Yöntemimiz, klonlama yerine hücresiz ekspresyon sistemleri ve PCR kullanılarak genetik parçaların hızlı karakterizasyonuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerde tipik olarak günler ila haftalar süren şeylerin, bu yöntem kullanılarak saatler ila günler içinde yapılabilmesidir. Protokolümüz, çeşitli yerlerde zor olabilen ve kullanım durumuna bağlı olarak ayarlamalar gerektirebilecek kendi hücresiz ifade sistemlerinizi oluşturma adımlarını içerir.
İlk başladığınızda, ticari kitlerle başlamanızı öneririz. PCR master karışımını makaledeki talimatlara göre hazırlayarak başlayın ve buz üzerinde saklayın. Ana maddenin Aliquot 30 veya 40 mikrolitresi, belirlenen sayıda PCR tüpüne karışır ve uygun şekilde etiketlenmiş PCR tüplerine her beş mikromolar değişken primerden 10 mikrolitre eklenir.
PCR tüplerini termosikler içine yerleştirin ve metin yazısında belirtildiği gibi PCR programını çalıştırın. Ardından, reaksiyonları dört santigrat derecede tutun. Orijinal şablon plazma DNA'sı ise, orijinal şablonu sindirmek için bir mikrolitre DpnI kısıtlama enzimi ekleyin ve reaksiyonları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Her PCR ürününün beş mikrolitresini, 20 dakika boyunca 180 voltta% 1'lik bir agaroz jeli kullanarak ayırarak analiz edin. Seçilen çekirdek dizisine ve eklenen parçaların uzunluğuna göre değişecek doğru bant boyutunu kontrol edin. Ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanarak lineer şablonları saflaştırın.
Jel elektroforezi ile birden fazla bant mevcutsa, ilgili bantları jelden çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre ticari bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın. Her DNA şablonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün, 260 ila 280 nanometre oranının yaklaşık 1.8 olduğunu kontrol ederek kalitesini değerlendirin. Tüm bileşenleri buz üzerinde çözün ve el yazmasında belirtildiği gibi tüm bileşenleri bir pipetle iyice karıştırarak bir ana karışım hazırlayın.
Özellikle amino asit karışımı için çökelmeyi önlemeye dikkat edin. Ana karışımı buz üzerinde tutun. 384 kuyucuklu bir plakayı buz üzerinde soğutun ve ana karışımı dokuz mikrolitrelik alikotlarda her bir oyuğa dağıtın.
Baskılayıcı proteini buz üzerinde çözün ve akustik bir sıvı işleme kaynak plakasına dağıtın, böylece kullanılan kaynak plaka tipi için gereken uygun miktarda ölü hacmin dahil edilmesini sağlayın. Basınç proteinini bir mikrolitrelik hacimlerde sıvı işleyici aracılığıyla uygun hedef kuyucuklara dağıtın. Sonuçları diğer çalışmalar ve diğer laboratuvarlarla karşılaştırmak için saflaştırılmış muhabirin seri seyreltilmesini veya plakaya uygun bir kimyasal standart ekleyin.
Deneylerin beklenen ifade aralığında kullanılan muhabir için uygun bir konsantrasyon aralığı seçin. Plaka okuyucuyu 30 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Mümkünse, cihaz üzerinde, conta üzerindeki yoğuşmayı sınırlamak için bir santigrat derece dikey sıcaklık gradyanı ayarlayın.
Plaka okuyucuyu, adımları sarsmadan çekirdek dizide kullanılan muhabire uygun ayarlarda okunacak şekilde ayarlayın. Buharlaşmayı önlemek için 384 delikli plakayı geçirimsiz bir plastik conta ile kapatın. 384 delikli plakayı plaka tutucuya yerleştirin ve okumaya başlayın.
Sadece T7 promotörünün tetO dizisine göre uzaklığında değişen 15 doğrusal şablon, PCR tarafından hazırlandı ve her promotör varyantını eklemek için tasarlanmış primerlerle süper klasör yeşil floresan protein raporlayıcısını güçlendirdi. Tüm T7 tetO kombinasyonları seti için toplam 540 reaksiyondan elde edilen verilerin analizi, T7 RNA polimerazının, T7 transkriptinin başlangıcından itibaren aşağı yönde 13 baz çiftine kadar T7 güdümlü ekspresyonu eşit şekilde aşağı doğru düzenlediğini göstermiştir. Akustik sıvı işleyiciyi kullanan sekiz hedef kuyu serisi boyunca daha tutarlı dağıtım, beş mikrolitrelik bir transfer ayrı bir mikrolitrelik dağıtımlara bölündüğünde gözlendi.
Protokolümüz, yeni biyosensörlerin taranması veya genetik parçaların kütüphanelerinin oluşturulması için genetik bileşenleri hızlı bir şekilde taramak için kullanılabilir.
