Gostaríamos de agradecer a Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, PhD para o desenvolvimento do protocolo. Suporte total para o internacional materna pediátrica adolescente AIDS clínicos ensaios grupo (IMPAACT) foi fornecido pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) do National Institutes of Health (NIH) sob os números do prêmio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), com o co-financiamento do Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) e o Instituto Nacional de Saúde Mental (NIMH). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH.

Para todas as etapas do protocolo, adequado equipamentos de proteção individual (EPI) devem ser usado, e abordagens de prevenção de contaminação rigorosas precisam ser tomadas. Observe o fluxo de trabalho de Pre-amplificação trabalhar áreas para áreas de trabalho pós-amplificação para minimizar a contaminação das amostras. Todas as fontes usadas são estéreis, livres de DNase, RNase, DNA e pirogênio. Todas as pontas de pipetas são filtradas. Um fluxograma das etapas do protocolo é fornecido (Figura 1).
1. amostra Lysis
Nota: Lise de amostra e extração de ácidos nucleicos são executadas usando um kit de extração de DNA/RNA em um ambiente de sala limpa, onde os controles de engenharia e processuais estão no lugar para minimizar a introdução de bactérias ambientais para as amostras.
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpar o gabinete de segurança biológica (BSC) área com limpador de superfície apropriado para eliminar qualquer contaminação de ácido nucleico de trabalho.</li>
		<li>Ligue o reaccional de temperatura controlada e, em seguida, configurá-lo para 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar o tampão de Lise guanidínio tiocianato (ver tabela de materiais)
	<ol>
<li>Verifique a Lise para precipitados. Re-dissolver precipitados por aquecimento a 37 ° C.</li>
		<li>Prepare-se para cada amostra de 600 µ l de tampão de Lise com 6 µ l β-mercaptoetanol (β-ME). Considere um volume extra de 20% por amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da amostra
	<ol>
<li>Se o leite integral é congelado, descongele no gelo. Alíquota 5ml de todo o leite em um 15 mL ou em um tubo estéril 5 mL em BSC e mantê-lo no gelo.</li>
		<li>Gire o 5 mL leite alíquota para 10 min a 5.000 x g a 4 ° C para células de Pelotas.</li>
		<li>Remover a camada de gordura, agora a camada superior do tubo, com uma espátula de plástico ou grande furo a ponta da pipeta.</li>
		<li>Sem perturbar o sedimento, retire todo o sobrenadante com exceção de 100 µ l.</li>
		<li>Lave o pellet por resuspending em 1 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).</li>
		<li>Prepare 1 controlo negativo, adicionando 1 mL de PBS estéril para um tubo de 5 mL.</li>
		<li>Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 mL limpa e girar em um microcentrifuge para 1 min (5.000 x g à temperatura ambiente (RT)).</li>
		<li>Use uma ponta de pipeta estéril de filtrado de 1.000 µ l para descartar toda a camada sobrenadante/gordos.</li>
		<li>Se não extrair o mesmo dia, estala congelar a célula da pelota colocando-o em uma pasta de gelo seco-etanol e transferi-lo imediatamente ao congelador a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Interrupção de amostra e homogeneização (batimento de grânulo)
	<ol>
<li>Adicione 600 µ l de tampão de Lise contendo β-ME para a pelota e transferir a suspensão a um tubo do grânulo.</li>
		<li>Cada lote de extração de 12 contém 10 amostras, 1 controle negativo (preparado na etapa 3.7 acima) e 1 controle positivo (preparada na próxima etapa).<ol>
<li>Prepare 1 controle positivo com Lise e 20 µ l da amostra bacteriana simulada (Comunidade simulada usada tem uma concentração, uma vez extraída, de aproximadamente 0,2 ng / µ l de DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vórtice todos talão tubos vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Amostras de calor sobre a temperatura controlada reaccional a 37 ° C por 10 min, agitando a 700-800 rpm.</li>
