Em nossa pesquisa investigamos a influência das propriedades mecânicas da matriz extracelular no comportamento celular e na integridade tecidual. Queremos entender como a interação entre as células e seu microambiente afeta processos patológicos como a formação de metástases. Ao minerar dados sobre as propriedades mecânicas da membrana basal pulmonar, descobrimos que as membranas basais mais macias são mais resistentes à invasão de células cancerígenas.
O método apresentado em nosso protocolo permite a criosecção e investigação mecânica de amostras biológicas não fixadas, o que preserva as propriedades mecânicas. Além disso, mostra uma maneira de determinar o módulo de Young apenas da membrana basal dentro da parede alveolar por um microscópio de força atômica de medição e procedimentos de filtragem descritos em nosso protocolo. O próximo passo é aprender mais sobre a dinâmica da rigidez da membrana basal e seu papel nos processos patológicos e de desenvolvimento para potencialmente melhorar o diagnóstico e orientar as opções de tratamento.
Para começar, remova o molde contendo a temperatura de corte ideal congelada, ou OCT, composto embutido em tecidos pulmonares de camundongo do freezer de 80 graus Celsius negativos. Coloque fita adesiva dupla face no centro da lâmina do microscópio de borda fosca. Role um tubo de centrífuga de 15 mililitros sobre a fita para garantir uma adesão firme e sem bolhas.
Certifique-se de que o comprimento da fita corresponda à largura do bloco OCT que contém a amostra. Rotule os slides com um lápis, incluindo as informações da amostra e os números das seções. Insira as lâminas de microscópio preparadas em uma caixa de lâminas.
Coloque a caixa de lâminas dentro da câmara criotomâmica para resfriar as lâminas. Em seguida, preencher os dois anéis internos do porta-amostras com meio OCT. Posicionar a amostra dentro do meio OCT no suporte da amostra.
Colocar o suporte da amostra na câmara criotomóide durante cerca de 10 minutos até que o meio OCT solidifique completamente e a amostra esteja firmemente fixada. Agora, instale o porta-amostras no estágio de corte do criotomo. Prenda um pedaço de fita adesiva unilateral à amostra pressionando firmemente com um polegar frio.
Produza uma seção de tecido de 15 micrômetros usando o criotomo. Use uma escova para direcionar a seção e evitar que a fita adesiva se solte durante o procedimento de corte. Use uma lâmina de microscópio gelada com fita adesiva dupla face e pressione-a firmemente na seção para pegá-la.
Coloque o slide carregando a seção de volta na caixa de slides. Para calibrar o cantilever usando o método de ruído térmico, coloque uma lâmina de microscópio no estágio de amostra do microscópio de força atômica ou AFM. Coloque a cabeça do AFM no estágio de amostra.
Abaixe então a cabeça do AFM usando os motores deslizantes até que a diferença entre o suporte do modilhão e a corrediça do microscópio seja aproximadamente um a dois milímetros. Usando uma seringa de um mililitro com uma agulha longa, aplique PBS na lateral do suporte do cantilever, permitindo que ele flua para baixo e forme um menisco fluido na lacuna. No software de controle AFM, para realizar uma calibração baseada em contato, navegue até a página Adquirir dados e selecione a opção Advanced View.
Acesse o Gerenciador de Calibração clicando no botão do menu de hambúrguer localizado no canto superior direito. Em seguida, selecione Baseado em contato como o método e o cantilever MLCT-F no menu suspenso Nome como o nome do cantilever. Insira um volt no campo Ponto de ajuste e 10 no campo Número de varreduras.
Na página Adquirir dados, insira um ponto de ajuste de um volt para o procedimento de aproximação automática no painel de controle esquerdo. Clique no botão azul de seta apontando para baixo no canto superior esquerdo da interface para iniciar a aproximação automática. Quando a aproximação estiver concluída e o cantilever estiver em contato com a lâmina do microscópio, clique no botão Calibrar na janela do Gerenciador de calibração para iniciar a calibração.
Após a conclusão da calibração, feche a janela do Gerenciador de calibração e certifique-se de que um arquivo de calibração seja gerado no diretório pré-selecionado contendo os resultados de calibração determinados. Para começar, recupere a lâmina de amostra contendo tecidos pulmonares de camundongo seccionados do freezer. Coloque a lâmina do microscópio no estágio de amostra do AFM.
Clique no botão com o ícone de chave inglesa no canto superior direito da interface do usuário para navegar até o Gerenciador de configurações. Na seção Configurações de aproximação, defina a altura do alvo para quatro micrômetros. Em seguida, na seção Configurações do modo atual, em Configurações avançadas de feedback, defina o multiplicador como um.
