В наших исследованиях мы исследуем влияние механических свойств внеклеточного матрикса на поведение клеток и целостность тканей. Мы хотим понять, как взаимодействие между клетками и их микроокружением влияет на патологические процессы, такие как образование метастазов. С помощью анализа данных механических свойств легочной базальной мембраны мы обнаружили, что более мягкие базальные мембраны более устойчивы к инвазии раковых клеток.
Метод, представленный в нашем протоколе, позволяет проводить криосекцию и механическое исследование незафиксированных биологических образцов с сохранением механических свойств. Кроме того, он показывает способ определения модуля Юнга исключительно базальной мембраны внутри альвеолярной стенки с помощью измерения и фильтрации с помощью атомно-силового микроскопа, описанных в нашем протоколе. Следующим шагом является получение дополнительной информации о динамике жесткости базальной мембраны и ее роли в развитии и патологических процессах для потенциального улучшения диагностики и выбора вариантов лечения.
Для начала извлеките форму, содержащую замороженную оптимальную температуру резки, или ОКТ, сложную встроенную ткань легких мыши из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия. Поместите двусторонний скотч в центр предметного стекла микроскопа с матовым краем. Накатайте на ленту 15-миллилитровую центрифужную трубку, чтобы обеспечить прочное сцепление без пузырьков.
Убедитесь, что длина ленты совпадает с шириной блока ОКТ, содержащего образец. Подпишите слайды карандашом, указав информацию о образце и номера разделов. Вставьте подготовленные предметные стекла микроскопа в слайд-бокс.
Поместите предметный ящик внутрь криотомного аппарата, чтобы охладить предметные стекла. Затем заполните два внутренних кольца держателя образцов средой OCT. Поместите образец в среду ОКТ на держатель образца.
Поместите держатель образца в криотомного камеру примерно на 10 минут, пока среда OCT полностью не затвердеет и образец не будет надежно зафиксирован. Теперь установите держатель образца на режущую ступень криотома. Приложите к образцу кусочек односторонней клейкой ленты, сильно прижав холодным большим пальцем.
Сделайте срез ткани толщиной 15 микрометров с помощью криотома. Используйте щетку для направления секции и предотвращения отсоединения клейкой ленты во время процедуры резки. Используйте охлажденное предметное стекло микроскопа с двусторонним скотчем и плотно прижмите его к срезу, чтобы захватить его.
Поместите предметное стекло с изображением секции обратно в блок слайдов. Чтобы откалибровать кантилевер методом теплового шума, поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик атомно-силового микроскопа, или АСМ. Поместите головку АСМ на предметный столик.
Затем опустите головку АСМ с помощью шаговых двигателей до тех пор, пока зазор между держателем кантилевера и предметным стеклом микроскопа не составит примерно один-два миллиметра. С помощью одномиллилитрового шприца с длинной иглой нанесите PBS на боковую сторону держателя кантилевера, позволяя ему стекать вниз и образовывать жидкий мениск в промежутке. В управляющем программном обеспечении АСМ для выполнения калибровки на основе контактов перейдите на страницу «Сбор данных» и выберите параметр «Расширенный вид».
Чтобы получить доступ к Calibration Manager, нажмите кнопку меню бургера, расположенную в правом верхнем углу. Затем выберите метод Contact-based (На основе контакта) и MLCT-F (Консоль MLCT-F) в раскрывающемся меню Name (Имя) в качестве имени кантилевера. Введите один вольт в поле Заданное значение и 10 в поле Количество сканирований.
На странице Получение данных введите установочное значение в один вольт для автоматической процедуры приближения на левой панели управления. Нажмите синюю кнопку со стрелкой, указывающей вниз, в верхнем левом углу интерфейса, чтобы запустить автоматический заход на посадку. Когда заход на поверхность завершен и консоль соприкоснется со предметным стеклом микроскопа, нажмите кнопку «Калибровать» в окне «Диспетчер калибровки», чтобы начать калибровку.
После завершения калибровки закройте окно Диспетчера калибровки и убедитесь, что в предварительно выбранном каталоге создан файл калибровки, содержащий определенные результаты калибровки. Для начала достаньте из морозильной камеры предметное стекло, содержащее разрезанные ткани легких мыши. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик АСМ.
Нажмите на кнопку со значком гаечного ключа в правом верхнем углу пользовательского интерфейса, чтобы перейти к Диспетчеру настроек. В разделе Approach Settings установите высоту цели на четыре микрометра. Затем в разделе «Настройки текущего режима» в разделе «Дополнительные настройки обратной связи» установите множитель равным единице.