		<li>Carregar os tubos para o conjunto do adaptador disruptor amostra automatizado.</li>
		<li>Grânulo de vencer por 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Desmontar o conjunto de adaptador e alternar manualmente o adaptador em conjunto com as placas de amostra do braço robótico esquerdo para o braço direito robótico do instrumento.</li>
		<li>Grânulo de bate por mais 1 minutos a 30 Hz.</li>
		<li>Tubos de centrífuga a 17.200 x g, durante 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Remova todo o sobrenadante com uma pipeta de 200 µ l, tomando cuidado para não pegar qualquer um da camada de gordura na parte superior da amostra ou o grânulo residual na parte inferior da amostra e aplicar a uma coluna de homogeneizador.</li>
		<li>Colunas de homogeneizador centrífuga na velocidade máxima, 17.200 x g, durante 3 minutos a 25 ° C.</li>
		<li>Transferência de 350 µ l de eluato para tubo de microcentrifugadora um-2ml do fabricante para uso com o instrumento automatizado para purificação de DNA e RNA (não utilize qualquer outro tubo). Tenha cuidado para não transferir qualquer camada gordurosa residual.</li>
		<li>Se o volume de escoamento inferior a 350 µ l, adicione tampão de Lise com β-ME até um volume final de 350 µ l.</li>
		<li>Deixe as amostras no RT para até 2 h antes de prosseguir para o isolamento de ácidos nucleicos, usando o instrumento de purificação de DNA automatizado, ou congelar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpeza de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpa todas as superfícies em usam uma solução de descontaminação não enzimáticos, deixar por 10 min, então pulverize com etanol a 70% e limpe a superfície a.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolar o DNA/RNA
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Ligar o bloco de calor e definir a temperatura de 70 ° C.</li>
		<li>Ligue o reaccional de temperatura controlada e seleccionar a temperatura de 37 ° c.</li>
		<li>Aquecer o tampão de eluição (EB) contendo 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, em um tubo de 50 mL para 70 ° C.</li>
		<li>Aquecer a 350 µ l de amostra congelada lysates em tubos de 2 mL a 37 ° C até completamente descongelados sem qualquer precipitado (aproximadamente 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificação de DNA
	<ol>
<li>Vórtice e centrifugar os tubos de 2 mL com amostra brevemente (3000 x g durante 10 s).</li>
		<li>Inserir tubos 2 mL shaker seguindo o gráfico de carga do instrumento purificação automatizado de DNA/RNA, as instruções do fabricante.</li>
		<li>Se os adaptadores de rotor e configurá-los na bandeja com base no número de amostras.</li>
		<li>Etiquete cada adaptador de rotor com base na identificação da amostra (ID).</li>
		<li>Corte as tampas e suavizar as arestas de colunas individuais de rotação para DNA e RNA.</li>
		<li>Insira o adaptador do rotor a coluna de rotação de DNA sem o tubo de coleta. Descarte o tubo de coleta.</li>
		<li>Rotular 1,5 mL a tubos de colheita e inserir em adaptadores de rotor.</li>
		<li>Conjunto de adaptadores de rotor em centrífuga seguindo o gráfico de carga do instrumento purificação automatizado de DNA/RNA.</li>
		<li>Inserção 1.000 µ l filtro-dicas do fabricante em racks de ponta.</li>
		<li>Adicione água livre de RNase para tubo de microcentrifugadora um 2 mL do fabricante baseado no número de amostras (por instruções de protocolo específico de máquina).</li>
		<li>Introduza o tubo na ranhura do tubo "A" de slots de tubo de microcentrifugadora.</li>
		<li>Descarte qualquer reagente que sobra em frascos de reagente e encha-a com um volume mínimo de 10 mL.</li>
		<li>Inserir o rack de reagente garrafa (exceto garrafa EB) frascos de reagente.</li>
		<li>Adicione EB quente de um tubo de 50 mL para a frasco de reagente posição 6.</li>
		<li>Tubos de 1,5 mL de verificação são colocados firmemente em adaptadores do rotor.</li>
