En nuestra investigación investigamos la influencia de las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en el comportamiento celular y la integridad de los tejidos. Queremos entender cómo la interacción entre las células y su microambiente afecta a procesos patológicos como la formación de metástasis. Mediante la extracción de datos de las propiedades mecánicas de la membrana basal pulmonar, descubrimos que las membranas basales más blandas son más resistentes a la invasión de células cancerosas.
El método presentado en nuestro protocolo permite la criosección y la investigación mecánica de muestras biológicas no fijadas, lo que preserva las propiedades mecánicas. Y además, muestra una forma de determinar el módulo de Young únicamente de la membrana basal dentro de la pared alveolar mediante una medición de microscopio de fuerza atómica y los procedimientos de filtrado descritos en nuestro protocolo. El siguiente paso es aprender más sobre la dinámica de la rigidez de la membrana basal y su papel en los procesos patológicos y de desarrollo para mejorar potencialmente el diagnóstico y guiar las opciones de tratamiento.
Para comenzar, retire el molde que contiene la temperatura óptima de corte congelada, o OCT, compuestos incrustados en tejidos pulmonares de ratón del congelador a menos 80 grados centígrados. Coloque cinta adhesiva de doble cara en el centro del portaobjetos de microscopio de borde esmerilado. Enrolle un tubo de centrífuga de 15 mililitros sobre la cinta para garantizar una adhesión firme y sin burbujas.
Asegúrese de que la longitud de la cinta coincida con la anchura del bloque OCT que contiene la muestra. Etiquete las diapositivas con un lápiz, incluyendo la información de la muestra y los números de sección. Inserte los portaobjetos del microscopio preparados en una caja de portaobjetos.
Coloque la caja de portaobjetos dentro de la cámara de criotomo para enfriar los portaobjetos. A continuación, llene los dos anillos interiores del portamuestras con medio OCT. Coloque la muestra dentro del medio OCT en el portamuestras.
Coloque el portamuestras en la cámara de criotomo durante aproximadamente 10 minutos hasta que el medio OCT se solidifique completamente y la muestra esté firmemente asegurada. Ahora, instale el portamuestras en la etapa de corte del criótomo. Fije un trozo de cinta adhesiva de un solo lado a la muestra presionando firmemente con un pulgar frío.
Produzca una sección de tejido de 15 micrómetros utilizando el criótomo. Utilice un cepillo para dirigir la sección y evitar que la cinta adhesiva se desprenda durante el procedimiento de corte. Utilice un portaobjetos de microscopio refrigerado con cinta adhesiva de doble cara y presiónelo firmemente sobre la sección para recogerlo.
Coloque la corredera que lleva la sección de nuevo en la caja de la corredera. Para calibrar el voladizo utilizando el método de ruido térmico, coloque un portaobjetos de microscopio en la etapa de muestra del microscopio de fuerza atómica o AFM. Coloque el cabezal AFM en la platina de muestra.
A continuación, baje el cabezal AFM con los motores paso a paso hasta que el espacio entre el soporte en voladizo y el portaobjetos del microscopio sea de aproximadamente uno o dos milímetros. Con una jeringa de un mililitro con una aguja larga, aplique PBS en el costado del soporte en voladizo, permitiendo que fluya hacia abajo y forme un menisco líquido en el espacio. En el software de control AFM, para realizar una calibración basada en contactos, vaya a la página Adquirir datos y seleccione la opción Vista avanzada.
Acceda al Administrador de calibración haciendo clic en el botón de menú de hamburguesas ubicado en la esquina superior derecha. A continuación, seleccione Basado en contacto como método y MLCT-F en voladizo en el menú desplegable Nombre como nombre en voladizo. Introduzca un voltio en el campo Punto de ajuste y 10 en el campo Número de exploraciones.
En la página Adquirir datos, introduzca un punto de ajuste de un voltio para el procedimiento de aproximación automática en el panel de control de la izquierda. Haga clic en el botón de flecha azul que apunta hacia abajo en la esquina superior izquierda de la interfaz para iniciar el enfoque automático. Cuando se complete la aproximación y el voladizo esté en contacto con el portaobjetos del microscopio, haga clic en el botón Calibrar en la ventana del Administrador de calibración para iniciar la calibración.
Una vez completada la calibración, cierre la ventana del Administrador de calibración y asegúrese de que se genere un archivo de calibración en el directorio preseleccionado que contenga los resultados de calibración determinados. Para comenzar, saque del congelador el portaobjetos de muestra que contiene tejidos pulmonares de ratón seccionados. Coloque el portaobjetos del microscopio en la platina de muestra del AFM.
Haga clic en el botón con el icono de la llave inglesa en la esquina superior derecha de la interfaz de usuario para navegar hasta el Administrador de configuración. Dentro de la sección Configuración de aproximación, establezca la Altura objetivo en cuatro micrómetros. A continuación, en la sección Configuración del modo actual, en Configuración avanzada de comentarios, establezca el multiplicador en uno.