В подразделе «Принудительные настройки» в разделе «Настройки текущего режима» выберите «Втянутый пьезо» в выпадающем меню «Режим» в конце. На левой панели управления задайте параметры для кривых силового отступа. Для NanoWizard 4 XP и кантилевера MLCT входное значение F составляет пять наноньютонов, длина Z — восемь микрометров, а скорость Z — 300 микрометров в секунду.
Затем определите местоположение и размер исходной обзорной карты сил, которая будет охватывать всю альвеолярную стенку, простираясь от одной воздушной стороны до другой. Установите количество пикселей на 50 на 50. После записи обзорной карты захватите более сфокусированную карту сил размером три на три микрометра или четыре на четыре микрометра на базальной мембране, сохраняя количество пикселей на кривых 50 на 50.
Чтобы проанализировать кривые вдавливания силы, запустите CANTER Processing Toolbox в MATLAB и откройте приложение Force Curve Analysis. Затем, чтобы загрузить силовую карту с высоким разрешением раздела легких, нажмите «Выбрать файл», перейдите к месту сохранения, дважды щелкните файл и выберите «Загрузить данные». Когда появится всплывающее окно с запросом значений калибровки для кантилевера, введите значения калибровки в соответствующие поля редактирования.
Нажмите кнопку «Отправить», чтобы продолжить. После появления второго всплывающего окна продолжите процедуру загрузки карты количественного изображения, или QI, нажав кнопку «Отправить». По завершении процесса нагружения на экране отображается начальная силовая кривая карты силы.
Установите глубину подгонки в соответствующем поле редактирования на 1,5 микрометра и выберите с помощью Hertz Fit для алгоритма поиска контактов. Чтобы применить аппроксимацию модифицированной модели Герца ко всем кривым вдавливания силы карты QI, нажмите кнопку Сохранить Применить ко всем. После завершения анализа последней силовой кривой появится окно для сохранения файлов.
Нажмите «Да» и введите имя для файлов результатов. Для пространственной фильтрации карты QI из окна «Выбор приложения» на наборе инструментов CANTER Processing выберите инструмент «Фильтрация результатов» и нажмите кнопку «Запустить приложение». Чтобы загрузить результаты подгонки, нажмите кнопку «Открыть» в верхней строке меню пользовательского интерфейса инструмента фильтрации результатов.
В следующем всплывающем окне найдите первую кнопку «Установить» на вкладке «Карты JPK» и выберите файл tsv, содержащий результаты анализа кривой силы. Затем нажмите на вторую кнопку «Установить» и найдите файл карты QI, соответствующий выбранному файлу tsv. Затем нажмите кнопку Отправить, чтобы загрузить данные карты и результаты анализа кривой силы.
В раскрывающемся меню Отображаемый канал вверху выберите опцию EModul, чтобы отобразить результаты модуля Юнга в виде изображения карты. Затем в раскрывающемся меню Канал данных под графиком гистограммы выберите опцию EModul для визуализации распределения загруженных значений модуля Юнга карты QI. Затем нажмите на кнопку со стрелкой «Поток манипуляций» в центре пользовательского интерфейса, убедившись, что она указывает на правую сторону.
Установите переключатель Фильтр изображения в положение Вкл на панели Фильтр над осями гистограммы. В выпадающем меню Фильтр геометрии выберите опцию От руки, а затем нажмите кнопку Добавить. На изображении верхнего канала нарисуйте маску фильтра, обводя базальную мембрану, удерживая левую кнопку мыши.
Когда закончите, отпустите кнопку мыши и дважды кликните по маске, чтобы применить ее к карте. Чтобы сохранить новый файл результатов tsv с замаскированными значениями модуля Янга, нажмите «Сохранить», «Сохранить гистограмму» и «Сохранить данные» в верхней строке меню. В появившемся всплывающем окне нажмите «Выбрать все», чтобы выбрать, какие результаты записывать в файл tsv.
Затем нажмите на кнопку «ОК», чтобы подтвердить выбор. В диалоговом окне «Сохранить» введите имя файла tsv, выберите нужное место сохранения и нажмите кнопку «ОК», чтобы сохранить отфильтрованные результаты. Значения модуля Юнга легочной базальной мембраны показали логарифмическое нормальное распределение с пиковым значением 9,31 и стандартным отклонением 0,18, что дает репрезентативный модуль Юнга 11,05 кПа.
Эти результаты были дополнительно подтверждены квантиль-квантильным графиком.
