The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. Preparação de material de vidro e Culturas <ol><li> Antes de prosseguir com esta experiência, preparar agar sangue 5% de ovelha (SBA) placas para o cultivo de MRSA. Incubar as placas SBA durante 24 horas à temperatura de 37 ° C. Após este tempo,, colónias individuais bem isoladas deve estar presente para ser utilizado para as inoculações subsequentes em meios líquidos. Loja estrias SBA placas com colónias isoladas a 4 ° C durante 1 - 2 meses. NOTA: placas de agar de sangue de ovelha-se em embalagens contendo pré-fabricados entre 20-25 placas com base no fabricante, e consistem tipicamente numa base de agar de tripticase de soja com adição de 5% w / v de sangue de ovelha. </li><li> Adicione 500 ml de caldo de soja tríptica (TSB) suplementada com 1% de glucose e 0,1% de NaCl. Depois disso, recolher e limpar 2 tubos de ensaio de vidro. Se tampas autoclaváveis ​​não estão disponíveis para tubos de ensaio, use uma folha de alumínio como uma tampa. Autoclave TSB e tubos de ensaio, juntamente com uma caixa de 1 ml pontas de pipeta. </li><li> Debaixo de uma cabine de segurança biológica ou perto de uma Bunsen queimador, pipeta de 5 ml de previamente autoclavada TSB em tubos de ensaio autoclavado. Ter cuidado para garantir que o tempo suficiente tenha sido dada para permitir que o TSB e tubos de ensaio arrefecer até à temperatura ambiente. A partir de uma placa de 5% SBA anteriormente listado, inocular uma única colônia em 6 ml de caldo TSB. Uma vai conter MRSA, e o segundo tubo de ensaio será utilizado como um controlo negativo para assegurar a esterilidade. </li><li> Tome tubos de ensaio TSB inoculados e colocá-los numa incubadora recíproco durante 24 horas a 37 ° C e a 200 rpm. Após este tempo, o crescimento microbiano deve ser aparente no tubo de ensaio, enquanto não houve crescimento de MRSA deve ter ocorrido no tubo de ensaio de controlo. </li><li> Tome 1 ml de cultura de 24 horas e pipeta em 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm. </li><li> Pipetar 1 mL de 6 horas de sub-cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de H 2 O. desionizada Centrífuga, repito, e suspender novamente. </li></ol><ol><li> Tome aço inoxidável e discos de amostra de AFM ouro (20 mm e 10 mm de diâmetro, respectivamente) e limpar cada um dos lados com 5 ml de H 2 O. desionizada Segurar discos de amostra no lado dominante com uma pinça e usar a mão para subdominant pipeta de 5 ml de cada lado do disco de amostra. Depois de lavar ambos os lados, discos lugar amostra num copo contendo 20 ml de H2O desionizada, seguido por sonicação durante 1 minuto. </li><li> Após utilização de sonicação fórceps para remover os discos da amostra a partir do copo. Coloque os discos de modo que eles se inclinar em um ângulo de 60 ° contra a borda de uma placa de Petri aberta em uma toalha de papel. Utilizar a tampa da placa de Petri para cobrir os discos de secagem. Deixe secar totalmente os discos antes de prosseguir. O tempo de secagem pode variar entre 4-8 horas. </li><li> Depois de seco, use uma pinça para colocar discos de amostra em uma placa de Petri. <ol><li> Opcionalmente, funcionalizar as superfícies dos discos com qualquer material de amostra (por exemplo, colagénio, ácido hialurônico, nano-partículas de prata, etc.). </li><li> Para esta experiência, usar poli-L-lisina para revestir a superfície do substrato. Por poli-L-lisina funcionalização, pipeta 200-400 ul de 0,1% de poli-L-lisina (em H2O) em discos de amostras, e deixou incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa placa de Petri. </li><li> Após 1 h, utilizar uma pinça para segurar o disco de amostra, e lava-se com 1 ml de H 2 O. desionizada Deixar secar em toalhas de papel, como descrito no passo 2.2. </li></ol></li><li> Tome 2x células re-suspenso lavados e placa 200-400 mL em discos de amostra dentro de uma cabine de segurança biológica. Se os discos de amostras são revestidas com poli-L-lisina, incubar durante 0,5 horas à temperatura ambiente. </li><li> Após incubação das células em discos de amostra, lavar discos amostra suavemente com 1 ml de H 2 O. desionizada Vamos discos secar durante a noite antes de imagem. </li></ol> 3. KPFM Imagem NOTA: Para esta experiência,usar um Agilent série 5500 ILM-AFM. <ol><li> Para iniciar AFM, ligue unidade de computador, juntamente com HEB e MAC III controlador da AFM. Abra o software de imagens AFM (por exemplo, da Agilent PicoView). Certifique-se de selecionar inicialmente ACAFM ou qualquer designação