		<li>Feche a tampa do instrumento e selecione: "RNA" → "extração kit" → "Animal, tecidos e células" → "do kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" editar o Volume de eluição para 100 µ l (padrão) ou 50 µ l para baixa biomassa amostras → → "Iniciar."</li>
		<li>Quando completo, remover adaptadores de rotor de centrífuga e colocá-los na bandeja.</li>
		<li>Descarte a coluna de rotação de DNA do rotor adaptador posição 3.</li>
		<li>Não deposite estes adaptadores de rotor, o RNA é na posição 2.</li>
		<li>Remova os tubos de colheita de 1,5 mL contendo DNA eluted na posição 3 e armazenar em −20 ° C.</li>
		<li>Colete amostra contendo tubos de agitador e loja em −20 ° C, se qualquer amostra que sobra, caso contrário descartar.</li>
		<li>Continue com o protocolo "do kit nome 350 µ l parte B RNA" para mais purificação do RNA.</li>
		<li>Purificação de RNA será feita desde a aproximadamente 350 µ l de passagem que está na posição do meio de adaptadores do rotor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificação de RNA
	<ol>
<li>Insira a coluna de rotação de RNA sem sua tampa e tubo de coleta no adaptador do rotor.</li>
		<li>Rótulo novo 1,5 mL tubos de coleção e inseri-los no adaptador do rotor, conforme indicado no manual.</li>
		<li>Defina os adaptadores de rotor em centrífuga seguindo o gráfico de carga do instrumento purificação automatizado de DNA/RNA.</li>
		<li>Feche a tampa do instrumento e selecione: "RNA" → "Do fabricante Kit" → "Animal, tecidos e células" → "Padrão parte B RNA" → "Start".</li>
		<li>Quando concluído, remover adaptadores de rotor de centrífuga e colocá-los na bandeja.</li>
		<li>Descarte a coluna de rotação RNA da posição 3.</li>
		<li>Remova os tubos de colheita de 1,5 mL contendo 30 µ l eluída RNA na posição 3 e armazenar a −80 ° C.</li>
		<li>Remova os frascos de reagente.</li>
		<li>Descarte de conteúdo de adaptador do rotor através de canais adequados de resíduos perigosos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estação de trabalho limpo
	<ol>
<li>Spray de acessórios todos automatizado de DNA/RNA purificação do instrumento, tais como cremalheiras de reagente, bandeja e qualquer outra superfície em usam uma solução de descontaminação não enzimáticos, deixar por 10 min e enxague com deionizada (DI) e, em seguida, deixe-os secar.</li>
		<li>Pulverizador do instrumento automatizado com apenas fabricante aprovado solução de descontaminação não enzimáticos, limpe o interior do centrifugador juntamente com todas as superfícies em uso, deixe por 10 min e em seguida limpe com etanol a 70%. Não utilize outros tipos de soluções de descontaminação, pois eles podem danificar o instrumento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alvo 16S PCR set-up
Nota: A afinação para o PCR 16S é realizada em um espaço de trabalho pré-amplificação designado localizado dentro da sala limpa. Os reagentes e amostras são preparadas e então carregadas em um manipulador de líquido para realizar o PCR para cada amostra em triplicata (30 amostras, que incluem o verdadeiras amostras e controles positivo e negativo de extração, além de 2 controles de água PCR em triplicado, para um total de 96 combinado de amostras e controles). Uma vez que as reações de PCR são montadas e seladas, a placa da amostra é transferida para um termociclador, localizado em uma área de post-amplificação para o ciclismo.
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpe a estação de trabalho do PCR. Spray de que todas as superfícies em uso com um DNA de RNase, DNase, descontaminante, seguido por DI água duas vezes, e, finalmente, 70% de etanol.</li>
		<li>Preparar a planilha de PCR 16S (consulte a planilha de PCR alvejados 16S) com uma lista de exemplos precisos e atribuir primers de código de barras diferente para cada amostra9. Imprima a planilha e os mapas de placa (ver placa 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do mestre mistura PCR Nota: 16S cartilha seleção baseia-se na região de interesse para o estudo particular e pode mudar pelo tipo de estudo ou amostra. Portanto, antes de requisitar as primeiras demão, é importante confirmar qual é a área do melhor de rRNA 16S amplifica os micróbios de interesse para o estudo particular. Este protocolo, como está escrito é para a amplificação da região 16S V4. Se diferentes cartilhas/região é selecionado, em seguida, a temperatura do recozimento na ciclagem térmica pode requerer ajustes.<ol>
