Nosso método permite a rápida caracterização de partes genéticas usando sistemas de expressão livre de células e PCR em vez de clonagem. A principal vantagem desta técnica é que normalmente leva dias a semanas nas células pode ser feito em horas a dias usando este método. Nosso protocolo inclui etapas para criar seus próprios sistemas de expressão livre de células, o que pode ser complicado em vários lugares e pode exigir ajustes, dependendo do caso de uso.
Ao começar, recomendamos começar com kits comerciais. Comece preparando a mistura mestra de PCR de acordo com as instruções do manuscrito e armazene-a no gelo. Aliquot 30 ou 40 microlitros da mistura mestre no número determinado de tubos de PCR e adicione 10 microlitros de cada cinco primers variáveis micromolares a tubos de PCR adequadamente rotulados.
Coloque os tubos de PCR no termociclador e execute o programa de PCR conforme mencionado no manuscrito do texto. Em seguida, mantenha as reações em quatro graus Celsius. Se o molde original for DNA plasmático, adicione um microlitro de enzima de restrição DpnI para digerir o molde original e incubar as reações a 37 graus Celsius por uma hora.
Analise cinco microlitros de cada produto de PCR, separando-os usando um gel de agarose a 1% a 180 volts por 20 minutos. Verifique o tamanho correto da banda, que varia de acordo com a sequência principal escolhida e o comprimento das peças adicionadas. Purifice os modelos lineares usando um kit de purificação de PCR comercial.
Se várias bandas estiverem presentes por eletroforese em gel, extirpe as bandas de interesse do gel e purifique o DNA usando um kit comercial de extração de gel, de acordo com as instruções do fabricante. Quantifique cada molde de DNA usando um espectrofotômetro, avaliando sua qualidade verificando se a proporção de 260 a 280 nanômetros é de aproximadamente 1,8. Descongele todos os componentes no gelo e prepare uma mistura mestra misturando todos os componentes completamente com uma pipeta, como mencionado no manuscrito.
Preste muita atenção para evitar a precipitação, especialmente para a mistura de aminoácidos. Mantenha a mistura mestra no gelo. Resfrie uma placa de 384 poços no gelo e distribua a mistura mestra em alíquotas de nove microlitros em cada poço.
Descongele a proteína repressora no gelo e distribua-a em uma placa de fonte acústica de manuseio de líquidos, garantindo que a quantidade apropriada de volume morto necessária para o tipo de placa fonte usada seja incluída. Distribua a proteína represadora em volumes de um microlitro nos poços de destino apropriados através do manipulador de líquidos. Inclua uma diluição em série do repórter purificado ou um padrão químico apropriado na placa para comparar os resultados com outros estudos e outros laboratórios.
Escolha uma faixa de concentrações apropriada para o repórter usado na faixa de expressão esperada dos experimentos. Pré-aqueça o leitor de placas a 30 graus Celsius. Se possível, no instrumento, defina um gradiente de temperatura vertical de um grau Celsius para limitar a condensação na vedação.
Defina o leitor de placas para ler nas configurações apropriadas para o repórter usado na sequência principal, sem agitar as etapas. Sele a placa de 384 poços com uma vedação de plástico impermeável para evitar a evaporação. Coloque a placa de 384 poços no suporte da placa e comece a ler.
15 modelos lineares, variando apenas na distância do promotor T7 em relação à sequência tetO, foram preparados por PCR, amplificando o repórter de proteína fluorescente verde superpasta, com primers projetados para adicionar cada variante promotora. A análise de dados de um total de 540 reações para todo o conjunto de combinações de tetO T7 mostrou que a RNA polimerase T7 regula negativamente a expressão impulsionada por T7 igualmente, até 13 pares de bases a jusante desde o início do transcrito T7. Uma dosagem mais consistente em toda a série de oito poços de destino usando o manipulador de líquidos acústicos foi observada quando uma transferência de cinco microlitros foi dividida em dispensações separadas de um microlitro.
Nosso protocolo pode ser usado para rastrear rapidamente componentes genéticos, seja para triagem de novos biossensores ou construção de bibliotecas de partes genéticas.