correta é no AFM para geração de imagens em modo intermitente-contact. </li><li> Utilizando uma pinça AFM na mão dominante, e segurando o titular clipe de mola aberta com a mão subdominant, coloque um cantilever KPFM para a cabeça-peça. Tenha cuidado ao manusear e transferindo a peça de cabeça AFM para o AFM que esta unidade (pelo menos no 5500 ILM-AFM) contém a unidade de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z e direcionalidades digitalização. NOTA: As consolas KPFM utilizados neste caso foram Mikromasch condutora DPE (baixo ruído) cantilevers com frequências de ressonância média de 80 kHz e primavera constantes de 2,7 N / m. Cantilevers com estas frequências de ressonância e constantes de mola foram escolhidos devido a sua facilidade de uso.Cantilevers com maiores constantes de mola mais elevadas frequências de ressonância e também pode ser usado para imagiologia. </li><li> Arrumar com cuidado cabeça peça na AFM e ligar os fios apropriados (neste caso dois fios precisa ser conectado em: Laser e estágio motor de elevação). </li><li> Alinhar o laser para a ponta do braço de suporte. Algumas unidades contêm uma funcionalidade que permite a câmara de alinhamento mais fácil. Se a funcionalidade da câmera não está presente no AFM, alinhar na ponta cantilever conforme descrito a seguir: <ol><li> Gire o botão no sentido horário front-to-back para mover o laser overtop o chip cantilever. Quando o laser atinge o chip será bloqueado e não será mais visível. Apenas gire o botão algumas vezes. </li><li> Gire o botão front-to-back sentido anti-horário até o ponto de laser reaparece. O laser é agora na borda do chip. </li><li> Gire o botão da esquerda para a direita para posicionar o laser no cantilever. Como o laser passa sobre o cantilever ele vai desaparecer e reaparecer in rápida sucessão. O ponto de laser deve ser visível na tampa de vidro fosco onde a unidade fotodiodo mais tarde irá se sentar. </li><li> Rode o botão de front-to-back para a esquerda para mover o local para baixo o cantilever para a ponta até o local no vidro fosco desaparece. </li><li> Vire o-to-back frente botão no sentido horário apenas ligeiramente, a fim de posicionar o laser de modo que ele só se senta na ponta cantilever. O ponto de laser irá reaparecer no vidro fosco. NOTA: Este é o método de posicionamento a laser para consolas trampolim. Para cantilevers triangulares, o processo de alinhamento é um pouco diferente. </li></ol></li><li> Uma vez que o laser está alinhado, manter o motor na fase de elevação na posição &quot;aberto&quot; durante 10 segundos para assegurar espaço suficiente entre o braço de suporte e fixação da amostra quando a amostra para a AFM. </li><li> Colocar a amostra no palco amostra KPFM. Aterrar a amostra usando um fio de cobre. Ligue os fios apropriados da AFM para o estágio da amostra. Ligue os sTage ao AFM. Na maioria dos casos, a fase é mantida no lugar através de magnetos. </li><li> No software AFM, ajustar o braço de suporte e, em seguida, iniciar abordagem da ponta cantilever para a amostra. Certifique-se de que o tempo de estabilização é fixado em não mais do que 10 ms, e que a velocidade de aproximação não exceder 2,0 mm / s, a fim de evitar danos na ponta. </li><li> Uma vez que a ponta cantilever é na superfície da amostra, selecione um tamanho da janela de imagem e área de imagem ideal. Otimizar ganhos I e P, juntamente com o set point cantilever assim que a imagem topográfica é otimizado. <ol><li> Depois de imagem topográfica é otimizado, ligue módulo KPFM (tanto no modo AM FM ou, aqui, use o modo FM). Deve notar-se que KPFM imagem é muito desafiante fora da janela de imagem 5 mm x 5 mm. Além disso, para a imagem latente KPFM ideal, use uma resolução de 512 x 512 com velocidades lentas de digitalização (0,02-0,05 linhas / seg). </li></ol></li><li> Para definições FM-KPFM (não ACAFM configurações), defina o percentual de carro entre 5-10%. Defina a fr cantileverequency entre 1 - 5 kHz, com uma largura de banda de 2 kHz. Definir I e ganhos P para as definições FM-KPFM a 0,3%. <ol><li> Varie a largura de banda do sinal e eu e os ganhos de P entre as superfícies de amostras. Para otimizar SP imagem, ajustar ainda mais a largura de banda do sinal e eu e os ganhos P obter imagens mais favoráveis. O intervalo recomendado de ganhos I e P são 0,22-0,35%. </li></ol></li><li> Processar e analisar as imagens coletadas KPFM usando software de processamento de pós-imagem para coletar dados SP. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