<li>Trabalho na estação de trabalho da PCR para preparar tudo.</li>
		<li>Tirar 50-100 µ l de amostras de DNA de-20 ° C e todos os reagentes necessários e descongelá-los no gelo. Vórtice e brevemente spin para baixo.</li>
		<li>Os primers são pré-diluídos na concentração de trabalho de 5 µM em um volume mínimo de 20 µ l.</li>
		<li>Prepare a mistura de mestre de PCR no tubo 5ml específico com somente o primer para frente de acordo com o cálculo da planilha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando o manipulador robótico líquido para instalação automatizada de PCR
	<ol>
<li>Para amostras, retire o adaptador de amostra de um 32-poço do instrumento e carregar 50-100 µ l de amostras de DNA de acordo com o mapa de placa de 96 poços, de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Para cada placa PCR, configure 2 controles negativos, colocando 30 µ l de água do PCR em um tubo de amostra limpa.</li>
			<li>Coloque todas as amostras no adaptador de amostra do instrumento 32-poço com tampas bloqueadas na posição aberta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para primeiras demão reverso9<ol>
<li>Retire a tampa de cada primer reverso com código de barras específico # s um de cada vez (luvas de mudança entre elas para evitar contaminação cruzada).</li>
			<li>Coloque um máximo de 32 primers no adaptador do reagente do instrumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pegue um prato PCR de 96 poços e rotulá-la com o nome de estudo, número da amostra, data e as iniciais do técnico.</li>
		<li>Carregar o manipulador robótico líquido<ol>
<li>Coloque o adaptador de reagente na posição B1. Para evitar um efeito de borda, coloque cuidadosamente uma extremidade do adaptador contra o lado de aperto e lentamente derrubar a outra borda. Certifique-se de empurrar em todos os cantos dos adaptadores de rede.</li>
			<li>Coloque o adaptador de amostra na posição C1. Certifique-se de empurrar em todos os cantos dos adaptadores de rede.</li>
			<li>Vórtice mestre 5 mL mistura, abra a tampa e coloque-o na posição A, em bloco de mistura e reagente mestre do instrumento.</li>
			<li>Coloque a placa PCR no adaptador de 96 poços do instrumento que se destina a segurar placas PCR metade contornadas.</li>
			<li>Começar a correr e salvar como um arquivo novo.</li>
			<li>Siga as instruções e seleção marcar cada aviso: uma, dicas estão disponíveis, dois, caixa de resíduos está disponível, e três, começar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após a execução estiver concluída, verifique se foram sem erros, verificando a máquina para mensagens de erro.</li>
		<li>A placa com o 12 ou 8 tira bonés, vórtice do selo vigorosamente, spin para baixo por 1 min, usando um girador de placa de 96 poços e colocá-lo no gelo ou na geladeira.</li>
		<li>Remova os tubos contendo primers reversos e amostras.</li>
		<li>Levar a placa de 96 poços para a sala de pós-amplificação e carregar a placa sobre o termociclador e ciclo de acordo com a tabela de condições térmicas-ciclismo (ver tabela 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. controle da qualidade alvo 16S Post-PCR usando a plataforma baseada em fita para a electroforese do Gel
Nota: Post-PCR controle de qualidade (QC) e todas as etapas subsequentes são realizadas em uma área designada de post-amplificação do laboratório. O DNA é analisado em um analisador automatizado de fragmento de DNA/RNA.
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpe a estação de trabalho por pulverização de que todas as superfícies em uso com DNase, RNase, DNA descontaminante, seguido por DI água duas vezes, e, finalmente, 70% de etanol.</li>
		<li>Reunir todos os suprimentos e equipamentos necessários.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar os reagentes
