Vorremmo ringraziare Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, dottorato di ricerca per lo sviluppo del protocollo. Supporto globale per l'International materno pediatrica adolescenziale AIDS clinico prove gruppo (IMPAACT) è stato fornito dal National Institute of Allergy e Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) sotto numeri del premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), con il co-finanziamento il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) e l'Istituto nazionale di salute mentale (NIMH). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

Per tutti i passaggi di protocollo, dispositivi di protezione personale (PPE) devono essere indossati e approcci di prevenzione contaminazione rigorosi devono essere prese. Osservare il flusso di lavoro da pre-amplificazione aree di aree di lavoro di post-amplificazione per minimizzare la contaminazione dei campioni di lavoro. Tutte le forniture utilizzate sono sterili, libero della RNasi, DNasi, DNA e pirogeni. Tutti i puntali vengono filtrati. Un diagramma di flusso dei passaggi del protocollo è fornito (Figura 1).
1. lisi del campione
Nota: Lisi del campione ed estrazione di acidi nucleici vengono eseguite utilizzando un kit di estrazione di DNA/RNA in un ambiente pulito dove sia procedurali che ingegneria dei controlli sono in atto per ridurre al minimo l'introduzione di batteri ambientali ai campioni.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire l'armadio di sicurezza biologica (BSC) lavora zona con detergente appropriato superficie per eliminare eventuali contaminazioni di acido nucleico.</li>
		<li>Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostarlo a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il tampone di lisi tiocianato di guanidinium (Vedi tabella materiali)
	<ol>
<li>Controllare il buffer di lisi per precipitati. Ri-sciogliere precipitati dal riscaldamento a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare 600 µ l di tampone di lisi con 6 µ l β-mercaptoetanolo (β-ME) per ogni campione. Si consideri un volume di 20% supplementare per campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione
	<ol>
<li>Se il latte intero è congelato, scongelare su ghiaccio. Aliquotare 5ml di intero latte in un 15 mL o in una provetta sterile 5 mL in BSC e tenerlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Girare il latte 5 mL aliquota per 10 min a 5.000 x g a 4 ° C per agglomerare le cellule.</li>
		<li>Rimuovere lo strato di grasso, ora lo strato superiore del tubo, con una spatola di plastica o grande foro punta della pipetta.</li>
		<li>Senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il supernatante ad eccezione di 100 µ l.</li>
		<li>Lavare la pallina di risospensione in 1 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).</li>
		<li>Preparare 1 controllo negativo aggiungendo 1 mL di PBS sterile in una provetta 5 mL.</li>
		<li>Trasferire la sospensione in una provetta pulita 1,5 mL centrifuga e spin in una microcentrifuga per 1 min (a temperatura ambiente (TA) fino a 5.000 x g).</li>
		<li>Per scartare l'intero livello di surnatante/grassi, usare una punta di pipetta sterile filtrata 1.000 µ l.</li>
		<li>Se non estraendo lo stesso giorno, snap congela la cella a pellet inserendolo in un etanolo/a secco ghiaccio semiliquido e trasferire immediatamente al congelatore-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rottura del campione e l'omogeneizzazione (tallone-battente)
	<ol>
<li>Aggiungere 600 µ l di tampone di lisi contenente β-ME al pellet e trasferire la sospensione in una provetta di tallone.</li>
		<li>Ogni lotto di estrazione di 12 contiene 10 campioni, 1 controllo negativo (preparata al punto 3.7 sopra) e 1 controllo positivo (preparato nel passaggio successivo).<ol>
<li>Preparare 1 controllo positivo con buffer di lisi e 20 µ l del campione finto batterico (la comunità finta utilizzata ha una concentrazione, una volta estratta, di circa 0,2 ng / µ l di DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortice tutti perlina tubi energicamente per 15 s.</li>
		<li>Riscaldare i campioni sul Vortex termostatato a 37 ° C per 10 min, con agitazione a 700-800 giri/min.</li>
		<li>Caricare il set di adattatori di apparecchiature automatiche disruptor tubi.</li>
		<li>Tallone battere per 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Smontare il set di adattatori e passare manualmente la scheda impostata con le piastre di campione dal braccio robotico di sinistra del braccio robotico destra dello strumento.</li>
		<li>Tallone battere per un altro 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Provette per centrifuga a 17.200 x g, per 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Rimuovere tutti il surnatante con una pipetta 200 µ l, facendo attenzione a non ottenere qualsiasi dello strato di grasso nella parte superiore del campione o il tallone residua nella parte inferiore del campione e si applicano a una colonna di omogeneizzatore.</li>
		<li>Colonne di omogeneizzatore centrifuga alla massima velocità, 17.200 x g per 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Trasferire 350 µ l di eluato microcentrifuga di un produttore di 2 mL per uso con lo strumento automatizzato per la purificazione di DNA e RNA (non usare qualsiasi altro tubo). Fare attenzione a non trasferire qualsiasi strato residuo di grasso.</li>
		<li>Se il volume di flusso continuo è a meno di 350 µ l, aggiungere tampone di lisi con β-ME ad un volume finale di 350 µ l.</li>
		<li>I campioni di lasciare RT per fino a 2 h prima di procedere all'isolamento dell'acido nucleico utilizzando lo strumento di purificazione automatizzato del DNA, o congelare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Area di lavoro di pulizia
	<ol>
<li>Pulire tutte le superfici in utilizzano con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min, poi spruzzare con etanolo al 70% e pulire la superficie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolare il DNA/RNA
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Attivare il blocco di calore e regolare la temperatura di 70 ° C.</li>
		<li>Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostare la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Scaldare il buffer di eluizione (EB) contenente 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, in un tubo da 50 mL a 70 ° C.</li>
		<li>Scaldare 350 µ l di campione congelato lisati in provette da 2 mL a 37 ° C fino a quando completamente scongelato senza alcun precipitato (circa 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione del DNA
	<ol>
<li>Vortex e centrifugare le provette 2 mL con campione brevemente (3000 x g per 10 s).</li>
		<li>Inserire 2 mL provette nello shaker seguendo il grafico del carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA, secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Ottenere i rotore adattatori e impostarle sul vassoio in base al numero di campioni.</li>
		<li>Etichettare ogni adattatore rotore basata sull'identificazione del campione (ID).</li>
		<li>Tagliare i coperchi e lisciare i bordi delle colonne singole spin per DNA e RNA.</li>
		<li>Inserire la colonna di spin di DNA senza il tubo di raccolta nell'adattatore del rotore. Gettare la provetta di raccolta.</li>
		<li>Etichetta 1,5 mL provette per la raccolta e inserire gli adattatori del rotore.</li>
		<li>Set adattatori per rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.</li>
		<li>Inserire 1.000 µ l-puntali del produttore con filtro in rack di punta.</li>
		<li>Aggiungere acqua RNAsi-libera al tubo del microcentrifuge del costruttore 2 mL dipenda dal numero di campioni (per istruzioni di macchina specifico protocollo).</li>
		<li>Inserire il tubo nella fessura del tubo "A" di slot di tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Scartare qualsiasi reagente che è rimasto in flaconi di reagente e riempire con un volume minimo di 10 mL.</li>
		<li>Il portabottiglie di reagente (tranne bottiglia EB), inserire i flaconi dei reagenti.</li>
		<li>Aggiungere EB caldo da un tubo da 50 mL per la posizione di bottiglia del Reagente 6.</li>
		<li>Verifica provette da 1,5 mL sono collocate strettamente negli adattatori del rotore.</li>
		<li>Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "estrazione kit" → "Animale, tessuti e cellule" → "del kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" → modificare Volume di eluizione per 100 µ l (impostazione predefinita) o 50 µ l per biomassa basso campioni → "Start".</li>
		<li>Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.</li>
		<li>Scartare la colonna di spin di DNA dalla posizione del rotore adattatore 3.</li>
		<li>Non gettare gli adattatori del rotore, il RNA è in posizione 2.</li>
		<li>Rimuovere i tubi di raccolta 1,5 mL contenente DNA eluito nella posizione 3 e memorizzare in − 20 ° C.</li>
		<li>Raccogliere campione contenente tubi da shaker e negozio a − 20 ° C, se qualsiasi campione è lasciato sopra, altrimenti scartare.</li>
		<li>Continuare con il protocollo "del kit nome 350 µ l parte B RNA" per ulteriore purificazione del RNA.</li>
		<li>Purificazione RNA sarà fatto dai circa 350 µ l flusso continuo che è in posizione centrale di adattatori del rotore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione di RNA
	<ol>
<li>Inserire la colonna di spin di RNA privo di coperchio e tubo di raccolta nell'adattatore del rotore.</li>
		<li>Etichetta del nuovo 1,5 mL provette per la raccolta e inserirli nell'adattatore del rotore, come indicato nel manuale.</li>
		<li>Impostare gli adattatori del rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.</li>
		<li>Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "Kit del produttore" → "Animale, tessuti e cellule" → "Standard parte B RNA" → "Start".</li>
		<li>Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.</li>
		<li>Scartare la colonna spin RNA dalla posizione 3.</li>
		<li>Provette da 1,5 mL contenente 30 µ l eluiti RNA alla posizione 3 di rimuovere e conservare a − 80 ° C.</li>
		<li>Rimuovere i flaconi dei reagenti.</li>
		<li>Smaltire i contenuti di adattatore di rotore attraverso i canali appropriati rifiuti pericolosi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Postazione di lavoro pulita
	<ol>
<li>Spray accessori tutti automatizzato del DNA/RNA purificazione dello strumento, quali cremagliere del reagente, vassoio e qualsiasi altra superficie in uso con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min e risciacquare con acqua deionizzata (DI), poi lasciarli asciugare.</li>
		<li>Spruzzo strumento automatizzato con solo produttore approvato soluzione di decontaminazione non enzimatici, pulire l'interno della centrifuga insieme a tutte le superfici in uso, lasciare per 10 min e poi pulire con etanolo al 70%. Non utilizzare altri tipi di soluzioni di decontaminazione, poichè possono danneggiare lo strumento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mirati 16S PCR set-up
Nota: Il set-up per la PCR 16S avviene in un'area di lavoro pre-amplificazione designato che si trova all'interno della camera bianca. I reagenti ed i campioni sono preparati e quindi caricati su un gestore liquido per eseguire la PCR per ciascun campione in triplice copia (30 campioni, sono veri campioni e controlli positivi e negativi di estrazione, più 2 PCR acqua controlli in triplice copia, per un totale di 96 combinato di campioni e controlli). Una volta che le reazioni di PCR sono assemblate e sigillate, piatto del campione viene trasferito un termociclatore situato in una zona di post-amplificazione per il ciclismo.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire la workstation PCR. Spruzzo che tutte le superfici in uso con un DNA di RNasi, DNasi, decontaminante, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.</li>
		<li>Preparare il foglio di lavoro di PCR 16S (vedere il foglio di lavoro di Targeted 16S PCR) con un elenco di esempi precisi e primer con codici a barre diversi assegna a ciascun campione9. Stampare il foglio di lavoro e le mappe di piastra (Vedi Tavola 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della master mix PCR Nota: selezione dell'iniettore 16S si basa sulla regione di interesse per lo studio particolare e può cambiare dal tipo studio o campione. Pertanto, prima di ordinare il primer, è importante confermare quale area del rRNA 16S migliori amplifica i microbi di interesse per lo studio particolare. Questo protocollo come scritto è per l'amplificazione della regione 16S V4. Se vengono selezionata diversa primer/regione, quindi la temperatura di annealing nel ciclismo termica potrebbe richiedere la modifica.<ol>
<li>Lavorare nella workstation PCR per preparare tutto.</li>
		<li>Prendere 50-100 µ l di campioni di DNA da-20 ° C e tutti i reagenti necessari e li scongelare su ghiaccio. Vortice e brevemente rotazione verso il basso.</li>
		<li>I primers sono pre-diluiti alla concentrazione di lavoro di 5 µM in un volume minimo di 20 µ l.</li>
		<li>Preparare il mix master di PCR nel tubo 5ml specifici con solo il primer in avanti secondo il calcolo del foglio di lavoro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando il manipolatore robotizzato liquido per l'installazione automatica di PCR
	<ol>
<li>Per i campioni, prendere fuori adattatore campione di uno strumento di 32-pozzo e caricare 50-100 µ l di campioni di DNA secondo la mappa di piastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Per ogni piatto PCR, impostare 2 controlli negativi inserendo 30 µ l di acqua PCR in una provetta pulita.</li>
			<li>Posto tutti i campioni su adattatore campione dello strumento 32-pozzo con tappi bloccati in posizione aperta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per iniettori d'inversione9<ol>
<li>Rimuovere il tappo di ogni primer reverse con codice a barre specifico # s uno alla volta (cambiare i guanti in mezzo per evitare la contaminazione incrociata).</li>
			<li>Inserire un massimo di 32 primer sull'adattatore Reagente dello strumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prendete una piastra PCR a 96 pozzetti ed etichettarlo con Studio nome, numero di campioni, data e le iniziali del tecnico.</li>
		<li>Il gestore di liquido robotico di caricamento<ol>
<li>Posizionare l'adattatore reagente B1. Al fine di evitare un effetto contorno, posizionare un bordo dell'adattatore contro il lato di presa e portare lentamente l'altro bordo. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.</li>
			<li>Inserire l'adattatore di campione in posizione C1. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.</li>
			<li>Vortice il mix master 5 mL, aprire il tappo e inserirlo nella posizione al blocco dello strumento matrice mix e reagente.</li>
			<li>Posizionare la piastra PCR su adattatore 96 pozzetti dello strumento che è destinato a contenere metà costeggiava piastre PCR.</li>
			<li>Avviare l'esecuzione e salvare come nuovo file.</li>
			<li>Seguire le istruzioni e spunta ogni prompt: uno, i consigli sono disponibili, due, scatola degli scarti è disponibile, e tre, iniziare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo che viene completata l'esecuzione, verificare che non siano presenti errori controllando la macchina per i messaggi di errore.</li>
		<li>Sigillare la piastra con i 12 o strip 8 tappi, vortice vigorosamente e spin giù per 1 min utilizzando un filatore piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul ghiaccio o in frigorifero.</li>
		<li>Rimuovere le provette contenenti i campioni e iniettori d'inversione.</li>
		<li>Prendere la piastra a 96 pozzetti per la camera di post-amplificazione e caricare la piastra sul termociclatore e ciclo in base alla tabella delle condizioni termiche-ciclismo (Vedi tabella 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. controllo di qualità Post-PCR 16S mirate utilizzando la piattaforma basata su nastro per elettroforesi del Gel
Nota: Post-PCR (controllo qualità) e tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una determinata area di post-amplificazione del laboratorio. Il DNA viene analizzato in un analizzatore automatico del frammento del DNA/RNA.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire la workstation spruzzando che decontaminante tutte le superfici in uso con RNAsi, DNasi, DNA, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.</li>
		<li>Raccogliere tutte le forniture e le attrezzature necessarie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare i reagenti
	<ol>
<li>Tampone del campione posto e scaletta nel Vortex a temperatura controllata a 25 ° C per un minimo di 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mentre i reagenti si scaldano, preparazione di campioni PCR mettendo in comune i 3 repliche PCR per ogni campione in un singolo tubo</li>
	<li>Caricare i campioni sullo strumento.</li>
	<li>Brevemente vortex e centrifugare tubi con pool prodotto di PCR.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti dello strumento su una cremagliera a RT ed etichettarlo.</li>
	<li>Brevemente vortice e spin giù il buffer del campione e la scaletta.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di tampone di campione in ciascun pozzetto della piastra ben 96 (necessità almeno 53 µ l/schermo nastro).</li>
	<li>Eseguire un numero pari di campioni; Se c'è un numero dispari di campioni, è possibile aggiungere 4 µ l di sample buffer in un pozzetto vuoto.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di scaletta per una scaletta ben.</li>
	<li>Seguendo la mappa, aggiungere 1 µ l di prodotto PCR riunita al suo designato bene.</li>
	<li>Piastra di copertura con sigillo</li>
	<li>Vortice la piastra utilizzando lo strumento Vortex e adattatore a 2.000 giri/min per 1 min.</li>
	<li>Girare fino a posizione l'esempio nella parte inferiore del tubo, se ci sono bolle spin giù di nuovo.</li>
	<li>Avviare il software.</li>
	<li>Caricare la schermata di caricamento e nastro suggerimenti nello strumento.</li>
	<li>Caricare i campioni nell'analizzatore frammento con un adattatore di 96 pozzetti.</li>
	<li>Impostare una corsa con il software del controller.</li>
	<li>Assicurarsi di selezionare anche numerati pozzi.</li>
	<li>Scrivere ID campione.</li>
	<li>Verifica che tutti i pozzi del nastro schermo sono evidenziati in grigio.</li>
	<li>Assicurarsi che l'analizzatore riconosce tutte le punte di pipetta.</li>
	<li>Selezionare avvia e specificare un nome file per salvare i risultati (Studio nome, numero del campione e data).</li>
	<li>Riferimento alle istruzioni del produttore per maggiori dettagli.</li>
	<li>Dopo che viene completata l'esecuzione, scartare punta, nastro schermo e tubi.</li>
	<li>Analizzare i dati per nM picco 16S (tra 315-450 bp per V4). Questo picco variano a seconda i primers selezionati.</li>
</ol>5. Biblioteca calcolo, pool, Clean-up e QC
<ol><li>Dopo aver determinato la dimensione amplicone e molarità di tutti i campioni, le librerie per raggiungere il volume desiderato finale e nM per la libreria di pool della piscina (Vedi esempio di calcolo).</li>
	<li>Clean-up e concentrato la libreria pool utilizzando una purificazione basati su silice-membrana kit per i prodotti PCR, secondo il produttore di protocollo (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Eluire il DNA con un volume finale di 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione della biblioteca pulita immediatamente utilizzando un kit di alta sensibilità DNA incagliato doppio per un fluorimetro, secondo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Diluire 2 µ l della biblioteca in pool e pulita con 198 µ l di tampone di diluizione plus tintura (diluizione 1: 100).</li>
		<li>Registrare il valore misurato dal dispositivo fluorometrica e convertirlo secondo il fattore di diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando la concentrazione (ng / µ l) di lettura per la libreria di pool, calcolare la molarità di biblioteca in nM. Utilizzare 1 µ l non diluito libreria per misurare la OD260/280 su uno spettrofotometro di microvolume. Nota: Un valore di 1.8-2.0 indica purezza adeguata della biblioteca.</li>
	<li>Archiviare la libreria finale a-20 ° C fino al momento per il sequenziamento di nuova generazione.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system.">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System.">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental,+tongue,+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity.">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).</li><li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome.">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).</li><li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects:+Tools,+techniques,+and+challenges.">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+human+microbiome+research.">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research.">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52 (2017).</li><li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing:+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing.">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561 (2017).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome.">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li><li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study.">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li><li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk.">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li><li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8(+)+T+cells+in+human+breast+milk.">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li><li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women.">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li><li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mirato nuova generazione sequenziamento del 16S rRNA è una tecnica ampiamente usata, rapid per microbiome caratterizzazione18. Tuttavia, molti fattori, tra cui effetti di batch, contaminazione ambientale, cross-contaminazione del campione, sensibilità e riproducibilità negativamente possono influenzare i risultati sperimentali e confondere loro interpretazione7,19 , 20. per meglio facilitare 16S robust...

Le comunità microbiche che colonizzano gli esseri umani sono credute per essere estremamente importante per la salute umana e la malattia che influenzano il metabolismo, lo sviluppo immune, suscettibilità alla malattia e le risposte alla vaccinazione e farmaco terapia1, 2. gli sforzi per comprendere l'influenza del microbiota sulla salute umana attualmente sottolineano l'identificazione di microbi associati definite compartimenti anatomici (cioè, pelle, intestino, orale, ecc.), così come siti localizzati all'interno questi scomparti3,4. Alla base di questi sforzi investigativi è il rapido emergere e la maggiore accessibilità delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che forniscono una piattaforma massicciamente parallela per l'analisi del contenuto genetico microbico (microbiome) di un campione. Per molti campioni fisiologici, il microbioma associato è complessa e abbondante (cioè, sgabello), ma, per alcuni campioni, il microbioma è rappresentato dalla biomassa microbica bassa (cioè, latte umano, delle vie respiratorie inferiori) dove sensibilità, manufatti sperimentali e possibili contaminazioni diventano grossi problemi. Le sfide comuni del microbioma studi e appropriato disegno sperimentale sono stati oggetto di più recensione articoli5,6,7,8.
Presentato qui è una robusta pipeline NGS sperimentale basata su mirata sequenza del rRNA 16S V4 regione9 per caratterizzare il microbioma del latte umano. Microbioma analisi del latte umano sono complicato non solo da una biomassa microbica intrinsecamente bassa10, ma inoltre da alta livelli di DNA umano di base11,12,13,14 e riporto potenziale di PCR inibitori15,16 in estratti dell'acido nucleico. Questo protocollo si basa su piattaforme semi-automatizzate che consentono di ridurre la variabilità in batch di preparazione del campione e kit di estrazione disponibile in commercio. Esso incorpora una ben definita comunità batterica finta che viene elaborata insieme agli esempi come un controllo di qualità per convalidare ogni passaggio nel protocollo e fornire una metrica indipendente della robustezza della pipeline. Sebbene il protocollo come descritto è specifico per i campioni di latte umano, è facilmente adattabile ad altri tipi di campione tra cui sgabello, rettale, vaginale, pelle, tamponi areolare e orale10,17e può servire come punto di partenza per i ricercatori che desiderano eseguono analisi microbioma.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA extraction kit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature-controlled vortexer</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&amp;szlig;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>bead tube</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automated sample disruptor adapter set</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB tube</td><td></td><td></td><td>manufacturer&#039;s microcentrifuge tube in kit</td></tr><tr><td>QIAcube and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automated DNA/RNA purification instrument</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>non-enzymatic decontamination solution</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>elution buffer</td></tr><tr><td>QIAgility and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>robotic liquid handler</td></tr><tr><td>PCR water</td><td>MO BIO</td><td>17000-</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcoded reverse primers</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 and related plasticware</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td></tr><tr><td>D1000 reagents for Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Studi delle comunità microbiche sono diventati diffusi con lo sviluppo di sequenziamento relativamente poco costoso, rapido e di alta. Tuttavia, come con tutte queste tecnologie, risultati riproducibili dipendono da un flusso di lavoro di laboratorio che incorpora controlli e precauzioni appropriate. Ciò è particolarmente importante con i campioni di basso-biomassa dove la contaminazione di DNA batterico può generare risultati fuorvianti. Questo articolo descrive in dettaglio un semi-automatico del flusso di lavoro per identificare i microbi da campioni di latte materno umano mediante sequenziamento mirato della regione 16S RNA ribosomiale (rRNA) V4 su una scala di basso - medio throughput. Il protocollo descrive la preparazione del campione da latte intero compreso: campione Lisi, estrazione di acidi nucleici, amplificazione della regione V4 del gene del rRNA 16S e preparazione di libreria con misure di controllo di qualità. D'importanza, il protocollo e la discussione considerare questioni che sono salienti per la preparazione e l'analisi di campioni di basso-biomassa tra cui adeguati controlli positivi e negativi, rimozione di inibitore PCR, contaminazione del campione di ambientale, reagente, o fonti sperimentali e progettati per garantire la riproducibilità sperimentale procedure consigliate. Mentre il protocollo come descritto è specifico di campioni di latte umano, è adattabile a numerosi tipi di campioni di biomassa bassa e alta, compresi i campioni raccolti su tamponi, congelati pura, o stabilizzato in un buffer di conservazione.

Il protocollo presentato qui include passaggi importante controllo qualità (QC) per assicurarsi che il soddisfare di dati generati i valori di riferimento per il controllo di sensibilità, specificità e contaminazione di protocollo. Primo passo QC del protocollo segue l'amplificazione di PCR della regione 16S V4 (Figura 2). Un µ l del prodotto PCR di ogni campione è stato analizzato tramite l'elettroforesi per confermare che era all'interno della gamma di...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Views.  University of California at Los Angeles. Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Video: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, optimization of their biotechnological synthesis is limited by the relatively low throughput of detection and quantification of monosaccharide and linkages. Conventional techniques of glycan analysis include chromatographic/mass-spectrometric methods with throughput on the order of hundreds of samples per day without automation. We demonstrate here, a genetically encoded bacterial biosensor for the high-throughput, linkage-specific detection and quantification of the fucosylated HMO structures, 2&#8217;-fucosyllactose and 3-fucosyllactose, which we achieved via heterologous expression of fucosidases. As the presence of lactose in milk or in biotechnological processes could lead to false positives, we also demonstrate the reduction of signal from lactose using different strategies. Due to the high throughput of this technique, many reaction conditions or bioreactor parameters could be assayed in parallel in a matter of hours, allowing for the optimization of HMO manufacturing.

We describe here the high-throughput detection and quantification of fucosylated human milk oligosaccharides (HMOs) using a whole-cell biosensor. We also demonstrate here, the adaptation of this platform towards analysis of HMO production strains, focusing on improving the signal to noise ratio.

Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Ricerca

Biochimica

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Immunologia e infezioni

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Biologia

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Metodo per valutare gli effetti del batterioiocinio sul microbiota di gatti dei topi

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ripristino del microbiota del latte donato pastorizzato utilizzando il latte materno

Individualized Reconstitution of Human Milk Microbiota: A Feasible Approach in Real-World Settings

Mother&#39;s own milk (MOM) is the most complete nutritional resource for newborns. In cases where mothers are unable to produce sufficient milk or cannot breastfeed, the preferred alternative is pasteurized donor human milk (PDM), which is routinely provided by human milk banks. PDM offers a superior range of nutritional and immunological elements compared to any commercially available formula. However, to ensure biosafety, PDM undergoes pasteurization, a process that inactivates commensal microbiota and reduces certain bioactive compounds. This study presents a protocol designed to restore the microbiota of PDM using MOM as a microbial source, adapting the approach to a real-world clinical setting.
The protocol was implemented in a clinical trial conducted at a maternity hospital and its associated human milk bank, with the aim of providing personalized donor milk to preterm infants whose mothers cannot produce sufficient milk. The methodology involves inoculating PDM with 10% of MOM, followed by incubation at 37 &#176;C for 4 h. Microbiological analysis demonstrated successful bacterial growth in the inoculated milk (IM) post incubation, with the microbiota profile of the reconstituted milk (RM) closely resembling that of MOM, indicating effective microbiota restoration. These results suggest that the reconstitution protocol is feasible for implementation in neonatal care, with the potential to enhance the nutritional and immunological quality of PDM, thereby supporting the health and development of non-breastfed newborns.

<meta charset="utf8"></head><body>Ricostituzione individualizzata del microbiota del latte umano: un approccio fattibile in contesti del mondo reale

The article describes a protocol for reconstituting pasteurized donor milk microbiota using the mother's own milk microbiota in practical, real-world settings. It demonstrates effective bacterial growth and microbiome modulation, supporting the feasible application of this procedure within the routine care of a maternity hospital and its associated human milk bank.

Ricostituzione individualizzata del microbiota del latte umano: un approccio fattibile in contesti del mondo reale

Mother&#39;s own milk (MOM) is the most complete nutritional resource for newborns. In cases where mothers are unable to produce sufficient milk or cannot ...