Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).
1. Probe lyse
Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein DNA/RNA-Extraktion-Kit in einem Reinraum wo gibt es technische und verfahrenstechnische Kontrollen, die Einführung von Umweltbakterien zu den Proben zu minimieren.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Das Biosafety-Kabinett (BSC) Arbeitsbereich sauber mit entsprechenden Oberflächen Reiniger, Nukleinsäure-Verunreinigungen zu beseitigen.</li>
		<li>Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer, und setzen Sie ihn auf 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium-Thiocyanat-Lyse-Puffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien)
	<ol>
<li>Überprüfen Sie die Lyse-Puffer für Ausscheidungen. Wieder lösen sich Ausscheidungen durch die Erwärmung bei 37 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 600 µL Lyse Puffer mit 6 µL β-Mercaptoethanol (β-ME) für jede Probe. Betrachten Sie ein extra 20 % Volumen pro Probe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Probe
	<ol>
<li>Wenn Vollmilch eingefroren ist, lassen tauen Sie es auf Eis auf. Aliquoten 5 mL des ganzen Milch in einem 15 mL oder eine 5 mL steriles Röhrchen im BSC und halten sie auf dem Eis.</li>
		<li>Drehen Sie die 5 mL Milch aliquoten für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C, pellet-Zellen.</li>
		<li>Die Fettschicht zu entfernen, jetzt die oberste Schicht in der Röhre, mit einem Kunststoffspachtel oder große Bohrung Pipettenspitze.</li>
		<li>Ohne zu stören das Pellet, entfernen des Überstands mit Ausnahme von 100 µL.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets von resuspending in 1 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Bereiten Sie 1 negative Kontrolle durch Zugabe von 1 mL sterile PBS, eine 5-mL-Tube.</li>
		<li>Die Aussetzung auf eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und spin in einem Microcentrifuge für 1 min (5.000 x g bei Raumtemperatur (RT)).</li>
		<li>Verwenden Sie eine 1.000 µL steriler gefilterter Pipettenspitze um die gesamte Ebene überstand/Fettsäuren zu verwerfen.</li>
		<li>Wenn nicht extrahieren am selben Tag snap frieren die Zelle pellet-indem man es in einem Ethanol/trocken Eis Gülle und sofort auf die-80 ° C Gefrierschrank zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probe-Störung und Homogenisierung (Wulst-schlagen)
	<ol>
<li>Fügen Sie 600 µL Lyse Puffer mit β-ME zum Pellet und übertragen Sie die Aussetzung zu einem Wulst-Schlauch.</li>
		<li>Jede Charge der Extraktion von 12 enthält 10 Proben, 1 Negativkontrolle (vorbereitet in Schritt 3.7 oben) und 1 positiv-Kontrolle (im nächsten Schritt vorbereitet).<ol>
<li>Bereiten Sie 1 Positivkontrolle mit Lyse-Puffer und 20 µL der bakteriellen mock Probe (mock Gemeinschaft verwendet hat eine Konzentration, die einmal extrahiert, von ca. 0,2 ng/µL DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex alle bead Tubes energisch für 15 s.</li>
		<li>Erwärmen Sie Proben über temperaturgesteuerte Vortexer bei 37 ° C für 10 min, mit Schütteln bei 700-800 u/min.</li>
		<li>Laden Sie Rohre in das automatisierte Sample Disruptor Adapterset.</li>
		<li>Wulst schlagen für 1 min bei 30 Hz.</li>
		<li>Zerlegen Sie das Adapter-Set und manuell wechseln des Adapters set mit die Musterplatten aus der linken Roboterarm, der rechts Roboterarm des Instruments.</li>
		<li>Wulst schlagen für ein weiteres 1 min bei 30 Hz.</li>
		<li>Zentrifuge Röhren 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie alle der Überstand mit einer 200 µL Pipette, wobei Sie darauf achten, nicht um eine der fetthaltigen Schicht an der Spitze der Probe oder die Perle Rückstände an der Unterseite der Probe, und gelten für eine Spalte Homogenisator.</li>
		<li>Zentrifuge Homogenisator Spalten mit maximaler Geschwindigkeit, 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie 350 µL Eluat auf ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch für den Einsatz mit dem automatisierten Instrument zur Reinigung von DNA und RNA (verwenden Sie nicht anderen Röhre). Achten Sie darauf, dass Sie keine verbleibende Fettschicht zu übertragen.</li>
		<li>Bei der Durchströmung Größe von weniger als 350 µL fügen Sie Lyse Puffer mit β-ME zu einem Endvolumen von 350 µL hinzu.</li>
		<li>Lassen Sie die Proben an RT für bis zu 2 Stunden bevor Sie fortfahren Nukleinsäure-Isolierung mit dem automatisierten DNA-Reinigung-Instrument oder Einfrieren bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reinigung Arbeitsbereich
	<ol>
<li>Sauber alle Oberflächen in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 min, dann sprühen Sie mit 70 % Ethanol und wischen Sie die Oberfläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) isolieren Sie DNA/RNA
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Schalten Sie den Heizblock und stellen Sie die Temperatur auf 70 ° C.</li>
		<li>Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.</li>
		<li>Wärmen Sie die Elution Puffer (EB) mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in einem 50-mL-Röhrchen bis 70 ° C.</li>
		<li>Wärmen Sie 350 µL eingefrorene Samenprobe Lysates in 2 mL Röhrchen bei 37 ° C, bis Sie vollständig aufgetaut ohne jede Niederschlag (ca. 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA-Reinigung
	<ol>
<li>Wirbel und Zentrifuge der 2-mL-Röhrchen mit kurz Probe (3000 X g für 10 s).</li>
		<li>Legen Sie 2 mL Röhrchen in den Shaker nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gemäß den Herstellerangaben.</li>
		<li>Bekommen Sie die Rotor-Adapter und richten Sie diese auf dem Tablett, basierend auf der Anzahl der Proben.</li>
		<li>Beschriften Sie jeden Rotor Adapter anhand des Beispiels Identifikation (ID).</li>
		<li>Schneiden Sie den Deckel und glätten Sie die Kanten der einzelnen Spin Spalten für DNA und RNA.</li>
		<li>Fügen Sie die DNA Spin Spalte ohne das Sammelröhrchen in den Rotor-Adapter. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen.</li>
		<li>Label 1,5 mL Röhrchen und Rotor-Adapter stecken.</li>
		<li>Rotor-Adapter in die Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.</li>
		<li>Tipp-Racks stecken Sie des Herstellers 1.000 µL Filterspitzen.</li>
		<li>Ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch basierend auf der Anzahl der Proben (je spezifischen Maschinenanweisungen Protokoll) fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu.</li>
		<li>Stecken Sie das Rohr in Rohr-Steckplatz "A" Microcentrifuge Schlauch Slots.</li>
		<li>Entsorgen Sie Reagenz, das in Flaschen Reagenz und füllen mit einem Mindestvolumen von 10 mL übrig bleibt.</li>
		<li>Das Reagenz Flaschenregal (außer EB Flasche) stecken Sie Reagenz Flaschen.</li>
		<li>Die Position der Reagenz Flasche 6 warme EB aus der 50-mL-Tube hinzufügen.</li>
		<li>Check-1,5 mL-Tuben sind eng in die Rotor-Adapter platziert.</li>
		<li>Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Extraktion Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Kit Name 350 µL Teil A Custom DNA" → Elution Lautstärke 100 µL (Standard) oder 50 µL für niedrigen Biomasse Proben → bearbeiten "Start."</li>
		<li>Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf dem Tablett.</li>
		<li>Entsorgen Sie die DNA Spin Spalte von Rotorposition Adapter 3.</li>
		<li>Rotor-Adapter nicht wegwerfen, RNA ist in der Position 2.</li>
		<li>1,5 mL Röhrchen mit eluierten DNA an Position 3 zu entfernen und speichern in −20 ° C.</li>
		<li>Sammeln Sie Probe-haltige Rohre im Shaker und Store in −20 ° C, wenn jede Probe, sonst verwerfen übrig ist.</li>
		<li>Fahren Sie mit dem Protokoll "Kit Name 350 µL Teil B RNA" für die weitere Reinigung der RNA.</li>
		<li>RNA-Reinigung erfolgt von der rund 350 µL durchströmten, die in der mittleren Position des Rotors Adapter ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA-Reinigung
	<ol>
<li>Fügen Sie die RNA Spin Spalte ohne seine Sammelröhrchen und Deckel in den Rotor-Adapter.</li>
		<li>Beschriften Sie neue 1,5 mL Röhrchen und in Rotor-Adapter setzen Sie ein, wie im Handbuch angegeben.</li>
		<li>Die Rotor-Adapter in der Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.</li>
		<li>Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Des Herstellers Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Standard Teil B RNA" → "Start."</li>
		<li>Nach Fertigstellung, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge zu und legen Sie sie auf dem Tablett.</li>
		<li>RNA-Spin-Spalte von Position 3 zu verwerfen.</li>
		<li>1,5 mL Röhrchen mit 30 µL eluiert RNA an Position 3 zu entfernen und Lagern bei −80 ° C.</li>
		<li>Reagenz-Flaschen zu entfernen.</li>
		<li>Rotor-Adapter Inhalt durch entsprechende Sondermüll Kanäle entsorgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sauberen Arbeitsplatz
	<ol>
<li>Spray alle automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments Zubehör wie Reagenz Racks, Tablett und einer anderen Oberfläche in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 Minuten und Spülen mit entionisiertem Wasser (DI), dann trocknen lassen.</li>
		<li>Spray die automatisierten Instrument mit nur Hersteller genehmigt nicht-enzymatische Dekontaminationslösung, wischen Sie die Innenseite der Zentrifuge zusammen mit allen Oberflächen lassen für 10 min und wischen Sie dann mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie andere Arten von Dekontamination Lösungen nicht, da diese das Gerät beschädigen können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gezielte 16 s PCR Setup
Hinweis: Das Setup für die 16 s-PCR wird in einem dafür vorgesehenen Vorverstärkung Arbeitsbereich befindet sich innerhalb der Reinraum durchgeführt. Die Reagenzien und Proben sind vorbereitet und dann auf einen flüssigen Handler durchführen die PCR für jede Probe in dreifacher Ausfertigung (30 Proben, darunter wahre Proben und Extraktion positive und negative Kontrollen, plus 2 PCR Wasser steuert in dreifacher Ausführung, für eine Gesamtmenge von 96 verladen kombinierten Proben und Kontrollen). Sobald die PCR-Reaktionen montiert und abgedichtet sind, ist ein Thermocycler befindet sich in einer Post-Verstärkung-Gebiet zum Radfahren Probenteller übertragen.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die PCR-Workstation. Spray, die alle Oberflächen mit einer RNase, DNase, DNA Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.</li>
		<li>Vorbereiten der 16 s-PCR-Arbeitsblatt (siehe gezielte 16 s PCR Arbeitsblatt) eine genaue Liste und weisen unterschiedliche Barcodes Primer an jede Probe-9. Drucken Sie das Arbeitsblatt und die Platte Karten (siehe Plate 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-master-Mix-Vorbereitung Hinweis: 16 s Grundierung Auswahl basiert auf der Region von Interesse für die Studie und kann durch Studium oder Probe-Typ ändern. Daher vor der Bestellung Primer, ist es wichtig, welchem Bereich der 16 s rRNA beste verstärkt die Mikroben von Interesse für die Studie zu bestätigen. Dieses Protokoll wie geschrieben ist für die Verstärkung der 16 s V4 Region. Verschiedenes Grundierungen/Region ausgewählt sind, kann die Anlasstemperatur in die Temperaturzyklen Anpassung verlangen.<ol>
<li>Arbeiten Sie in der PCR-Arbeitsstation, um alles vorzubereiten.</li>
		<li>Nehmen Sie 50-100 µL DNA-Proben von-20 ° C und alle benötigten Reagenzien und tauen sie auf Eis. Wirbel und kurz spin-down.</li>
		<li>Die Primer werden vorab zur Arbeit Konzentration von 5 µM in ein Mindestvolumen von 20 µL verdünnt.</li>
		<li>Bereiten Sie die PCR-master-Mix in der spezifischen 5 mL Tube mit nur die forward Primer nach der Berechnung auf dem Arbeitsblatt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Roboter liquiden Handlers für automatisierte PCR setup
	<ol>
<li>Für Proben ein 32-gut Instrument Probe Adapter herausnehmen, und 50-100 µL DNA-Proben nach der 96-Well-Platte-Karte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu laden.<ol>
<li>Für jede PCR-Platte 2 Negativkontrollen indem man 30 µL des PCR-Wasser in einem sauberen Probenröhrchen eingerichtet.</li>
			<li>Legen Sie alle Proben auf das 32-gut Instrument Probe Adapter mit Kappen verschlossen in Offenstellung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für reverse Primer9<ol>
<li>Entfernen Sie die Kappe von jedem rückwärts-Primer mit bestimmten Barcode # es eins zu einem Zeitpunkt (Handschuhe wechseln dazwischen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden).</li>
			<li>Legen Sie maximal 32 Primer auf das Instrument Reagenz Adapter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nehmen Sie eine 96-Well-PCR-Platte und beschriften Sie sie mit Studiennamen, Probennummer, Datum und Initialen des Technikers.</li>
		<li>Laden den Roboter liquiden handler<ol>
<li>Setzen Sie den Reagenz-Adapter auf B1. Um einen Effekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und langsam die andere Kante herab. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.</li>
			<li>Setzen Sie die Probe-Adapter in Position C1. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.</li>
			<li>Wirbel der 5-mL-master-Mix, öffnen Sie die Kappe, und legen Sie sie in Position A auf das Instrument master Mix und Reagenz Block.</li>
			<li>Legen Sie die PCR-Platte auf der 96-Well-Instrument-Adapter, der halb skirted PCR-Platten halten soll.</li>
			<li>Den Durchlauf starten und als neue Datei speichern.</li>
			<li>Folgen Sie den Anweisungen und Häkchen jeder Eingabeaufforderung: einerseits Tipps gibt es, zwei, Abfallbehälter ist verfügbar, und drei, starten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach der abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, es gab keine Fehler durch die Überprüfung der Maschine für Fehlermeldungen.</li>
		<li>Dichtplatte mit den 12 oder 8 Streifen Kappen, Strudel kräftig, spin-down für 1 min mit einem 96-Well-Platte-Spinner und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank stellen.</li>
		<li>Röhrchen mit reverse Primer und Proben zu entfernen.</li>
		<li>Nehmen Sie die 96-Well-Platte um den Post-Verstärkung-Raum und laden Sie die Platte auf den Thermocycler und Zyklus entsprechend der Tabelle des thermischen Radfahren Bedingungen (siehe Tabelle 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gezielte 16 s Post-PCR-Qualitätskontrolle mit Band-basierte Plattform für Gelelektrophorese
Hinweis: Post-PCR-Qualitätskontrolle (QC) und alle weiteren Schritte werden in einem bestimmten Bereich der Post-Verstärkung des Labors durchgeführt. Die DNA wird in einen automatisierten DNA/RNA Fragment Analyzer analysiert.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die Arbeitsstation durch Spritzen, die alle Oberflächen mit RNase, DNase, DNA-Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.</li>
		<li>Sammeln Sie alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände benötigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Reagenzien
	<ol>
<li>Der temperaturgesteuerten Vortexer bei 25 ° C für mindestens 30 min entgegenbringen Sie Probenpuffer und Leiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während die Reagenzien Aufwärmen, bereiten Sie PCR Proben vor, durch die Bündelung der 3 PCR-Wiederholungen für jede Probe in ein einzelnes Rohr</li>
	<li>Proben am Instrument zu laden.</li>
	<li>Kurz Wirbel und Spin-down Rohre mit gepoolten PCR-Produkt.</li>
	<li>Platzieren Sie das Instrument 96-Well-Platte auf eine Zahnstange bei RT und beschriften Sie sie.</li>
	<li>Kurz nach unten Wirbel und Spin Probenpuffer und Leiter.</li>
	<li>Geben Sie 3 µL Probenpuffer in jedes der 96-well-Platte (Notwendigkeit mindestens 53 µL/Bildschirm Klebeband).</li>
	<li>Führen Sie eine gerade Anzahl von Proben; besteht eine ungerade Anzahl von Proben, geben Sie 4 µL Probenpuffer in eine leere.</li>
	<li>Hinzu kommt 1 µL Leiter Anlegeleiter gut.</li>
	<li>Nach der Karte hinzufügen 1 µL der gepoolten PCR-Produkt seiner ausgewiesenen gut.</li>
	<li>Abdeckplatte mit Folienversiegelung</li>
	<li>Wirbel der Platte mit des Instruments Vortexer und Adapter bei 2.000 u/min für 1 min.</li>
	<li>Drehen Sie wieder nach unten in Position, die die Probe an der Unterseite des Rohres, wenn es gibt Spin down sprudelt.</li>