	<ol>
<li>Coloque o amortecedor da amostra e escada na temperatura controlada reaccional a 25 ° C, por um período mínimo de 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enquanto os reagentes estão a aquecer, preparar amostras PCR por pool de 3 repetições PCR para cada amostra em um tubo único</li>
	<li>Carregar amostras no instrumento.</li>
	<li>Brevemente o vórtice e spin-down tubos com produto PCR em pool.</li>
	<li>Coloque a placa de 96 poços do instrumento em um rack no RT e rotulá-la.</li>
	<li>Brevemente vórtice e girar para baixo o amortecedor da amostra e a escada.</li>
	<li>Adicione o amortecedor da amostra 3 µ l de cada poço da placa de 96 bem (necessidade de pelo menos 53 fita de tela / µ l).</li>
	<li>Executar um número de amostras; Se houver um número ímpar de amostras, adicione 4 µ l de tampão de amostra para um poço vazio.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de escada para uma escada bem.</li>
	<li>Seguindo o mapa, adicionar 1 µ l de produto PCR em pool para seu bem.</li>
	<li>Placa de cobertura com selo de alumínio</li>
	<li>Vórtice a placa usando reaccional e adaptador do instrumento a 2.000 rpm durante 1 min.</li>
	<li>Gire para baixo posição da amostra no fundo do tubo, se houver bolhas girar para baixo novamente.</li>
	<li>Inicie o software.</li>
	<li>Carrega as dicas de gravação e carregamento de tela dentro do instrumento.</li>
	<li>Carregar amostras para o analisador de fragmento com um adaptador de 96 poços.</li>
	<li>Configure uma corrida com o software de controlador.</li>
	<li>Certifique-se de selecionar poços nem numerados.</li>
	<li>Escreva IDs de amostra.</li>
	<li>Verifique que todos os poços da fita tela são destacados em cinza.</li>
	<li>Certifique-se que o analisador reconhece todas as pontas de pipeta.</li>
	<li>Selecione Iniciar e especificar um nome de arquivo para salvar os resultados (estudar o nome, números de amostra e data).</li>
	<li>Consulte as instruções do fabricante para obter mais detalhes.</li>
	<li>Após a execução completa, descarte a ponta, fita de tela e tubos.</li>
	<li>Analise dados para 16S pico nM (entre 315-450 bp para V4). Este pico irá variar dependendo os primers selecionados.</li>
</ol>5. Biblioteca cálculo, agrupamento, limpar e QC
<ol><li>Depois de determinar o tamanho do amplicon e molaridade de todas as amostras, as bibliotecas para atingir o volume final desejado e nM para a biblioteca em pool da piscina (ver exemplo de cálculo).</li>
	<li>Limpar e concentrado a biblioteca em pool usando uma purificação baseados em membrana de silicone kit para produtos PCR, de acordo com do fabricante protocolo (consulte Tabela de materiais).<ol>
<li>Eluir o DNA com um volume final de 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a concentração da biblioteca limpa imediatamente usando um kit de alta sensibilidade de DNA encalhado dobro para um dados, de acordo com o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Dilua 2 µ l da biblioteca em pool e limpa com 198 µ l de tampão de diluição mais tintura (diluição 1: 100).</li>
		<li>Registrar o valor medido do dispositivo fluorométrica e convertê-lo de acordo com o fator de diluição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando a concentração (ng / µ l) de leitura para a biblioteca em pool, calcule a molaridade de biblioteca em nM. Use a biblioteca não diluído de 1 µ l para medir o OD260/280 em um espectrofotômetro microvolume. Nota: Um valor de 1.8-2.0 indica pureza adequada da biblioteca.</li>
	<li>Armazene a biblioteca final a-20 ° C até que esteja pronto para sequenciamento de próxima geração.</li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Sequenciamento de próxima geração alvo de 16S rRNA é uma técnica amplamente utilizada, rápida para microbiome caracterização18. No entanto, muitos fatores, incluindo efeitos de lote, contaminação ambiental, contaminação cruzada amostra, sensibilidade e reprodutibilidade podem adversamente afetar resultados experimentais e confundir sua interpretação7,19 , 20. para melhor facilitar análises ...

