

本方案允许恢复在经典 体外 血管生成管形成测定中形成的管状结构，其中细胞（例如滋养层细胞）在细胞外基底膜基质层上以毛细血管状结构组织。回收的结构用于各种生化分析的 RNA 和蛋白质分离。

在胎盘发育过程中，绒毛外滋养层 （EVT） 细胞侵入母体蜕膜，通过间充质到内皮样转变的过程重塑子宫螺旋动脉。传统上，这个过程是通过 体外 成管测定来评估的，其中细胞在接种到聚合基底膜制备物上时将自身组织成管状结构。尽管可以在结构的显微照片中测量几个结构特征，但要评估 EVT 对内皮型表型的真正承诺，需要对细胞提取物进行生化分析。从培养皿中刮除细胞以获得 RNA 和/或蛋白质提取物不是一种选择，因为管状结构被来自聚合基底膜的大部分蛋白质严重污染。因此，在制备细胞提取物之前，需要一种将细胞与基底膜蛋白分离的策略。在这里，提出了一种简单、快速且具有成本效益的方法，用于从 体外 试管形成测定和随后的生化技术分析中恢复管状结构。通过与补充乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 PBS 短暂孵育，将 HTR8/SVneo 细胞（一种 EVT 细胞系）形成的管状结构从聚合基底膜中释放出来。连续洗涤后，可以获得纯化的管状结构的即用型沉淀。该沉淀随后可以进行加工以获得 RNA 和蛋白质提取物。qPCR 分析证明，与对照细胞相比，EVT 衍生的管状结构中诱导了两种内皮细胞标志物 VE-钙粘蛋白和_α-v-整合素的表达，这与通过免疫荧光评估的内皮细胞标志物 CD31 的诱导一致。管状结构蛋白提取物的 Western blot 分析显示 RECK 在转染的 HTR8/SVneo 细胞中过表达。因此，这种简单的方法可以从 体外 试管形成测定中获得细胞提取物，用于随后的 RNA 和蛋白质表达分析。

怀孕的成功取决于胎盘的正常发育和胎盘循环的建立。与此过程相关的关键事件之一是子宫螺旋动脉 （uSA）¹ 的重塑，从高阻力和低流量转变为低阻力和高流量血管，增加母体血液对胎盘的灌注²。

uSA 的重塑是通过来自囊胚的特殊滋养层细胞实现的。胚胎着床后，胎儿绒毛外滋养层 （EVT） 从着床部位通过母体蜕膜和子宫迁移到 uSA³。一旦到达那里，EVT 就会诱导母体血管相关平滑肌细胞 （VSMC） 和内皮细胞 （EC） 的迁移和凋亡⁴。随后，EVT 通过间充质到内皮样转化 （MELT） 获得内皮样表型 ^5,6，^取代了血管的 VSMC 和 EC⁷。

子痫前期 （PE） 是一种妊娠特异性综合征，其特征是产妇高血压发作，伴有蛋白尿和/或母体终末器官功能障碍的其他症状，自妊娠^第 20 周以来确定⁸。虽然 PE 的确切病因尚不完全清楚，但最被接受的假说与 uSA 重塑缺陷⁹ 有关，产生胎盘血流不足的永久性状态，伴有缺血再灌注、缺氧和氧化应激对胎盘的损伤，激活胎盘因子释放到母体循环，触发 PE 的特征性母体症状⁹.因此，确定滋养层细胞重塑 uSA 所涉及的关键细胞和分子机制至关重要。

