우리의 연구에서는 세포 외 기질의 기계적 특성이 세포 행동과 조직 무결성에 미치는 영향을 조사합니다. 우리는 세포와 미세환경 간의 상호 작용이 전이 형성과 같은 병리학적 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하고자 합니다. 폐 기저막의 기계적 특성을 데이터 마이닝함으로써 우리는 더 부드러운 기저막이 암세포 침입에 더 강하다는 것을 발견했습니다.
당사의 프로토콜에 제시된 방법은 고정되지 않은 생물학적 샘플의 동결 절제 및 기계적 조사를 가능하게 하여 기계적 특성을 보존합니다. 또한 우리 프로토콜에 설명된 원자력 현미경 측정 및 필터링 절차에 의해 폐포 벽 내부의 기저막의 Young's modulus만을 결정하는 방법을 보여줍니다. 다음 단계는 기저막 강성의 역학과 발달 및 병리학적 과정에서의 역할에 대해 자세히 알아보고 잠재적으로 진단을 개선하고 치료 옵션을 안내하는 것입니다.
먼저 영하 80도의 냉동고에서 동결된 최적 절단 온도(OCT) 화합물이 내장된 마우스 폐 조직이 들어 있는 곰팡이를 제거합니다. 양면 접착 테이프를 젖빛 가장자리 현미경 슬라이드의 중앙에 놓습니다. 테이프 위에 15ml 원심분리기 튜브를 굴려 단단하고 기포 없는 접착력을 보장합니다.
테이프의 길이가 샘플이 포함된 OCT 블록의 너비와 일치하는지 확인합니다. 연필로 슬라이드에 샘플 정보와 섹션 번호를 포함하여 레이블을 지정합니다. 준비된 현미경 슬라이드를 슬라이드 상자에 삽입합니다.
슬라이드 상자를 극저온 챔버 내부에 놓아 슬라이드를 식힙니다. 다음으로, 샘플 홀더의 내부 두 링을 OCT 배지로 채웁니다. 샘플 홀더의 OCT 매체 내에 샘플을 배치합니다.
OCT 매체가 완전히 응고되고 샘플이 단단히 고정될 때까지 약 10분 동안 샘플 홀더를 극저온 챔버에 놓습니다. 이제 샘플 홀더를 cryotome의 절단 단계에 설치합니다. 차가운 엄지 손가락으로 단단히 눌러 단면 접착 테이프 조각을 샘플에 부착합니다.
cryotome을 사용하여 15마이크로미터 조직 단면을 생성합니다. 브러시를 사용하여 섹션을 지시하고 절단 절차 중에 접착 테이프가 분리되는 것을 방지하십시오. 양면 접착 테이프가 있는 냉각 현미경 슬라이드를 사용하여 섹션에 단단히 눌러 집습니다.
섹션을 운반하는 슬라이드를 슬라이드 상자에 다시 놓습니다. thermal noise 방법을 사용하여 캔틸레버를 보정하려면 원자력 현미경 또는 AFM의 샘플 스테이지에 현미경 슬라이드를 놓습니다. AFM 헤드를 s에 놓습니다.amp르 stage.
그런 다음 캔틸레버 홀더와 현미경 슬라이드 사이의 간격이 약 1-2mm가 될 때까지 스테퍼 모터를 사용하여 AFM 헤드를 내립니다. 긴 바늘이 달린 1밀리리터 주사기를 사용하여 PBS를 캔틸레버 홀더 측면에 바르면 PBS가 아래로 흐르고 틈새에 유체 반월판이 형성되도록 합니다. AFM 제어 소프트웨어에서 연락처 기반 캘리브레이션을 수행하려면 Acquire Data(데이터 수집) 페이지로 이동하여 Advanced(고급) View(고급) 옵션을 선택합니다.
오른쪽 상단 모서리에 있는 버거 메뉴 버튼을 클릭하여 Calibration Manager에 액세스합니다. 그런 다음 방법으로 접촉 기반을 선택하고 이름 드롭다운 메뉴에서 MLCT-F 캔틸레버를 캔틸레버 이름으로 선택합니다. Setpoint 필드에 1볼트를 입력하고 Number of scans 필드에 10볼트를 입력합니다.
Acquire Data(데이터 획득) 페이지에서 왼쪽 제어판에 자동 접근 절차를 위해 1볼트의 설정값을 입력합니다. 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 파란색 아래쪽 화살표 버튼을 클릭하여 자동 접근 방식을 시작합니다. 접근이 완료되고 캔틸레버가 현미경 슬라이드와 접촉하면 Calibration Manager 창에서 Calibrate 버튼을 클릭하여 보정을 시작합니다.
보정이 완료되면 보정 관리자 창을 닫고 결정된 보정 결과가 포함된 미리 선택된 디렉토리에 보정 파일이 생성되었는지 확인합니다. 시작하려면 냉동고에서 절편화된 쥐 폐 조직이 들어 있는 표본 슬라이드를 회수합니다. 현미경 슬라이드를 s에 놓습니다.ampAFM의 스테이지.
사용자 인터페이스의 오른쪽 상단 모서리에 있는 렌치 아이콘이 있는 버튼을 클릭하여 설정 관리자로 이동합니다. 접근 설정 섹션에서 대상 높이를 4마이크로미터로 설정합니다. 그런 다음 Advanced Feedback Settings(고급 피드백 설정)의 Current Mode Settings(현재 모드 설정) 섹션에서 승수를 1로 설정합니다.