KPFM foi empregado como uma nova técnica para a obtenção de dados elétricos de superfície. Ele tem sido comumente usada como um método para a análise de distribuição de carga em química e só recentemente começou a ser aplicado para o estudo de sistemas biológicos na micro e nano-escala. A partir dos dados coletados, descobrimos que os micróbios não pareceu facilmente anexar para limpar superfícies de aço inoxidável e ouro, mesmo após 3 horas de incubação estática. Superfícies funcionalizadas poli-...

Os biofilmes produzidos nas superfícies dos equipamentos e em feridas cutâneas apresentam um problema para a indústria médica como biofilmes são recalcitrantes à remoção e pode levar a um aumento das taxas de transmissão da doença e resistência aos antimicrobianos. Anexo é o primeiro passo na formação de biofilme e é a etapa mais crítica, devido à sua reversibilidade 1-3. Características de superfície do substrato desempenham um papel crucial na adesão microbiana. Factores tais como a dureza da superfície, a porosidade, rugosidade, hidrofobicidade e têm sido mostrados para efectuar a adesão microbiana; No entanto, pouca investigação examinar o potencial papel da superfície do substrato (SP) na adesão microbiana tem sido feito 4,5. Superfícies carregadas negativamente impedir a penhora de esporos de Bacillus thuringiensis a mica, silício e ouro 6. Alterações no potencial da membrana celular são indicativos de alterações na adesão celular e a motilidade 5,7. Tem sido observado que hom electricamentesuperfícies ogeneous mais facilmente promover a adesão microbiana 5. Caracterizar o potencial de superfície de bactérias à escala nanométrica pode proporcionar uma nova maneira de entender a cinética de adesão de bactérias a superfícies diferentes, e assim pode ajudar no desenvolvimento de estratégias anti-incrustação biológica. Ao contrário de outros métodos utilizados para caracterizar a cinética electro de bactérias, como eletroforética espalhamento de luz, o potencial zeta, e determinação do ponto isoelétrico, microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) permite a análise de células individuais em vez de culturas inteiras 11/08. Isso é benéfico quando se quer comparar célula-célula ou biofilme características elétricas com alta precisão e exatidão. KPFM é um módulo de microscopia de força atômica (AFM). AFM foi desenvolvido como um resultado direto do microscópio de tunelamento (STM) 12. As imagens publicadas pela primeira vez usando STM foram feitas por Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer em 1982 12 </sup&gt;. Sua invenção foi capaz de resolver estruturas atômicas por raster digitalizando uma ponta condutora afiada sobre uma superfície condutora de ar. As implicações de conseguir imagens de alta resolução biólogos que rapidamente tentaram usar STM a imagem amostras secas de DNA, proteínas e vírus 12 animado. STM também pode ser feito de líquidos usando pontas de prova especializados 13. Isto foi demonstrado por Lindsay et ai., Que utilizado STM e AFM para moléculas de ADN da imagem em 10 mM de HClO 4 e na água, em eléctrodos de ouro 13. KPFM foi demonstrada na determinação dos potenciais de superfície de análise de DNA e proteína de 25 e biomoléculas interacção com ligandos 26. KPFM opera através da medição da diferença de potencial contacto (CPD), entre uma ponta cantilever condutor e uma amostra de AFM idealmente condutor (Figura 1, i) 14,15. As amostras não têm necessariamente de ser condutora (ie, sampl biológicaes). A imagiologia pode ser realizado em mica, vidro e superfícies de silício (não condutores), desde que a superfície não condutiva é fina e tem um material condutor subjacente 6,7. O DPC é equivalente ao potencial de tensão de superfície e pode ser descrita como a diferença nas funções de trabalho entre a ponta (tip φ) e amostra (amostra φ), dividida pela carga do electrão negativo (- e). Quando uma ponta de AFM condutor é levado para perto de uma superfície da amostra (separados por uma distância d), uma força electrostática (F es) é gerado, devido à diferença nas energias de Fermi (Figura 1, ii, a) 15. Neste ponto, as energias de vácuo da ponta e amostra (E v) estão em equilíbrio e alinhados. Ao trazer a extremidade mais perto da superfície da amostra, a superfície da ponta e a amostra entrem em contacto eléctrico e agir como capacitores de placas paralelas (Figura 1, b, ii </strong&gt;) 14,15. No ponto, as energias de Fermi superfície da ponta e da amostra se alinham, atingindo um equilíbrio de estado estacionário (Figura 1, ii, b). A ponta e amostra de superfície será cobrado e um CPD V irá formar devido a uma diferença de funções E v &#39;s e de trabalho. A F es age na área de contato elétrico devido ao CPD V formado. Esta força é subsequentemente anulada através da aplicação de um V DC externa da ponta que tem a mesma grandeza que o DPC V formado (Figura 1, ii, c). Esta tensão de CC aplicada elimina carga de superfície na área de contacto eléctrico, e a quantidade de V CC necessária para eliminar as es de F V CPD é igual à diferença nas funções de trabalho entre a sasuperfície mple e gorjeta de 15. Deve notar-se que a função de trabalho da ponta é conhecido e é fornecida pelos fabricantes. Em todos os métodos KPFM, uma tensão alternada (CA V, cerca de 100 - 500 mV) é também aplicado na ponta, a fim de gerar forças eléctricas oscilantes entre a ponta ea amostra 14. Isto proporciona uma melhor resolução