EVT 的 MELT 的评估通常是通过体外基底膜基质管形成测定¹⁰ 实现的，通过该测定，单个细胞以类似于血管的二维结构迁移和组织自身。该方案要求将 EVT 细胞系接种在一层薄薄的聚合细胞外基质上，通常称为基底膜基质，这是一种市售的细胞外基质，由从 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤中提取的溶解基底膜组成，富含层粘连蛋白，以及胶原蛋白 IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和 entactin/nidogen¹⁰.形成的管状结构的分析通常是通过识别显微照片中已建立的特征（例如，分支数或网格索引）并通过 ImageJ 软件（血管生成分析仪插件）¹¹ 对其进行量化来实现的。尽管这种方法被广泛用于描述管状结构的形成 ^12,13,14，但它们仅限于细胞组织的表征，因为不可能收集这些结构进行生化分析 12,13,14，主要是由于无法将细胞/管与包含大量不同蛋白质的基底膜基质分离。因此，无法确定细胞来源蛋白的真正贡献，这对于正确理解细胞蛋白的表达是必要的。由于这些提取物中的大多数蛋白质来自基底膜基质，因此细胞蛋白质的代表性非常低，因此必须将大量蛋白质加载到 SDS 页面凝胶中，以便通过 Western blot 进行分析，从而影响蛋白质的分辨率和转移。使正确的分析几乎是不可能的。这种过量的基底膜基质衍生蛋白也深刻影响了进一步分析所需纯度的 RNA 的提取。

在本报告中，我们描述了一种基于 PBS-EDTA 处理的简单、快速且经济高效的方法，该方法允许从基底膜基质中释放出管状结构，这些结构可用于细胞提取物的生化分析。该方法可产生大量的生物分子、RNA 和蛋白质，并且与经典生化分析、qPCR 和 Western blot 兼容。我们建议该策略可能适用于其他测定，例如亚细胞分级分离、通过焦磷酸测序或染色质免疫沉淀测定测定表观遗传标记。简而言之，该方案包括将培养皿中的管状结构与补充有 50 mM EDTA 的 PBS 在 4 °C 下孵育以溶解基底膜基质。通过这种简单的孵育，管状结构保持悬浮状态，在用 PBS 进行一系列洗涤以消除 EDTA 和过量的稀释基底膜基质后，可以获得管状结构和/或单个细胞的即用型沉淀。后续部分描述了 MELT 测定和管状结构回收的方案。

1. 检测准备

注意：所有步骤必须在无菌条件下进行。所有塑料材料必须是无菌的和全新的。玻璃瓶必须通过高压灭菌进行灭菌。所有材料在层流柜中使用之前，必须用 70% 乙醇溶液消毒。在补充胎牛血清 （FBS） 之前，必须用 0.22 μM 过滤器过滤对最小细胞培养基 （RPMI） 进行消毒。处理生物危害性废物时，请始终佩戴个人防护装备（实验室外套、手套、长发扎在脑后等）。

1. 通过在层流柜中的无菌玻璃瓶中加入灭菌的 RPMI 1640 和 FBS 来制备 RPMI-1640 培养基（5% FBS 完全生长培养基）。对于 5% FBS 溶液，添加 190 mL RPMI-1640 和 10 mL FBS。在 37 °C 的温控水浴中加热 RPMI-1640 培养基-5% FBS。
2. 按如下方式制备基底膜基质。将瓶子在4°C下放置3至4小时，并在-20°C下冷却MW-6培养皿1小时，缓慢解冻基底膜基质，然后在使用前。解冻后，将基底膜基质保持在冰上。在层流柜中，用不含 FBS 的冰冷RPMI1640将基底膜基质稀释至 70%。
   注意：基底膜基质应储存在 -80 °C 直至使用。解冻后，所有物质都必须在 4 °C 下工作，以避免基质过早聚合。
3. 通过在 PBS 中溶解适量的 EDTA 以达到 50 mM EDTA 的最终浓度来制备 PBS-EDTA。将 PBS-EDTA 保持在 4 °C。