Current Mode Settings의 Force Settings 하위 섹션에 있는 Mode at end 드롭다운 메뉴에서 Retracted Piezo를 선택합니다. 왼쪽 제어판에서 힘 압입 곡선에 대한 매개변수를 설정합니다. NanoWizard 4 XP 및 MLCT 캔틸레버 F의 경우 설정값을 5나노뉴턴으로, Z 길이를 8마이크로미터로, Z 속도를 초당 300마이크로미터로 입력합니다.
다음으로, 한 공기 쪽에서 다른 쪽 면으로 확장되는 전체 폐포 벽을 포함하도록 초기 개요 힘 맵의 위치와 크기를 정의합니다. 픽셀 수를 50 x 50으로 설정합니다. 개요 맵을 기록한 후 기저 멤브레인에서 3 x 3 마이크로미터 또는 4 x 4 마이크로미터 크기의 보다 집중된 힘 맵을 캡처하고 픽셀 수를 50 x 50 곡선으로 유지합니다.
하중 압흔 곡선을 분석하려면 MATLAB에서 CANTER Processing Toolbox를 실행하고 하중 곡선 분석 응용 프로그램을 여십시오. 그런 다음 폐 단면의 고해상도 힘 맵을 로드하려면 Select File(파일 선택)을 클릭하고 저장 위치로 이동하여 파일을 두 번 클릭하고 Load Data(데이터 로드)를 선택합니다. 캔틸레버에 대한 교정 값을 요청하는 팝업 창이 나타나면 해당 편집 필드에 교정 값을 입력합니다.
제출 버튼을 클릭하여 계속 진행합니다. 두 번째 팝업 창에서 제출 버튼을 클릭하여 정량적 이미징 또는 QI 맵의 로딩 절차를 계속합니다. 로딩 프로세스가 완료되면 힘 맵의 초기 힘 곡선이 화면에 표시됩니다.
해당 편집 필드의 맞춤 깊이를 1.5마이크로미터로 설정하고 연락처 찾기 알고리즘에 대해 via Hertz fit을 선택합니다. 수정된 Hertz 모델의 맞춤을 QI 맵의 모든 힘 압입 곡선에 적용하려면 모두 적용 유지 버튼을 클릭합니다. 마지막 힘 곡선 분석이 완료되면 파일을 저장할 수 있는 창이 나타납니다.
예를 클릭하고 결과 파일의 이름을 입력합니다. CANTER Processing Toolbox의 Application Selection 창에서 QI 맵의 공간 필터링을 수행하려면 Result Filtering Tool을 선택하고 Start Application 버튼을 클릭하십시오. 맞춤 결과를 로드하려면 결과 필터링 도구 사용자 인터페이스의 상단 메뉴 표시줄에서 열기를 클릭합니다.
후속 팝업 창에서 JPK Maps 탭 아래의 첫 번째 Set 버튼을 찾아 힘 곡선 해석 결과가 포함된 tsv 파일을 선택합니다. 그런 다음 두 번째 세트 버튼을 클릭하고 선택한 tsv 파일에 해당하는 QI 맵 파일을 찾습니다. 그런 다음 제출을 클릭하여 맵 데이터를 로드하고 곡선 해석 결과를 강제로 적용합니다.
맨 위에 있는 표시된 채널 드롭다운 메뉴에서 EModul 옵션을 선택하여 Young의 모듈러스 결과를 맵 이미지로 표시합니다. 그런 다음 히스토그램 플롯 아래의 데이터 채널 드롭다운 메뉴에서 EModul 옵션을 선택하여 QI 맵의 로드된 Young's modulus 값의 분포를 시각화합니다. 그런 다음 사용자 인터페이스 중앙에 있는 조작 흐름 화살표 버튼을 클릭하여 오른쪽을 가리키도록 합니다.
히스토그램 축 위의 필터 패널에서 이미지 필터 토글 버튼을 켜기 위치로 설정합니다. Filter geometry 드롭다운 메뉴에서 Freehand 옵션을 선택한 다음 Add 버튼을 클릭합니다. 상단 채널 이미지에서 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 기저막을 빙빙 돌며 필터 마스크를 그립니다.
그런 다음 완료되면 마우스 버튼을 놓고 마스크를 두 번 클릭하여 맵에 적용합니다. 마스킹된 Young의 모듈러스 값으로 새 tsv 결과 파일을 저장하려면 상단 메뉴 표시줄에서 Save(저장), Save histogram(히스토그램 저장) 및 Save data(데이터 저장)를 클릭합니다. 팝업 창이 나타나면 모두 선택을 클릭하여 tsv 파일에 쓸 결과를 선택합니다.
그런 다음 확인 버튼을 클릭하여 선택을 확인합니다. 저장 대화 상자에서 tsv 파일의 이름을 입력하고 원하는 저장 위치를 선택한 다음 확인을 클릭하여 필터링된 결과를 저장합니다. 폐기저막의 Young's modulus 값은 피크 값이 9.31이고 표준 편차가 0.18인 로그 정규 분포를 나타내어 11.05킬로파스칼의 대표 Young's modulus를 산출했습니다.
이러한 결과는 분위수-분위수 플롯에 의해 추가로 확인되었습니다.