ao medir mudanças na V CPD e / ou F es. Neste contexto, as alterações na frequência e amplitude de oscilação eléctrica pode ser corrigido por V DC, e mapas de potencial de superfície pode ser gerado. Os dados de áreas específicas destes mapas pode ser ainda analisada a fornecer informações elétrica sobre características topográficas específicas. KPFM pode ser operado em três modos: (1) Modo de levantamento, o modo (2), modulação de amplitude (AM), e modulação de frequência (FM) de modo 14,16 (3). Modo de elevação foi o inc inicialarnation de KPFM. Elevador modo baseia-se num método de duas passagens em que um ponta com oscilação é arrastado através da superfície para se obter uma imagem topográfica. Para o segundo passe a ponta é levantada uma distância pré-definida acima da amostra (10-100 nm) e digitalizada para o outro lado da mesma área. Devido a este método de duas passagens, o modo de elevador, em comparação com AM- e FM-KPFM, leva mais tempo para aquisição de imagem. Aumentando a ponta para fora da superfície garante que apenas longo alcance F es é medido. Além disso, conversas cruzadas entre topografia e medições de superfície potenciais é desacoplada à custa do aumento da resolução lateral e sensibilidade. AM-KPFM melhora a resolução lateral e sensibilidade usando dual-frequências para medir simultaneamente topografia da amostra e potencial de superfície (varredura de uma passagem) 14. No modo de AM, o braço de suporte é oscilado mecanicamente, geralmente 5% abaixo da sua primeira frequência de ressonância (f 0), e electricamente oscilado (through um AC V) em sua segunda frequência de ressonância (f 1). Mudanças na amplitude de f 0, para a geração de dados topográficos, enquanto as mudanças na amplitude de f 1, devido a mudanças na F es e V CPD, fornecer dados de medição do potencial de superfície. f 0 e f 1 do cantilever são separados por freqüências e energias significativas que sinalizam cross-talk é minimizado 14. A caixa eletrônica de cabeça (HEB) da AFM separa os dois sinais para dar tanto topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente em uma varredura. FM-KPFM melhora a resolução ainda mais longe do AM-KPFM em superfícies biológicas 14. FM-KPFM funciona de forma diferente do que o AM-KPFM no que mede a evolução gradientes força eletrostática, em vez de força eletrostática (F es) 15. Como modo de AM, FM utiliza modo dual-frequências e um singlmecanismo de varredura de e-pass para obter topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente 14. No modo FM, o cantilever é mecanicamente oscilaram em torno de f 0 e eletricamente oscilou em uma freqüência modificado baixo (f mod, tipicamente 1-5 kHz). Após interações eletrostáticas, f 0 e f mix mod para produzir faixas laterais de f 0 ± f mod. Estas bandas laterais são muito sensíveis às mudanças na força electrostática, e pode ser separado a partir de f 0 HEB através da AFM. Desde FM-KPFM mede as alterações em gradientes de força electrostática, o dicas forma ápice e sua manutenção / integridade desempenhar um papel crítico na superfície global potencial resolução 14, 15. Superfície potencial resolução com AM e modos de FM estão na gama de 1 nm, 14 lateralmente -16. Deve notar-se que KPFM imagiologia pode ser feito em líquidos não polares, e, mais recentemente, tem sido mostrado para ser feito em (&lt;10 mM) líquidos polares de baixo iónico (emKPFM modos de malha aberta, que não requerem uma reacção de polarização, obviando a aplicação de uma polarização DC), tais como água MilliQ; no entanto, KPFM imaging ainda tem de ser feito em células vivas em soluções polares 17-20. Desafios adicionais associados com SP imaging em líquido é que as soluções comumente usado para manutenção de células (ou seja, tampão fosfato salino) têm altas concentrações de íons móveis, o que levaria a reações faradaica, dinâmica de carga induzida por viés e difusão do íon / redistribuição 20. Assim, para esta experiência, as medidas foram tomadas a partir de células secas por MRSA e mortos em superfícies em aço inoxidável funcionalizadas com poli-L-lisina de aço e ouro sob condições ambientes. A imagiologia pode ser realizado em condições de ar ou de vácuo, em amostras biológicas que foram previamente secos ou imobilizados em superfícies 20. Condições de umidade também foram mostrados para afetar imagem KPFM de superfícies 6. Neste estudo, foram empregados FM-KPFMe AFM para examinar o papel de SP sobre a penhora de resistente à meticilina Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) para superfícies de aço inoxidável e ouro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA foi recentemente ganhou status como um multi-resistente (MDR) &quot;superbactéria&quot;, devido à sua resistência selecionados naturalmente a muitos antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas 21. Infecções MRSA são agora mais desafiadora, difícil e formidável de tratar, que conduz à utilização de agentes antimicrobianos mais duras, tais como a vancomicina ou oxazolidinonas que possuem níveis mais elevados de toxicidade em seres humanos e, portanto, não podem ser utilizados como tratamentos de longo prazo 22. O aço inoxidável foi escolhida devido à sua relevância médica e uso comum como um material em agulhas hipodérmicas, comadres, maçanetas, pias, etc. O ouro foi usado como um metal comparativa. FM-KPFM foi utilizado para examinar se microbiana membrana SP muda mediante adesão aos substratos.