As comunidades microbianas que colonizam os seres humanos são acreditadas para ser criticamente importante para a saúde humana e doença influenciam o metabolismo, desenvolvimento imune, susceptibilidade a doenças e respostas a vacinação e drogas terapia1, 2. esforços para entender a influência da microbiota na saúde humana atualmente enfatizam a identificação de micróbios associados com compartimentos anatômicos definidos (i.e., pele, intestino, oral, etc.), bem como sites localizados dentro Estes compartimentos3,4. Subjacente a esses esforços de investigação é o rápido aparecimento e maior acessibilidade das tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) que fornecem uma plataforma maciçamente paralelo para análise do conteúdo genético microbiano (microbiome) de uma amostra. Para muitas amostras fisiológicas, o associado microbiome é complexa e abundante (i.e., fezes), mas, para algumas amostras, a microbiome é representada por baixo carbono da biomassa microbiano (ou seja, leite humano, trato respiratório inferior) onde sensibilidade, artefatos experimentais e possível contaminação tornam-se grandes questões. Os desafios comuns de microbiome estudos e delineamento experimental adequado tem sido objecto de múltiplas revisão artigos5,6,7,8.
Aqui apresentados um robusto pipeline experimental de NGS baseia-alvo sequenciamento do rRNA 16S V4 região9 para caracterizar a microbiome do leite humano. Microbiome análise do leite humano é complicado, não só por uma biomassa microbiana inerentemente baixa10, mas adicionalmente por alto níveis de DNA humano fundo11,12,13,14 e potencial Reportes de PCR inibidores15,16 em extraído do ácido nucleico. Este protocolo baseia-se nas plataformas semi automatizadas que podem ajudar a minimizar a variabilidade entre lotes de preparação de amostra e kits de extração comercialmente disponível. Incorpora uma comunidade simulada bacteriana bem definida é processado juntamente com amostras como um controle de qualidade para validar cada passo no protocolo e fornecem uma métrica independente da robustez do gasoduto. Embora o protocolo como descrito é específico para as amostras de leite humano, é facilmente adaptável para outros tipos de amostras, incluindo fezes, retal, vaginal, pele, cotonetes areolar e oral10,17e pode servir como ponto de partida para pesquisadores que desejem realizar análises microbiome.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA extraction kit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature-controlled vortexer</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&amp;szlig;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>bead tube</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automated sample disruptor adapter set</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB tube</td><td></td><td></td><td>manufacturer&#039;s microcentrifuge tube in kit</td></tr><tr><td>QIAcube and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automated DNA/RNA purification instrument</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>non-enzymatic decontamination solution</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>elution buffer</td></tr><tr><td>QIAgility and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>robotic liquid handler</td></tr><tr><td>PCR water</td><td>MO BIO</td><td>17000-</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcoded reverse primers</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 and related plasticware</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td></tr><tr><td>D1000 reagents for Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Estudos de comunidades microbianas tornaram-se generalizados com o desenvolvimento do sequenciamento de relativamente barata, rápida e alta taxa de transferência. No entanto, como com todas estas tecnologias, resultados reprodutíveis dependem de um fluxo de trabalho de laboratório que incorpora controles e as devidas precauções. Isto é particularmente importante com amostras de baixa biomassa onde a contaminação bacteriana DNA pode gerar resultados enganosos. Este artigo detalha um fluxo de trabalho semi-automático para identificar micróbios de amostras de leite materno usando alvo sequenciamento da região 16S RNA ribossomal (rRNA) V4 em escala para baixo e médio throughput. O protocolo descreve a preparação da amostra de leite integral incluindo: Lise, extração de ácidos nucleicos, amplificação da região V4 do gene de rRNA 16S e preparação de biblioteca com as medidas de controlo de qualidade da amostra. Importante, o protocolo e discussão consideram questões que são importantes para a preparação e análise de amostras de baixa-biomassa, incluindo controlos adequados em positivos e negativos, remoção de inibidor PCR, contaminação da amostra por ambiental, reagente, ou fontes experimentais e práticas recomendadas experimentais concebidas para garantir a reprodutibilidade. Enquanto o protocolo como descrito é específico para as amostras de leite humano, é adaptável a vários tipos de amostra de baixa e alta-biomassa, incluindo amostras coletadas em cotonetes, congelados puro, ou estabilizado em um buffer de preservação.

