분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

태반이 발달하는 동안, 외융모 영양막세포(EVT) 세포는 모계 영양막(extravillous trophoblasta, EVT) 세포가 모계 난동맥(maternal decidua)에 침입하여 중간엽(mesenchymal)에서 내피(endothelial)와 같은 전이(interenchymal to endothelial-like transition) 과정을 통해 자궁 나선 동맥을 리모델링합니다. 전통적으로 이 과정은 시험관 형성 분석법(in vitro tube-formation assay)에 의해 평가되며, 여기서 세포는 중합된 기저막 제제 위에 파종될 때 튜브와 같은 구조로 스스로를 조직합니다. 구조의 현미경 사진에서 몇 가지 구조적 특징을 측정할 수 있지만, 내피 유형 표현형에 대한 EVT의 실제 헌신을 평가하려면 세포 추출물의 생화학적 분석이 필요합니다. RNA 및/또는 단백질 추출물을 얻기 위해 배양 접시에서 세포를 긁어내는 것은 튜브와 같은 구조가 중합된 기저막의 대량의 단백질에 의해 심하게 오염되기 때문에 대안이 아닙니다. 따라서 세포 추출물을 준비하기 전에 기저막 단백질에서 세포를 분리하는 전략이 필요합니다. 여기에서는 시험관 형성 분석 및 생화학 기술에 의한 후속 분석에서 튜브와 같은 구조를 복구하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 방법이 제시됩니다. EVT 세포주인 HTR8/SVneo 세포에 의해 형성된 튜브와 같은 구조는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 보충된 PBS를 사용한 짧은 배양에 의해 중합된 기저막에서 유리되었습니다. 연속 세척 후, 정제된 튜브와 같은 구조의 즉시 사용 가능한 펠릿을 얻을 수 있습니다. 이 펠릿은 이후에 RNA 및 단백질 추출물을 얻기 위해 처리될 수 있습니다. qPCR 분석은 대조 세포와 비교하여 EVT 유래 튜브형 구조에서 두 개의 내피 세포 마커인 VE-cadherin과 alpha v-integrin의 유도 발현을 입증했으며, 이는 면역형광으로 평가한 내피 세포 마커 CD31의 유도와 일치했습니다. 튜브와 같은 구조의 단백질 추출물에 대한 웨스턴 블롯 분석은 형질주입된 HTR8/SVneo 세포에서 RECK의 과발현을 밝혔습니다. 따라서 이 간단한 방법을 사용하면 RNA 및 단백질 발현의 후속 분석을 위해 시험관 형성 분석에서 세포 추출물을 얻을 수 있습니다.

임신의 성공 여부는 태반의 적절한 발달과 태반 순환의 확립에 달려 있습니다. 이 과정과 관련된 주요 사건 중 하나는 자궁 나선 동맥(uSA)¹이 고저항 및 저유량 혈관에서 저저항 및 고유량 혈관으로 리모델링되어 모체 혈액이 태반으로 관류하는 속도를 높이는 것입니다².

uSA의 리모델링은 배반포에서 유래한 특화된 영양막 세포에 의해 이루어집니다. 배아의 착상 후, 태아 외융모 영양막세포(EVT)는 착상 부위에서 모체 결치와 자궁을 통해 uSA로 이동합니다³. 일단 그곳에 도착하면, EVT는 모계 혈관 관련 평활근 세포(VSMC)와 내피 세포(EC)의 이동 및 세포사멸을 유도합니다⁴. 그 후, EVT는 중간엽에서 내피 유사 전이(MELT)^5,6를 통해 내피와 같은 표현형을 획득하여 혈관⁷의 VSMC 및 EC를 대체합니다.

