O protocolo é muito significativo porque permite o uso rápido, fácil e direto de modelos lineares de DNA em sistemas de síntese de proteínas livres de células, mesmo a partir de parâmetros nativos de E.coli. As principais vantagens são a quantidade de tempo economizada ao evitar a clonagem, modificações químicas de extremidades lineares de DNA e suplementos protetores como DNA gama ou chi. Como os extratos de síntese de autorrelato estão sendo desenvolvidos para diferentes organismos de interesse, nosso método apresenta uma maneira de acelerar a prototipagem nesses extratos usando DNA linear.
Para começar, estique BL21 Rosetta-2 delta recBCD de menos 80 graus Celsius glicerol em uma placa de ágar YTP 2x que contém 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, inocular uma única colônia da placa de ágar em um pouco mais de 40 mililitros de 2x YTP suplementados com 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com agitação de 200 RPM. Em seguida, faça uma subcultura diluindo a cultura noturna 100 vezes em quatro litros de meio YTP fresco 2x contendo 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol.
Divida os quatro litros do meio em quatro frascos separados. Incubar a 37 graus Celsius, 200 RPM, por cerca de três a quatro horas de crescimento para atingir uma densidade óptica de 1,5 a 2,0. Coloque a cultura no gelo, gire as células a 5.000 G por 12 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o sobrenadante por decantação.
Em seguida, ressuspeite os pellets de células em 800 mililitros de S30A refrigerado com TDT. Novamente, gire as células a 5.000 G por 12 minutos a quatro graus Celsius, como demonstrado anteriormente, e descarte o sobrenadante por decantação. Depois de ressuspender os pellets de células em 160 mililitros de S30A refrigerado com TDT, transfira as células para tubos refrigerados e pré-pesados de 50 mililitros.
Gire as células a 2000 G por oito minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o sobrenadante por decantação. Novamente, gire as células a 2000 G por quatro minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, remova o sobrenadante restante cuidadosamente usando uma pipeta. Em seguida, remeça o peso do tubo para calcular o peso do pellet celular e mantenha os pellets de célula a menos 80 graus Celsius.
Depois de tomar os pellets de célula de menos 80 graus Celsius, descongele-os no gelo por uma a duas horas e ressuspenda os pellets de célula em 0,9 mililitros de S30A com tampão TDT por grama do peso do pellet celular. Em seguida, pipete lentamente para ressuspender as células, evitando a espuma superior, tanto quanto possível. Coloque alíquotas de um mililitro das células ressuspensas em microtubos de 1,5 mililitro e mantenha-as no gelo ou em um bloco frio pré-resfriado a quatro graus Celsius.
Em seguida, sonicate cada tubo em um sonicator com uma configuração de 20% de amplitude por três ciclos e gire para baixo o lisado a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de coletar o sobrenadante com uma pipeta, transfira para um tubo de 50 mililitros. Incubar o lisado celular a 37 graus Celsius a 200 RPM de agitação por 80 minutos.
Depois de girar o lisado e coletar o sobrenadante em microtubos pré-resfriados de 1,5 mililitro, alíquota de 30 microlitros em tubos pré-resfriados de PCR 8 tiras, mantendo todos os tubos no gelo. Congelar rapidamente as alíquotas de lisado no gelo seco e armazenar a menos 80 graus Celsius. Prepare uma master mix de acordo com a guia de preparação do buffer, conforme descrito no manuscrito.
Para um volume de reação de 10,5 microlitros, adicione 1,05 microlitro de diferentes concentrações de estoque de Mg-glutamato e 9,45 microlitros da mistura mestra e misture suavemente. Pipete 10 microlitros das reações acima em uma microplaca inferior quadrada de 384 poços e cubra-a usando um selo de placa adesiva. Meça a expressão gênica como saída de fluorescência registrando dados de fluorescência com um leitor de placas em intervalos regulares por oito horas de incubação a 30 graus Celsius com agitação orbital contínua a 307 ciclos por minuto.
Depois de identificar a concentração de Mg-glutamato que resulta no maior valor de fluorescência no ponto final, prossiga para a calibração de K-glutamato. Execute o experimento e identifique o maior valor de fluorescência entre as concentrações de K-glutamato testadas, identificando assim a composição tampão ideal para Mg-glutamato e K-glutamato para este lisado. Uma vez estabelecidos os valores de Mg-glutamato e K-glutamato, preparar tubos de estoque da composição otimizada do tampão de acordo com o volume do lote obtido.
Depois de calcular o número de tubos tampão necessários, alíquota 38 microlitros por tubo e armazenar a menos 80 graus Celsius. Primeiro, rotule um microtubo de 1,5 mililitro para a preparação ideal da mistura master. Adicione os volumes corretos do buffer e lisado e misture-os suavemente.
Em seguida, pipete as amostras de DNA primeiro, seguido por água livre de nuclease e, finalmente, a mistura mestre ideal. Misture a reação sem células suavemente com uma pipeta antes de adicionar ao leitor de placas e evite bolhas. Depois de configurar as reações no leitor de placas, as corridas cinéticas registraram dados de fluorescência em intervalos regulares por oito horas de incubação a 30 graus Celsius com agitação orbital contínua a 307 ciclos por minuto.
Após a calibração do lisado, a concentração ótima de Mg-glutamato foi semelhante em oito milimolares entre os extratos para DNA linear e plasmídico. No entanto, a concentração ideal de K-glutamato para o DNA plasmídico é de 140 milimolares, enquanto a concentração ótima de K-glutamato para o DNA linear é de 20 milimolares. Após as etapas de calibração, os níveis de expressões de GFP foram comparados entre o DNA linear e plasmidial nos extratos wild-type, delta recB e delta recBCD.
A expressão de GFP do DNA linear atingiu 102% e 138% da expressão do DNA plasmídico em extratos das cepas delta recB e delta recBCD, respectivamente. As coisas mais importantes no protocolo são a lise de sonicação da célula e as etapas de calibração do tampão separadamente para o DNA linear e plasmídico, particularmente ao usar os parâmetros nativos. Essa técnica ajudaria a acelerar o teste de projetos biológicos em sistemas livres de células, por exemplo, a triagem de biossensores, enzimas e vias, ou prototipagem de circuitos genéticos sintéticos.
