Nuestro método permite la caracterización rápida de partes genéticas utilizando sistemas de expresión libre de células y PCR en lugar de clonación. La principal ventaja de esta técnica es que lo que normalmente lleva días o semanas en las células se puede hacer en horas o días utilizando este método. Nuestro protocolo incluye pasos para crear sus propios sistemas de expresión sin células, que pueden ser complicados en varios lugares y pueden requerir ajustes según el caso de uso.
Al comenzar, recomendamos comenzar con kits comerciales. Comience preparando la mezcla maestra de PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y guárdela en hielo. Alícuota 30 o 40 microlitros de la mezcla maestra en el número determinado de tubos de PCR y agregue 10 microlitros de cada cinco cebadores variables micromolares a los tubos de PCR debidamente marcados.
Coloque los tubos de PCR en el termociclador y ejecute el programa de PCR como se menciona en el texto manuscrito. Luego, mantenga las reacciones a cuatro grados centígrados. Si la plantilla original es ADN plasmático, agregue un microlitro de enzima de restricción DpnI para digerir la plantilla original e incube las reacciones a 37 grados centígrados durante una hora.
Analizar cinco microlitros de cada producto de PCR separándolos utilizando un gel de agarosa al 1% a 180 voltios durante 20 minutos. Compruebe el tamaño de banda correcto, que variará con la secuencia de núcleo elegida y la longitud de las piezas añadidas. Purificar las plantillas lineales utilizando un kit de purificación de PCR comercial.
Si varias bandas estaban presentes por electroforesis en gel, extirpe las bandas de interés del gel y purifique el ADN utilizando un kit de extracción de gel comercial, según las instrucciones del fabricante. Cuantifique cada plantilla de ADN utilizando un espectrofotómetro, evaluando su calidad comprobando que la relación de 260 a 280 nanómetros es aproximadamente 1.8. Descongele todos los componentes en hielo y prepare una mezcla maestra mezclando bien todos los componentes con una pipeta, como se menciona en el manuscrito.
Preste mucha atención para evitar la precipitación, especialmente para la mezcla de aminoácidos. Mantenga la mezcla maestra en hielo. Enfríe una placa de 384 pocillos en hielo y distribuya la mezcla maestra en alícuotas de nueve microlitros en cada pocillo.
Descongele la proteína represora en hielo y distribúyala en una placa fuente acústica de manejo de líquidos, asegurando que se incluya la cantidad adecuada de volumen muerto requerido para el tipo de placa fuente utilizada. Distribuya la proteína represora en volúmenes de un microlitro en los pocillos de destino apropiados a través del manipulador de líquidos. Incluya una dilución en serie del reportero purificado o un estándar químico apropiado en la placa para comparar los resultados con otros estudios y otros laboratorios.
Elija un rango de concentraciones apropiado para el informador utilizado en el rango de expresión esperado de los experimentos. Precaliente el lector de placas a 30 grados centígrados. Si es posible, en el instrumento, establezca un gradiente de temperatura vertical de un grado Celsius para limitar la condensación en el sello.
Configure el lector de placas para que lea en la configuración apropiada para el reportero utilizado en la secuencia central, sin agitar los pasos. Selle la placa de 384 pocillos con un sello de plástico impermeable para evitar la evaporación. Coloque la placa de 384 pocillos en el soporte de la placa y comience a leer.
Se prepararon 15 plantillas lineales, que varían solo en la distancia del promotor T7 en relación con la secuencia tetO, mediante PCR, amplificando la supercarpeta reportero de proteína fluorescente verde, con cebadores diseñados para agregar cada variante del promotor. El análisis de los datos de un total de 540 reacciones para todo el conjunto de combinaciones de T7 tetO mostró que la ARN polimerasa T7 regula a la baja la expresión impulsada por T7 por igual, hasta 13 pares de bases aguas abajo desde el inicio de la transcripción T7. Se observó una dispensación más consistente en la serie de ocho pozos de destino utilizando el manejador de líquido acústico cuando una transferencia de cinco microlitros se dividió en dispensaciones separadas de un microlitro.
Nuestro protocolo se puede utilizar para detectar rápidamente los componentes genéticos, ya sea para la detección de nuevos biosensores o la construcción de bibliotecas de partes genéticas.