En la subsección Configuración de fuerza de la Configuración del modo actual, seleccione Piezoeléctrico retraído en el menú desplegable Modo al final. En el panel de control de la izquierda, establezca los parámetros para las curvas de indentación de fuerza. Para el NanoWizard 4 XP y el voladizo MLCT, el punto de ajuste de entrada F es de cinco nanonewtons, la longitud Z es de ocho micrómetros y la velocidad Z es de 300 micrómetros por segundo.
A continuación, defina la ubicación y el tamaño del mapa de fuerza general inicial para abarcar toda la pared alveolar, extendiéndose de un lado de aire al otro. Establezca el número de píxeles en 50 por 50. Después de registrar el mapa general, capture un mapa de fuerza más enfocado con un tamaño de tres por tres micrómetros o cuatro por cuatro micrómetros en la membrana basal, manteniendo el número de píxeles en curvas de 50 por 50.
Para analizar curvas de indentación de fuerza, inicie CANTER Processing Toolbox en MATLAB y abra la aplicación Force Curve Analysis. Luego, para cargar el mapa de fuerza de alta resolución de la sección pulmonar, haga clic en Seleccionar archivo, navegue hasta la ubicación de guardado, haga doble clic en el archivo y seleccione Cargar datos. Cuando aparezca la ventana emergente que solicita los valores de calibración para el voladizo, introduzca los valores de calibración en los campos de edición respectivos.
Haga clic en el botón Enviar para continuar. En una segunda ventana emergente, continúe con el procedimiento de carga del mapa de imágenes cuantitativas, o QI, haciendo clic en el botón Enviar. Al finalizar el proceso de carga, se muestra en la pantalla la curva de fuerza inicial del mapa de fuerzas.
Establezca la profundidad de ajuste en el campo de edición correspondiente en 1,5 micrómetros y seleccione el ajuste a través de hercios para el algoritmo de búsqueda de contactos. Para aplicar el ajuste del modelo de Hertz modificado a todas las curvas de indentación de fuerza del mapa QI, haga clic en el botón Mantener Aplicar a todo. Una vez finalizado el último análisis de la curva de fuerza, aparece una ventana para guardar los archivos.
Haga clic en Sí y escriba un nombre para los archivos de resultados. Para el filtrado espacial del mapa QI desde la ventana Selección de aplicaciones en la caja de herramientas de procesamiento de CANTER, seleccione la herramienta de filtrado de resultados y haga clic en el botón Iniciar aplicación. Para cargar los resultados de ajuste, haga clic en Abrir en la barra de menú superior de la interfaz de usuario de la herramienta de filtrado de resultados.
En la ventana emergente siguiente, ubique el primer botón Establecer en la pestaña JPK Maps y seleccione el archivo tsv que contiene los resultados del análisis de la curva de fuerza. A continuación, haga clic en el segundo botón Establecer y localice el archivo de mapa QI correspondiente al archivo tsv seleccionado. A continuación, haga clic en Enviar para cargar los datos del mapa y los resultados del análisis de la curva de fuerza.
En el menú desplegable Canal mostrado en la parte superior, seleccione la opción EModul para mostrar los resultados del módulo de Young como una imagen de mapa. Luego, en el menú desplegable Canal de datos debajo del gráfico del histograma, elija la opción EModul para visualizar la distribución de los valores del módulo de Young cargados en el mapa QI. A continuación, haga clic en el botón de flecha de flujo de manipulación en el centro de la interfaz de usuario, asegurándose de que apunte hacia el lado derecho.
Establezca el botón de alternancia Filtro de imagen en la posición Activado en el panel Filtro sobre los ejes del histograma. En el menú desplegable Filtrar geometría, seleccione la opción Mano alzada y luego haga clic en el botón Agregar. En la imagen del canal superior, dibuje la máscara de filtro rodeando la membrana basal mientras mantiene presionado el botón izquierdo del mouse.
A continuación, suelte el botón del ratón cuando termine y haga doble clic en la máscara para aplicarla al mapa. Para guardar un nuevo archivo de resultados tsv con los valores del módulo de Young enmascarados, haga clic en Guardar, Guardar histograma y Guardar datos en la barra de menú superior. En la ventana emergente que aparece, haga clic en Seleccionar todo para elegir qué resultados escribir en el archivo tsv.
A continuación, haga clic en el botón Aceptar para confirmar la selección. En el cuadro de diálogo Guardar, introduzca un nombre para el archivo tsv, elija la ubicación de guardado deseada y haga clic en Aceptar para guardar los resultados filtrados. Los valores del módulo de Young de la membrana basal pulmonar exhibieron una distribución logarítmica normal con un valor máximo de 9,31 y una desviación estándar de 0,18, lo que arroja un módulo de Young representativo de 11,05 kilopascales.
Estos hallazgos se confirmaron aún más mediante un diagrama cuantil-cuantil.
