Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Durante el desarrollo de la placenta, las células trofoblásticas extravellosas (EVT) invaden la decidua materna para remodelar las arterias espirales uterinas mediante un proceso de transición mesenquimal a endotelial. Tradicionalmente, este proceso se evalúa mediante un ensayo de formación de tubos in vitro , en el que las células se organizan en estructuras en forma de tubo cuando se siembran sobre una preparación de membrana basal polimerizada. Aunque se pueden medir varias características estructurales en fotomicrografías de las estructuras, para evaluar el compromiso real de la EVT con el fenotipo de tipo endotelial, se requiere un análisis bioquímico de los extractos celulares. El raspado de las células de la placa de cultivo para obtener ARN y/o extractos de proteínas no es una alternativa, ya que las estructuras en forma de tubo están gravemente contaminadas por la mayor parte de las proteínas de la membrana basal polimerizada. Por lo tanto, se necesita una estrategia para separar las células de las proteínas de la membrana basal antes de la preparación de extractos celulares. En este trabajo se presenta un método sencillo, rápido y rentable para recuperar las estructuras tubulares a partir del ensayo de formación de tubos in vitro y el posterior análisis mediante técnicas bioquímicas. Las estructuras en forma de tubo formadas por células HTR8/SVneo, una línea celular EVT, se liberaron de la membrana basal polimerizada mediante una breve incubación con PBS suplementado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Después de los lavados en serie, se puede obtener un pellet listo para usar de estructuras tubulares purificadas. Este pellet puede ser procesado posteriormente para obtener extractos de ARN y proteínas. El análisis de qPCR evidenció la expresión inducida de VE-cadherina y alfa_v-integrina, dos marcadores de células endoteliales, en estructuras en forma de tubo derivadas de EVT en comparación con las células control, lo que fue consistente con la inducción del marcador de células endoteliales, CD31, evaluado por inmunofluorescencia. El análisis de Western blot de los extractos de proteínas de las estructuras en forma de tubo reveló la sobreexpresión de RECK en las células HTR8/SVneo transfectadas. Así, este sencillo método permite obtener extractos celulares a partir del ensayo de formación de tubos in vitro para el posterior análisis de RNAs y expresión de proteínas.

El éxito de un embarazo depende del desarrollo adecuado de la placenta y del establecimiento de la circulación placentaria. Uno de los eventos clave asociados con este proceso es la remodelación de las arterias espirales uterinas (uSA)¹, de un vaso sanguíneo de alta resistencia y bajo flujo a un vaso sanguíneo de baja resistencia y alto flujo, aumentando la perfusión de sangre materna en la placenta².

La remodelación de la uSA se logra mediante células trofoblásticas especializadas derivadas del blastocisto. Después de la implantación del embrión, los trofoblastos extravellosos fetales (EVT) migran desde el sitio de implantación a través de la decidua materna y el útero hacia el uSA³. Una vez allí, las EVT inducen la migración y la apoptosis de las células musculares lisas (CMV) y endoteliales (CE) asociadas a los vasos sanguíneos maternos4. Posteriormente, las EVT adquieren un fenotipo de tipo endotelial a través de una transición mesenquimal a endotelial (MELT)^5,6, reemplazando el VSMC y la EC del vaso⁷.

La preeclampsia (EP) es un síndrome específico del embarazo caracterizado por la aparición de hipertensión materna, acompañada de proteinuria y/u otros síntomas de disfunción de los órganos terminales maternos, determinada desde^{la semana} 20 de gestación⁸. A pesar de que la etiología precisa de la EP no se conoce completamente, la hipótesis más aceptada se relaciona con un remodelado defectuoso de la uSA⁹, generando un estado permanente de flujo sanguíneo insuficiente a la placenta, acompañado de daño placentario por isquemia-reperfusión, hipoxia y estrés oxidativo, activando la liberación de factores placentarios a la circulación materna, desencadenando los síntomas maternos característicos de la EP⁹. Por lo tanto, es fundamental determinar los mecanismos celulares y moleculares clave implicados en la remodelación de la uSA por parte de las células trofoblásticas.

La evaluación de la MELT de las EVT se realiza clásicamente mediante el ensayo in vitro de formación de tubos de matriz de membrana basal¹⁰, mediante el cual las células individuales migran y se organizan en estructuras bidimensionales que se asemejan a los vasos sanguíneos. Este protocolo requiere la siembra de líneas celulares de EVTs en una capa delgada de matriz extracelular polimerizada, usualmente denominada matriz de membrana basal, que es una matriz extracelular disponible comercialmente compuesta por una membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm, enriquecida con laminina, así como colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato y entactina/nidogen¹⁰. El análisis de las estructuras tubulares formadas generalmente se logra mediante la identificación de características establecidas en fotomicrografías (por ejemplo, número de ramas o índice de malla) y la cuantificación de estas mediante el software ImageJ (complemento del analizador de angiogénesis)¹¹. A pesar de que este método es ampliamente utilizado para describir la formación de las estructuras tubulares 12,13,14, se limitan a la caracterización de la organización de las células, ya que no es posible recolectar estas estructuras para el análisis bioquímico 12,13,14, en gran parte debido a la imposibilidad de separar las células/tubos de la matriz de la membrana basal, que contiene una gran cantidad de proteínas diferentes. Por lo tanto, no es posible determinar la contribución real de las proteínas derivadas de las células, lo cual es necesario para comprender correctamente la expresión de las proteínas celulares. Dado que la mayoría de las proteínas de estos extractos provendrían de la matriz de la membrana basal, la representación de las proteínas celulares resulta ser muy baja, por lo que se debe cargar una gran cantidad de proteínas en un gel de página SDS para su análisis por Western blot, lo que afecta la resolución y la transferencia de las proteínas. Lo que hace que el análisis adecuado sea casi imposible. Este exceso de proteínas derivadas de la matriz de la membrana basal también afecta profundamente a la extracción de ARN con la pureza necesaria para su posterior análisis.

En este informe describimos un método sencillo, rápido y rentable, basado en el tratamiento con PBS-EDTA, que permite la liberación de estructuras tubulares de la matriz de la membrana basal que podrían ser procesadas para el análisis bioquímico de extractos celulares. Este método produce grandes cantidades de biomoléculas, ARN y proteínas, y es compatible con el análisis bioquímico clásico, qPCR y Western blot. Proponemos que esta estrategia podría ser aplicable a otros ensayos, como el fraccionamiento subcelular, la determinación de marcadores epigenéticos por pirosecuenciación o los ensayos de precipitación inmune de cromatina. En resumen, el protocolo consiste en la incubación de las estructuras en forma de tubo en la placa de cultivo con PBS suplementado con 50 mM de EDTA a 4 °C para disolver la matriz de la membrana basal. Mediante esta simple incubación, las estructuras tubulares permanecen en suspensión, que después de una serie de lavados con PBS para eliminar el EDTA y el exceso de matriz de membrana basal diluida, se puede obtener como un pellet listo para usar de estructuras tubulares y/o células individuales. En las secciones siguientes se describen los protocolos para el ensayo MELT y la recuperación de estructuras tubulares.

1. Preparación del ensayo

NOTA: Todos los pasos deben realizarse en condiciones estériles. Todos los materiales plásticos deben ser estériles y nuevos. Los biberones de vidrio deben esterilizarse en autoclave. Todos los materiales deben ser esterilizados con una solución de etanol al 70% antes de su uso en la cabina de flujo laminar. El medio de cultivo celular mínimo (RPMI) debe esterilizarse por filtración con un filtro de 0,22 μM antes de la suplementación con suero fetal bovino (FBS). Siempre use equipo de protección personal cuando trabaje con desechos biopeligrosos (bata de laboratorio, guantes, cabello largo recogido, etc.).

1. Prepare los medios RPMI-1640 (5% de medio de crecimiento completo FBS) agregando RPMI 1640 y FBS esterilizados en una botella de vidrio estéril en el gabinete de flujo laminar. Para una solución de FBS al 5%, agregue 190 mL de RPMI-1640 y 10 mL de FBS. Calentar el RPMI-1640 Media-5% FBS en un baño de agua con temperatura controlada a 37 °C.
2. Prepare la matriz de la membrana basal de la siguiente manera. Descongele lentamente la matriz de la membrana basal colocando el frasco a 4 °C durante 3 a 4 h y enfríe el plato MW-6 a -20 °C, durante 1 h antes de su uso. Una vez descongelada, mantenga la matriz de la membrana basal en hielo. En la cabina de flujo laminar, diluya la matriz de la membrana basal al 70% con RPMI1640 fría con hielo y sin FBS.
   NOTA: La matriz de la membrana basal debe almacenarse a -80 °C hasta su uso. Después de la descongelación, todo debe trabajarse a 4 °C para evitar la polimerización prematura de la matriz.
3. Prepare PBS-EDTA disolviendo la cantidad adecuada de EDTA en PBS para alcanzar una concentración final de 50 mM de EDTA. Mantenga el PBS-EDTA a 4 °C.

2. Ensayo de formación de tubos

1. Añadir 60 μL/^cm2 de la matriz de membrana basal diluida como se indica en el paso 1.2. a los platos. Evite las burbujas, que interfieren con la microfotografía necesaria para la cuantificación de las estructuras tubulares.
   NOTA: En el caso de un multipocillo-6 (MW6, con un área de 9,6^cm2) el volumen es de 580 μL de matriz de membrana basal -70%.
2. Transfiera las placas con matriz de membrana basal a una incubadora de celdas (5% de CO₂ y 37 °C) durante 2 h para promover la polimerización de la matriz de membrana basal.
   NOTA: Durante las últimas 1 h de polimerización, prepare la suspensión celular de las células que se utilizarán para el ensayo, con el objetivo de completar las 2 h de polimerización cuando las células estén listas para ser sembradas.
3. Siembra de 80.000 células/^cm2 de HTR8/SVneo (línea celular EVTs) diluidas en 2 mL de RPMI-1640-5% FBS sobre la matriz de membrana basal polimerizada y también sobre las placas no recubiertas como control. Siembre con cuidado las celdas a lo largo de la pared del pozo para evitar destruir la matriz de la membrana basal.
   NOTA: Procure una distribución celular homogénea sobre el Matrigel, de lo contrario, no se formarán tubos en áreas donde haya menos celdas o donde las celdas estén abarrotadas.
4. Transfiera las células sembradas a la incubadora celular y cultive durante 12 h, 24 h y 48 h al 5% de CO₂ y 37 °C.
   NOTA: Por lo general, 24 h son suficientes para analizar la estructura tubular, sin embargo, si se necesita la expresión de proteínas cinéticas o ARN durante este proceso, incubar las células durante: 3 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h.

3. Recuperación celular de la matriz de membrana basal

1. Una vez alcanzado el tiempo de incubación seleccionado (por ejemplo, 12 h, 24 h, 48 h), recupere el medio acondicionado para realizar la medición de elección sobre él.
2. Lave suavemente las células con 1x PBS helado, al menos 3 veces para eliminar los restos celulares. Si se necesitan microfotografías, vierta 1 mL de PBS frío en cada pocillo y tome fotografías dentro de los 10 minutos.
3. Retire el PBS y añada 700 μL de PBS-EDTA a cada pocillo e incube la placa en hielo durante 3-5 min.
   NOTA: PBS-EDTA disolverá la matriz de la membrana basal, por lo que toda la red celular permanecerá en suspensión.
4. Recupere suavemente la suspensión de la red tubular con una micropipeta (p1.000) en un tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar la suspensión a 1.000 x g durante 10 min a 4 °C. Al final, debe verse una bolita blanca de células.
6. Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo, procurando dejarlo lo más seco posible.
7. Añadir 1 mL de PBS a 4 °C y resuspender suavemente el pellet celular con una micropipeta p.1000 para lavar las células y eliminar la matriz de membrana basal disuelta y el EDTA. Repita al menos 2 veces.
   NOTA: Estos pasos de lavado son críticos. El resto de la matriz de la membrana basal se pudo observar como una capa viscosa sobre el pellet de la célula. Repita los lavados hasta que se elimine la mayor parte de la capa de matriz de la membrana basal.
8. Después del lavado final, use el pellet celular directamente para la extracción de proteínas o ARN. Alternativamente, resuspender el pellet en 1 mL del PBS y distribuirlo en diferentes tubos, dependiendo de los requisitos: por ejemplo, 300 μL para la extracción de ARN y los 700 μL restantes para la extracción de proteínas, etc.
9. Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 10 min a 4 °C para obtener el pellet de la célula.
   NOTA: La división de la suspensión celular en PBS puede estar en la proporción deseada, por ejemplo, 1:1, 1:2 o 1:3 con respecto al ARN:proteína. Aquí se utiliza una proporción de 1:2 ARN:proteínas. En este punto, almacene los gránulos de celda si no se necesitan inmediatamente, lo más secos posible, a -80 °C hasta un mes.

Para evaluar el protocolo descrito en este informe, primero generamos las estructuras en forma de tubo. Como se muestra en la Figura 1A, las células HTR8/SVneo (EVT) generaron estructuras en forma de tubo a las 12 h, 24 h y 48 h de incubación sobre la matriz de membrana basal. No se observaron estructuras en forma de tubo en las placas de control donde HTR8/SVneo se sembró en plástico en el intervalo de tiempo ensayado. Después de la adquisición de la ...

El ensayo de formación en forma de tubo es una herramienta ampliamente utilizada para evaluar la interacción entre células en procesos angiogénicos¹⁹. Aquí describimos las propiedades angiogénicas de las células no endoteliales, como las EVTs, en la remodelación de los vasos vasculares uterinos, un evento crítico durante la placentación⁶. Aunque la formación en forma de tubo es muy informativa sobre la interacción entre las cél...

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Fuente de financiamiento FONDECYT 1221362, ANID, para JG. Convocatoria Nacional Subvención a la Instalación en la Academia, ANID, No. SA77210087 para ICW.