2. 试管形成测定

1. 如步骤 1.2 所示，加入 60 μL/cm² 稀释的基底膜基质。到菜肴。避免气泡，气泡会干扰量化管状结构所需的显微照片。
   注：对于多孔-6（MW6，面积为 9.6 cm²），体积为 580 μL 基底膜基质 -70%。
2. 将装有基底膜基质的培养皿转移到细胞培养箱（5% CO_{2 和} 37°C）中 2 小时，以促进基底膜基质聚合。
   注：在聚合的最后 1 小时内，准备将用于测定的细胞的细胞悬液，目的是在细胞准备好接种时完成 2 小时的聚合。
3. 将 80,000 个细胞/cm² 的 HTR8/SVneo（EVT 细胞系）接种在 2 mL RPMI-1640-5% FBS 中稀释的聚合基底膜基质上，也接种在未包被的培养皿上作为对照。沿着孔壁小心地接种细胞，以避免破坏基底膜基质。
   注意：在 Matrigel 上获得均匀的细胞分布，否则不会在细胞较少或细胞过度拥挤的区域形成管。
4. 将接种的细胞转移到细胞培养箱中，并在 5% CO₂ 和 37 °C 下培养 12 小时、24 小时和 48 小时。
   注意：通常，24 小时足以分析肾小管结构，但是如果在此过程中需要动力学蛋白或 RNA 表达，请将细胞孵育：3 小时、6 小时、12 小时、24 小时和 48 小时。

3. 从基底膜基质中回收细胞

1. 一旦达到选定的孵育时间（例如，12 小时、24 小时、48 小时），回收条件培养基以对其进行所选测量。
2. 用冰冷的 1x PBS 轻轻洗涤细胞，至少 3 次以消除细胞碎片。如果需要显微照片，将 1 mL 冷 PBS 倒入每个孔中，并在 10 分钟内拍照。
3. 去除 PBS 并向每个孔中加入 700 μL PBS-EDTA，并将板在冰上孵育 3-5 分钟。
   注意：PBS-EDTA将溶解基底膜基质，因此整个细胞网络将保持悬浮状态。
4. 用微量移液器 （p1.000） 在 1.5 mL 试管中轻轻恢复管状网络的悬浮液。
5. 将悬浮液在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 10 分钟。 最后，应该可以看到白色的细胞沉淀。
6. 通过倒置试管来去除上清液，尽量使其保持干燥。
7. 在 4 °C 下加入 1 mL PBS，并用 p.1000 微量移液管轻轻重悬细胞沉淀，以洗涤细胞并去除溶解的基底膜基质和 EDTA。重复至少 2 次。
   注意：这些洗涤步骤至关重要。剩余的基底膜基质可以观察到细胞沉淀上的粘性层。重复洗涤，直到大部分基底膜基质层被消除。
8. 最后一次洗涤后，直接使用细胞沉淀物提取蛋白质或 RNA。或者，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并根据要求分配到不同的试管中：例如，300 μL 用于 RNA 提取，剩余 700 μL 用于蛋白质提取等。
9. 将试管在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 10 分钟以获得细胞沉淀。
   注：PBS 中细胞悬液的分裂可以按所需的比例进行，例如，1：1、1：2 或 1：3 与 RNA：蛋白质。这里使用 1：2 RNA：蛋白质的比例。此时，如果不立即需要，请将细胞沉淀物储存在 -80 °C 下，尽可能干燥，长达一个月。

为了评估本报告中描述的协议，我们首先生成了管状结构。如图 1A 所示，HTR8/SVneo 细胞 （EVT） 在基底膜基质上孵育 12 小时、24 小时和 48 小时时产生管状结构。在对照培养皿中未观察到管状结构，其中 HTR8/SVneo 在测定的时间间隔内接种在塑料上。显微照片采集后，通过 ImageJ 软件（血管生成分析仪插件）观察和量化管结构的几个参数，

管状形成测定是评估血管生成过程中细胞间相互作用的广泛使用的工具¹⁹。在这里，我们描述了非内皮细胞（如 EVT）在血管子宫血管重塑中的血管生成特性，这是胎盘形成过程中的关键事件⁶。尽管管状形成对细胞之间的相互作用非常有用，但在血管生成事件期间需要在分子、表观遗传和蛋白质水平进行更深入的分析。这些生化方法需?...

作者声明他们没有利益冲突。

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