Na subseção Configurações de força das configurações do modo atual, selecione Piezo retraído no menu suspenso Modo no final. No painel de controle esquerdo, defina os parâmetros para as curvas de indentação de força. Para o NanoWizard 4 XP e o cantilever MLCT F entrada Setpoint para cinco nanonewtons, Comprimento Z para oito micrômetros e Velocidade Z para 300 micrômetros por segundo.
Em seguida, defina a localização e o tamanho do mapa de força de visão geral inicial para abranger toda a parede alveolar, estendendo-se de um lado do ar ao outro. Defina o número de pixels como 50 por 50. Depois de registrar o mapa de visão geral, capture um mapa de força mais focado com um tamanho de três por três micrômetros ou quatro por quatro micrômetros na membrana do embasamento, mantendo o número de pixels em curvas de 50 por 50.
Para analisar curvas de indentação de força, inicie a Caixa de Ferramentas de Processamento CANTER no MATLAB e abra o aplicativo Análise de Curva de Força. Em seguida, para carregar o mapa de força de alta resolução da seção pulmonar, clique em Selecionar arquivo, navegue até o local de salvamento, clique duas vezes no arquivo e selecione Carregar dados. Quando a janela pop-up solicitando valores de calibração para o cantilever aparecer, insira os valores de calibração nos respectivos campos de edição.
Clique no botão Enviar para prosseguir. Em uma segunda janela pop-up, continue com o procedimento de carregamento do mapa de imagem quantitativa, ou QI, clicando no botão Enviar. Após a conclusão do processo de carregamento, a curva de força inicial do mapa de força é exibida na tela.
Defina a profundidade de ajuste no campo de edição correspondente para 1,5 micrômetros e selecione via ajuste Hertz para o algoritmo do localizador de contatos. Para aplicar o ajuste do modelo Hertz modificado a todas as curvas de recuo de força do mapa QI, clique no botão Manter Aplicar a todos. Após a conclusão da última análise da curva de força, uma janela é exibida para salvar os arquivos.
Clique em Sim e insira um nome para os arquivos de resultado. Para filtragem espacial do mapa QI da janela Seleção de Aplicativo na Caixa de Ferramentas de Processamento CANTER, selecione a Ferramenta de Filtragem de Resultados e clique no botão Iniciar Aplicativo. Para carregar os resultados do ajuste, clique em Abrir na barra de menu superior da interface do usuário da Ferramenta de Filtragem de Resultados.
Na janela pop-up subsequente, localize o primeiro botão Definir na guia JPK Maps e selecione o arquivo tsv que contém os resultados da análise da curva de força. Em seguida, clique no segundo botão Definir e localize o arquivo de mapa QI correspondente ao arquivo tsv selecionado. Em seguida, clique em Enviar para carregar os dados do mapa e forçar os resultados da análise da curva.
No menu suspenso Canal exibido na parte superior, selecione a opção EModul para exibir os resultados do módulo de Young como uma imagem de mapa. Em seguida, no menu suspenso Canal de dados abaixo do gráfico de histograma, escolha a opção EModul para visualizar a distribuição dos valores de módulo de Young carregados do mapa QI. Em seguida, clique no botão de seta de fluxo de manipulação no centro da interface do usuário, garantindo que ele aponte para o lado direito.
Defina o botão de alternância Filtro de imagem para a posição Ativado no painel Filtro acima dos eixos do histograma. No menu suspenso Filtrar geometria, selecione a opção Mão livre e clique no botão Adicionar. Na imagem do canal superior, desenhe a máscara de filtro circulando a membrana do porão enquanto segura o botão esquerdo do mouse.
Em seguida, solte o botão do mouse quando terminar e clique duas vezes na máscara para aplicá-la ao mapa. Para salvar um novo arquivo de resultado tsv com os valores de módulo de Young mascarados, clique em Salvar, Salvar histograma e Salvar dados na barra de menu superior. Na janela pop-up exibida, clique em Selecionar tudo para escolher quais resultados gravar no arquivo tsv.
Em seguida, clique no botão OK para confirmar a seleção. Na caixa de diálogo Salvar, insira um nome para o arquivo tsv, escolha o local de salvamento desejado e clique em OK para salvar os resultados filtrados. Os valores do módulo de Young da membrana basal pulmonar exibiram uma distribuição logarítmica normal com um valor de pico de 9,31 e desvio padrão de 0,18, resultando em um módulo de Young representativo de 11,05 quilopascais.
Esses achados foram confirmados pelo gráfico quantil-quantil.