자간전증(PE)은 단백뇨 및/또는 기타 산모 말단 장기 기능 장애 증상을 동반하는 산모 고혈압의 발병을 특징으로 하는 임신 특이적 증후군으로, 임신⁸주 이후 확인됩니다. PE의 정확한 병인은 완전히 이해되지 않았지만, 가장 널리 받아들여지는 가설은 허혈-재관류, 저산소증 및 산화 스트레스에 의한 태반 손상을 동반하여 태반으로의 혈류가 불충분한 영구적인 상태를 생성하고, 태반 인자의 방출을 모계 순환계에 활성화하여 PE⁹의 특징적인 모계 증상을 유발하는 결함 있는 uSA^리모델링과 관련이 있습니다. 따라서 영양막 세포에 의한 uSA 리모델링과 관련된 주요 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 것이 중요합니다.

EVT의 MELT 평가는 고전적으로 시험관 내 기저막 매트릭스 튜브 형성 분석¹⁰에 의해 이루어지며, 이를 통해 개별 세포가 혈관과 유사한 2차원 구조로 이동하고 조직됩니다. 이 프로토콜은 일반적으로 기저막 기질이라고 하는 중합된 세포외 기질의 얇은 층에 EVT 세포주를 파종하는 것을 필요로 하며, 이는 라미닌(Laminin)과 콜라겐 IV(Collagen IV), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycans) 및 엔탁틴/니도겐(entactin/nidogen)에 의해 농축된 엥겔브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm) 쥐 육종에서 추출한 용해된 기저막으로 구성된 상업적으로 이용 가능한 세포외 기질입니다¹⁰. 형성된 튜브와 같은 구조의 분석은 일반적으로 현미경 사진에서 확립된 특성(예: 분기 수 또는 메쉬 지수)을 식별하고 ImageJ 소프트웨어(혈관 형성 분석기 플러그인)¹¹에 의한 정량화에 의해 수행됩니다. 이 방법은 튜브와 같은 구조^{12 , 13 , 14} 의 형성을 설명하는 데 널리 사용되지만, 생화학 적 분석^{12 , 13 , 14} 를 위해 이러한 구조를 수집 할 수 없기 때문에 세포 조직의 특성화에 국한됩니다, 주로 많은 양의 다른 단백질을 포함하는 기저막 기질에서 세포/튜브를 분리할 수 없기 때문입니다. 따라서 세포 유래 단백질의 실제 기여도를 결정하는 것은 불가능하며, 이는 세포 단백질의 발현을 올바르게 이해하는 데 필요합니다. 이 추출물에 있는 단백질의 대부분이 기저막 모체에서 올 것이기 때문에, 세포질 단백질의 대표는 아주 낮기 위하여 판명된다, 그래서 단백질의 해결책 그리고 이동에 영향을 미치는 서쪽 얼룩에 의하여 분석을 위한 SDS 페이지 젤로 다량의 단백질을 적재되어야 한다. 적절한 분석을 거의 불가능하게 만듭니다. 이러한 기저막 기질 유래 단백질의 과잉은 추가 분석에 필요한 순도를 가진 RNA의 추출에도 깊은 영향을 미칩니다.

이 보고서에서는 세포 추출물의 생화학적 분석을 위해 처리할 수 있는 기저막 매트릭스에서 튜브와 같은 구조를 방출할 수 있는 PBS-EDTA 처리를 기반으로 하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 양의 생체 분자, RNA 및 단백질을 생성하며 고전적인 생화학 분석, qPCR 및 웨스턴 블롯과 호환됩니다. 우리는 이 전략이 sub-cellular fractionation, pyrosequencing 또는 chromatin immune precipitation assay에 의한 후성유전학적 마커 결정과 같은 다른 분석에 적용할 수 있다고 제안합니다. 요컨대, 프로토콜은 기저막 매트릭스를 용해시키기 위해 4°C에서 50mM의 EDTA가 보충된 PBS와 함께 배양 접시의 튜브와 같은 구조를 배양하는 것으로 구성됩니다. 이 간단한 배양을 통해 관형 구조는 현탁액으로 유지되며, EDTA와 희석된 기저막 매트릭스의 과잉을 제거하기 위해 PBS로 일련의 세척을 한 후 관형 구조 및/또는 개별 세포의 즉시 사용 가능한 펠릿으로 얻을 수 있습니다. 후속 섹션에서는 MELT 분석에 대한 프로토콜과 튜브와 같은 구조의 회수에 대해 설명합니다.