O protocolo aqui apresentado inclui importante controle de qualidade (QC) passos para garantir que a reunião de dados gerados referenciais para o controle de sensibilidade, especificidade e contaminação de protocolo. Primeiro passo QC do protocolo segue a amplificação por PCR da região 16S do V4 (Figura 2). Um µ l de produto PCR de cada amostra foi analisada por eletroforese para confirmar que era dentro do intervalo de tamanho esperado da bp 315-450 (...

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A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Um fluxo de trabalho semi-automático é apresentado para sequenciamento alvo de 16S rRNA de leite humano e outros tipos de amostras de biomassa de baixo.

Um método para o sequenciamento de alvo 16S das amostras de leite humano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K visualizações.  University of California at Los Angeles. Um fluxo de trabalho semi-automático é apresentado para sequenciamento alvo de 16S rRNA de leite humano e outros tipos de amostras de biomassa de baixo.

Vídeo: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Ambiente

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Imunologia e Infecção

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biologia

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Um método para avaliar os efeitos da bacteriocina na microbiota intestinal de ratos

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Specimen Collection and Analysis of the Duodenal Microbiome

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut microbiome has been typically studied through fecal specimen collections. The ease of obtaining fecal samples has resulted in many studies that have revealed information concerning the distal luminal gastrointestinal tract. However, few studies have addressed the importance of the microbiome in the proximal gut. Given that the duodenum is a major site for digestion and absorption, its microbiome is relevant to nutrition and liver disease and warrants further investigation. Here we detail a novel method for sampling the proximal luminal and mucosal gut microbiome in human subjects undergoing upper endoscopy by obtaining duodenal aspirate and biopsies. Specimen procurement is facile and unaffected by artifacts such as patient preparatory adherence, as might be the case in obtaining colonic samples during colonoscopy. The preliminary results show that the luminal and mucosal microbiomes differ significantly, which is likely related to environmental conditions and barrier functions. Therefore, a combination of duodenal aspirate and biopsies reveal a more comprehensive picture of the microbiome in the duodenum. Biopsies are obtained from the descending and horizontal segments of the duodenum, which are anatomically close to the liver and biliary tree. This is important in studying the role of bile acid biology and the gut-liver axis in liver disease. Biopsies and aspirate can be used for 16S ribosomal RNA sequencing, metabolomics, and other similar applications.

In this manuscript, we discuss a novel method to sample and analyze the duodenal microbiome. This method provides an accurate depiction of microbial diversity and composition in the duodenum and could be useful for further investigation of the duodenal microbiome.

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut ...