تسمح طريقتنا بالتوصيف السريع للأجزاء الجينية باستخدام أنظمة التعبير الخالية من الخلايا وتفاعل البوليميراز المتسلسل بدلا من الاستنساخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي ما يستغرق عادة من أيام إلى أسابيع في الخلايا يمكن القيام به في ساعات إلى أيام باستخدام هذه الطريقة. يتضمن بروتوكولنا خطوات لإنشاء أنظمة التعبير الخالية من الخلايا الخاصة بك ، والتي يمكن أن تكون صعبة في عدد من الأماكن وقد تتطلب تعديلات حسب حالة الاستخدام.
عند البدء لأول مرة ، نوصي بالبدء بمجموعات تجارية. ابدأ بإعداد مزيج PCR الرئيسي وفقا للتعليمات الواردة في المخطوطة وتخزينه على الجليد. حصة 30 أو 40 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في العدد المحدد من أنابيب PCR وإضافة 10 ميكرولتر من كل خمسة بادئات متغيرة ميكرومولار إلى أنابيب PCR ذات العلامات المناسبة.
ضع أنابيب PCR في العجلة الحرارية وقم بتشغيل برنامج PCR كما هو مذكور في مخطوطة النص. ثم أمسك التفاعلات عند أربع درجات سلزية. إذا كان القالب الأصلي هو الحمض النووي للبلازما ، فأضف ميكرولترا واحدا من إنزيم تقييد DpnI لهضم القالب الأصلي واحتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
قم بتحليل خمسة ميكرولتر من كل منتج PCR عن طريق فصلها باستخدام هلام أغاروز 1٪ عند 180 فولت لمدة 20 دقيقة. تحقق من حجم النطاق الصحيح ، والذي سيختلف باختلاف التسلسل الأساسي المختار وطول الأجزاء المضافة. تنقية القوالب الخطية باستخدام مجموعة تنقية PCR التجارية.
في حالة وجود نطاقات متعددة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي ، قم باستئصال النطاقات ذات الأهمية من الجل وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حدد كل قالب من قوالب الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وقم بتقييم جودته عن طريق التحقق من أن نسبة 260 إلى 280 نانومتر تبلغ حوالي 1.8. قم بإذابة جميع المكونات على الجليد وقم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق خلط جميع المكونات جيدا باستخدام ماصة ، كما هو مذكور في المخطوطة.
انتبه جيدا لتجنب هطول الأمطار ، خاصة بالنسبة لخليط الأحماض الأمينية. الحفاظ على مزيج ماستر على الجليد. قم بتبريد طبق 384 بئرا على الثلج ووزع المزيج الرئيسي في تسعة ميكرولتر في كل بئر.
قم بإذابة البروتين الكابت على الثلج وتوزيعه في لوحة مصدر معالجة السوائل الصوتية ، مما يضمن تضمين الكمية المناسبة من الحجم الميت المطلوب لنوع لوحة المصدر المستخدمة. قم بتوزيع البروتين الكابت في أحجام ميكرولتر واحد في الآبار الوجهة المناسبة عبر معالج السائل. قم بتضمين تخفيف تسلسلي للمراسل المنقى أو معيار كيميائي مناسب على اللوحة لمقارنة النتائج مع الدراسات الأخرى والمختبرات الأخرى.
اختر مجموعة من التركيزات المناسبة للمراسل المستخدم في نطاق التعبير المتوقع للتجارب. قم بتسخين قارئ اللوحة إلى 30 درجة مئوية. إذا أمكن ، على الجهاز ، اضبط تدرج درجة حرارة عمودي بدرجة مئوية واحدة للحد من التكثيف على الختم.
اضبط قارئ اللوحة على القراءة في الإعدادات المناسبة للمراسل المستخدم في التسلسل الأساسي ، دون اهتزاز الخطوات. أغلق اللوحة التي يبلغ عدد 384 بئرا بختم بلاستيكي غير منفذ لمنع التبخر. ضع اللوحة التي تحتوي على 384 بئرا على حامل اللوحة وابدأ القراءة.
تم إعداد 15 نموذجا خطيا ، تختلف فقط في مسافة مروج T7 بالنسبة إلى تسلسل tetO ، بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما أدى إلى تضخيم مراسل البروتين الفلوري الأخضر فائق الحجم ، مع مواد أولية مصممة لإضافة كل متغير من أنواع المروج. أظهر تحليل البيانات من إجمالي 540 تفاعلا لمجموعة كاملة من مجموعات T7 tetO أن بوليميراز T7 RNA ينظم التعبير المدفوع ب T7 بالتساوي ، حتى من خلال 13 زوجا من القواعد في اتجاه مجرى النهر من بداية نسخة T7. لوحظ توزيع أكثر اتساقا عبر سلسلة من ثمانية آبار وجهة باستخدام معالج السائل الصوتي عندما تم تقسيم نقل خمسة ميكرولتر إلى توزيعات منفصلة بحجم ميكرولتر واحد.
يمكن استخدام بروتوكولنا لفحص المكونات الجينية بسرعة ، سواء لفحص أجهزة الاستشعار الحيوية الجديدة أو بناء مكتبات الأجزاء الجينية.