1. 분석 준비

알림: 모든 단계는 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 모든 플라스틱 재료는 멸균 상태여야 하며 새 제품이어야 합니다. 유리병은 고압증기멸균으로 멸균해야 합니다. 모든 재료는 층류 캐비닛에서 사용하기 전에 70% 에탄올 용액으로 멸균해야 합니다. 최소 세포 배양 배지(RPMI)는 소 태아 혈청(FBS)을 보충하기 전에 0.22μM 필터로 여과하여 멸균해야 합니다. 생물학적 위험 폐기물로 작업할 때는 항상 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑, 긴 머리를 뒤로 묶은 것 등)를 착용하십시오.

1. 층류 캐비닛의 멸균 유리병에 멸균된 RPMI 1640 및 FBS를 첨가하여 RPMI-1640 배지(5% FBS 완전 성장 배지)를 준비합니다. 5% FBS 용액의 경우 RPMI-1640 190mL와 FBS 10mL를 추가합니다. RPMI-1640 Media-5% FBS를 37°C의 온도 조절 수조에서 가열합니다.
2. 다음과 같이 기저막 매트릭스를 준비합니다. 병을 4°C에서 3-4시간 동안 놓아 기저막 매트릭스를 천천히 해동하고 사용하기 전에 MW-6 접시를 -20°C에서 1시간 동안 냉각합니다. 해동되면 기저막 매트릭스를 얼음 위에 유지하십시오. 층류 캐비닛에서 FBS가 없는 얼음 저온 RPMI1640으로 기저막 매트릭스를 70%로 희석합니다.
   알림: 기저막 매트릭스는 사용할 때까지 -80°C에서 보관해야 합니다. 해동 후에는 매트릭스의 조기 중합을 방지하기 위해 모든 것을 4°C에서 작업해야 합니다.
3. PBS에 적절한 양의 EDTA를 용해시켜 최종 농도 50mM의 EDTA에 도달하여 PBS-EDTA를 준비합니다. PBS-EDTA를 4°C로 유지합니다.

2. 튜브 형성 분석

1. 1.2단계에서 표시한 대로 희석된 기저막 매트릭스 60μL/^cm2 를 추가합니다. 요리에. 관 구조의 정량화에 필요한 현미경 사진을 방해하는 기포를 피하십시오.
   참고: 멀티웰-6(MW6, 면적 9.6cm²)의 경우 부피는 580μL의 기저막 매트릭스 -70%입니다.
2. 기저막 매트릭스가 있는 접시를 세포 배양기(5% CO₂ 및 37°C)로 2시간 동안 옮겨 기저막 매트릭스 중합을 촉진합니다.
   참고: 마지막 1시간의 중합 동안, 세포를 파종할 준비가 되었을 때 2시간의 중합을 완료하는 것을 목표로 분석에 사용할 세포의 세포 현탁액을 준비합니다.
3. 2mL의 RPMI-1640-5% FBS에 희석된 HTR8^/SVneo (EVT 세포주) 80,000 cells/cm2를 중합된 기저막 매트릭스 및 대조군으로 코팅되지 않은 접시 위에 파종합니다. 기저막 매트릭스가 파괴되지 않도록 우물 벽을 따라 세포를 조심스럽게 씨를 뿌립니다.
   참고: Matrigel에 걸쳐 균일한 세포 분포를 확보하십시오, 그렇지 않으면 세포가 적거나 세포가 과밀한 영역에서 튜브가 형성되지 않습니다.
4. 파종된 세포를 세포 배양기로 옮기고 5%_CO2 및 37°C에서 12시간, 24시간 및 48시간 동안 배양합니다.
   참고: 일반적으로 24시간이면 세뇨관 구조를 분석하기에 충분하지만 이 과정에서 운동 단백질 또는 RNA 발현이 필요한 경우 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간 동안 세포를 배양합니다.