<table><tbody><tr><td>5500ILM Atomic Force Microscope</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Stainless steel sample discs</td></tr><tr><td>DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ:DPE-XSC11</td><td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.</td></tr><tr><td>PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Gold sample discs</td></tr><tr><td>PicoView Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td></tr><tr><td>Pico Image Software (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Pre-made plates</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.</td></tr></tbody></table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

Potencial de superfície é uma característica física geralmente negligenciado que desempenha um papel dominante na adesão de microorganismos para substrato superfícies. Microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) é um módulo de microscopia de força atômica (AFM), que mede a diferença de potencial entre as superfícies de contato na escala nano. A combinação de KPFM com a AFM permite a produção simultânea de potencial de superfície e mapas topográficos de amostras biológicas, tais como células bacterianas. Aqui, nós empregamos KPFM para examinar os efeitos do potencial de superfície sobre a adesão microbiana em superfícies medicamente relevantes, tais como aço inoxidável e ouro. Mapas de potencial de superfície revelou diferenças de potencial de superfície para membranas microbianas em diferentes substratos de materiais. Um gráfico passo-a altura foi gerado para mostrar a diferença de potencial na superfície uma área de fronteira entre a superfície do substrato e microrganismos. Alterações no potencial de membrana da superfície celular têm sido relacionados com a mudanças no metabolismo celular e a motilidade. Portanto, KPFM representa uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para examinar as alterações da superfície microbiana potencial de membrana sobre a adesão a várias superfícies do substrato. Neste estudo, nós demonstramos o procedimento para caracterizar o potencial de superfície de células de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina USA100 individuais em aço inoxidável e ouro usando KPFM.

A capacidade de medir utilizando SP KPFM baseia-se no princípio de que tanto a superfície da amostra e o braço de suporte da ponta condutora são, em certa medida. Aço inoxidável e ouro agiu superfícies como condutores para que MRSA foram anexados. KPFM imagens foram tiradas de 15 células por MRSA em ambas as superfícies com 512 x 512 de resolução, e com as áreas de análise que variam de 5 x 5 mm a 10 x 10 mm. Varredura foi realizada com velocidades de linha que variam de 0,02 linhas / seg de 0,05 linhas / s...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

surface-potential-measurement-bacteria-using-kelvin-probe-force

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.7K visualizações.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Scanning-probe Single-electron Capacitance Spectroscopy

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the electronic quantum structure of small systems - including individual atomic dopants in semiconductors. Here we present a capacitance-based method, known as Subsurface Charge Accumulation (SCA) imaging, which is capable of resolving single-electron charging while achieving sufficient spatial resolution to image individual atomic dopants. The use of a capacitance technique enables observation of subsurface features, such as dopants buried many nanometers beneath the surface of a semiconductor material1,2,3. In principle, this technique can be applied to any system to resolve electron motion below an insulating surface.
As in other electric-field-sensitive scanned-probe techniques4, the lateral spatial resolution of the measurement depends in part on the radius of curvature of the probe tip. Using tips with a small radius of curvature can enable spatial resolution of a few tens of nanometers. This fine spatial resolution allows investigations of small numbers (down to one) of subsurface dopants1,2. The charge resolution depends greatly on the sensitivity of the charge detection circuitry; using high electron mobility transistors (HEMT) in such circuits at cryogenic temperatures enables a sensitivity of approximately 0.01 electrons/Hz&frac12; at 0.3 K 5.

Scanning-probe single-electron capacitance spectroscopy facilitates the study of single-electron motion in localized subsurface regions. A sensitive charge-detection circuit is incorporated into a cryogenic scanning probe microscope to investigate small systems of dopant atoms beneath the surface of semiconductor samples.

-Sonda de varredura único elétron Espectroscopia de capacitância

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the ...

Engenharia

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

Aderência de bactérias para plantar superfícies medidas em laboratório

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Ambiente

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and chemical composition of sample with nanoscale resolution. By combining AFM with IR, the spatial resolution limitation of conventional IR is overcome, enabling a resolution of 20&#8211;100 nm to be achieved. This opens the door for a broad array of new applications of IR toward probing samples smaller than several micrometers, previously unachievable by means of conventional IR microscopy. AFM-IR is eminently suited for bacterial research, providing both spectral and spatial information at the single cell and intracellular level. The increasing global health concerns and unfavorable future prediction regarding bacterial infections, and especially, rapid development of antimicrobial resistance, has created an urgent need for a research tool capable of phenotypic probing at the single cell and subcellular level. AFM-IR offers the potential to address this need, by enabling detail characterization of chemical composition of a single bacterium. Here, we provide a complete protocol for sample preparation and data acquisition of single spectra and mapping modality, for the application of AFM-IR toward bacterial studies.

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) provides a powerful platform for bacterial studies, enabling to achieve nanoscale resolution. Both, mapping of subcellular changes (e.g., upon cell division) as well as comparative studies of chemical composition (e.g., arising from drug resistance) can be conducted at a single cell level in bacteria.

Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Química

Co-localizing Kelvin Probe Force Microscopy with Other Microscopies and Spectroscopies: Selected Applications in Corrosion Characterization of Alloys

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin probe, both of which measure the Volta potential difference (VPD) between an oscillating probe tip and a sample surface by applying a nulling voltage equal in magnitude but opposite in sign to the tip-sample potential difference. By scanning a conductive KPFM probe over a sample surface, nanoscale variations in surface topography and potential can be mapped, identifying likely anodic and cathodic regions, as well as quantifying the inherent material driving force for galvanic corrosion.
Subsequent co-localization of KPFM Volta potential maps with advanced scanning electron microscopy (SEM) techniques, including back scattered electron (BSE) images, energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental composition maps, and electron backscattered diffraction (EBSD) inverse pole figures can provide further insight into structure-property-performance relationships. Here, the results of several studies co-localizing KPFM with SEM on a wide variety of alloys of technological interest are presented, demonstrating the utility of combining these techniques at the nanoscale to elucidate corrosion initiation and propagation.
Important points to consider and potential pitfalls to avoid in such investigations are also highlighted: in particular, probe calibration and the potential confounding effects on the measured VPDs of the testing environment and sample surface, including ambient humidity (i.e., adsorbed water), surface reactions/oxidation, and polishing debris or other contaminants. Additionally, an example is provided of co-localizing a third technique, scanning confocal Raman microscopy, to demonstrate the general applicability and utility of the co-localization method to provide further structural insight beyond that afforded by electron microscopy-based techniques.

Kelvin probe force microscopy (KPFM) measures surface topography and differences in surface potential, while scanning electron microscopy (SEM) and associated spectroscopies can elucidate surface morphology, composition, crystallinity, and crystallographic orientation. Accordingly, the co-localization of SEM with KPFM can provide insight into the effects of nanoscale composition and surface structure on corrosion.

Co-localização Kelvin Sonbe Force Microscopy com outras microscopias e espectroscopias: aplicações selecionadas na caracterização de corrosão de ligas

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Biologia

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

Microscopia de Força Atômica em Modo de Contato como Técnica Rápida para Observação Morfológica e Análise de Danos Celulares Bacterianos

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...