3. 기저막 매트릭스에서 세포 회수

1. 선택한 배양 시간(예: 12시간, 24시간, 48시간)에 도달하면 컨디셔닝된 배지를 회수하여 선택한 측정을 수행합니다.
2. 얼음처럼 차가운 1x PBS로 세포를 부드럽게 세척하고 세포 파편을 제거하기 위해 최소 3배로 세포를 세척합니다. 현미경 사진이 필요한 경우 각 웰에 차가운 PBS 1mL를 붓고 10분 이내에 사진을 찍습니다.
3. PBS를 제거하고 각 웰에 700μL의 PBS-EDTA를 첨가한 다음 얼음 위에서 플레이트를 3-5분 동안 배양합니다.
   참고: PBS-EDTA는 기저막 매트릭스를 용해시키므로 전체 세포망이 현탁 상태로 유지됩니다.
4. 1.5mL 튜브에 마이크로피펫(p1.000)을 넣어 세뇨관 네트워크의 현탁액을 부드럽게 회복합니다.
5. 현탁액을 1,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 마지막에 흰색 세포 알갱이가 보여야 합니다.
6. 튜브를 반전시켜 상등액을 제거하고 가능한 한 건조한 상태로 두십시오.
7. 4°C에서 PBS 1mL를 첨가하고 p.1000 마이크로피펫으로 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시켜 세포를 세척하고 용해된 기저막 매트릭스와 EDTA를 제거합니다. 최소 2회 반복합니다.
   알림: 이러한 세척 단계는 매우 중요합니다. 나머지 기저막 매트릭스는 세포 펠릿 위의 점성층으로 관찰될 수 있습니다. 대부분의 기저막 매트릭스 층이 제거될 때까지 세척을 반복합니다.
8. 최종 세척 후 단백질 또는 RNA 추출을 위해 세포 펠렛을 직접 사용합니다. 또는 PBS 1mL에 펠릿을 재현탁하고 요구 사항에 따라 다른 튜브에 분배합니다(예: RNA 추출을 위한 300μL, 단백질 추출을 위한 나머지 700μL 등).
9. 1,000 x g 에서 튜브를 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
   참고: PBS에서 세포 현탁액의 분열은 원하는 비율(예: RNA:단백질에 대한 1:1, 1:2 또는 1:3)일 수 있습니다. 여기서는 1:2 RNA:단백질의 비율이 사용됩니다. 이 시점에서 즉시 필요하지 않은 경우 세포 펠릿을 가능한 한 건조하게 -80°C에서 최대 한 달까지 보관하십시오.

이 보고서에 설명된 프로토콜을 평가하기 위해 먼저 튜브와 같은 구조를 생성했습니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 HTR8/SVneo 셀(EVT)은 기저막 매트릭스에서 12시간, 24시간 및 48시간의 배양에서 튜브와 같은 구조를 생성했습니다. HTR8/SVneo가 분석된 시간 간격으로 플라스틱에 파종된 대조군 접시에서 튜브와 같은 구조가 관찰되지 않았습니다. 현미경 사?...

튜브형 형성 분석법은 혈관신생 과정에서 세포 간의 상호작용을 평가하기 위해 널리 사용되는 도구입니다¹⁹. 여기에서는 EVT와 같은 비내피 세포의 혈관 형성 특성(in-indothelial cell)이 태반 중 중요한 사건인 혈관 자궁 혈관 리모델링(remodeling in vascular weterine vessels)에서 혈관 형성⁶ 을 묘사합니다. 튜브와 같은 형성은 세포 간의 상호 작용?...

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

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