	<li>Starten Sie die Software.</li>
	<li>Laden Sie Bildschirmtipps Band und laden in das Gerät.</li>
	<li>Proben in den Fragment-Analysator mit einem 96-Well-Adapter zu laden.</li>
	<li>Richten Sie ein mit der Controller-Software laufen.</li>
	<li>Achten Sie darauf, wählen geradzahligen Brunnen.</li>
	<li>Beispiel-IDs zu schreiben.</li>
	<li>Überprüfen Sie, dass die Brunnen des Bandes Bildschirm grau hervorgehoben werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Analyzer erkennt die Pipettenspitzen.</li>
	<li>Wählen Sie Start, und geben Sie einen Dateinamen, um die Ergebnisse zu speichern (Studie Probennummern, Name und Datum).</li>
	<li>Beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers für weitere Details.</li>
	<li>Nachdem das abgeschlossen ist, entsorgen Sie Tipp, Bildschirm Klebeband und Röhren.</li>
	<li>Analysieren von Daten für 16 s Peak nM (zwischen 315-450 bp für V4). Dieser Gipfel variieren je nach dem Primer ausgewählt.</li>
</ol>5. Bibliothek Berechnung, Pooling, Clean-Up, und QC
<ol><li>Nach der Bestimmung der Größe der Amplifikate und Molarity aller Proben, bündeln die Bibliotheken zur Erreichung der gewünschten Endvolumen und nM für die gepoolten Bibliothek (siehe Beispielrechnung).</li>
	<li>Clean-Up und Konzentrat die gepoolte Bibliothek mit einer Silica-Membran-basierten Läuterung kit für PCR-Produkte nach Angaben des Herstellers Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Eluieren Sie die DNA mit einem Endvolumen von 50 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie die Konzentration der gereinigten Bibliothek sofort mit den doppelten gestrandeten DNA-hohe Empfindlichkeit Kit für ein Fluorometer laut Protokoll des Herstellers.<ol>
<li>Verdünnen Sie 2 µL der gebündelt und gereinigte Bibliothek mit 198 µL des Verdünnungspuffer plus Farbstoff (1: 100 Verdünnung).</li>
		<li>Nehmen Sie den gemessenen Wert vom fluorometrisch Gerät und nach den Verdünnungsfaktor zu konvertieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit der Konzentration (ng/µL) für die gepoolten Bibliothek lesen, berechnen Sie die Bibliothek Molarity in nM. Verwenden Sie 1 µL unverdünnte Bibliothek der OD260/280 auf einem Microvolume Spektralphotometer messen. Hinweis: Der Wert von 1,8-2,0 gibt ausreichende Reinheit der Bibliothek.</li>
	<li>Speichern Sie die endgültige Bibliothek bei-20 ° C bis bereit für die nächste Generation-Sequenzierung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system.">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System.">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental,+tongue,+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity.">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).</li><li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome.">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).</li><li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects:+Tools,+techniques,+and+challenges.">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+human+microbiome+research.">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research.">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52 (2017).</li><li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing:+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing.">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561 (2017).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome.">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li><li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study.">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li><li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk.">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li><li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8(+)+T+cells+in+human+breast+milk.">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li><li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women.">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li><li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu er...

Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,4. Diese investigativen Bemühungen ist die rasche Entstehung und erhöhte Zugänglichkeit der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien, die eine massiv parallele Plattform zur Analyse der mikrobiellen genetischen Inhalte (Mikrobiom) einer Probe. Für viele physiologische Proben, die damit verbundenen Microbiome ist komplex und reichlich (d.h., Hocker), aber für einige Proben ist das Mikrobiom durch geringe mikrobielle Biomasse (d.h., Muttermilch und unteren Atemwege) vertreten, wo Empfindlichkeit, experimentellen Artefakte und mögliche Verunreinigungen werden wichtige Themen. Die gemeinsamen Herausforderungen der Microbiome Studien und geeignete Versuchsanordnung wurden mehrere Review Artikel5,6,7,8.
Enthaltenen basiert eine robuste NGS experimentelle Pipeline auf gezielte Sequenzierung der rRNA 16 s V4 Region9 Mikrobiom der Muttermilch zu charakterisieren. Microbiome Analyse der menschlichen Milch ist kompliziert, nicht nur durch eine von Natur aus geringe mikrobielle Biomasse-10, sondern zusätzlich durch hohe Niveaus der menschlichen DNA Hintergrund11,12,13,14 und mögliche Übertragung von PCR-Inhibitoren15,16 in extrahierten Nukleinsäuren. Dieses Protokoll setzt auf handelsübliche Extraktion Kits und semi-automatischen Plattformen, die helfen können Variabilität auf Probe Vorbereitung Chargen zu minimieren. Es enthält eine wohldefinierte mock Bakteriengemeinschaft, die neben Proben verarbeitet wird, als eine Qualitätskontrolle überprüfen jeden Schritt im Protokoll und bieten eine unabhängige Metrik der Pipeline Robustheit. Obwohl das Protokoll als beschrieben für die Muttermilch Proben handelt, es ist leicht anpassbar an andere Probentypen wie Hocker, rektale und vaginale, Haut, areolar und mündliche Tupfer10,17, und dient als Ausgangspunkt für Forscher, die Microbiome Analysen durchführen möchten.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA extraction kit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature-controlled vortexer</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&amp;szlig;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>bead tube</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automated sample disruptor adapter set</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB tube</td><td></td><td></td><td>manufacturer&#039;s microcentrifuge tube in kit</td></tr><tr><td>QIAcube and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automated DNA/RNA purification instrument</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>non-enzymatic decontamination solution</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>elution buffer</td></tr><tr><td>QIAgility and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>robotic liquid handler</td></tr><tr><td>PCR water</td><td>MO BIO</td><td>17000-</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcoded reverse primers</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 and related plasticware</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td></tr><tr><td>D1000 reagents for Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.

Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-45...

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A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Aufrufe.  University of California at Los Angeles. Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Serie: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Forschung

Umwelt

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Immunologie und Infektion

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biologie

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Eine Methode zur Beurteilung von Bakteriocin-Wirkungen auf die Gut-Mikrobiota von Mäusen

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Specimen Collection and Analysis of the Duodenal Microbiome

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut microbiome has been typically studied through fecal specimen collections. The ease of obtaining fecal samples has resulted in many studies that have revealed information concerning the distal luminal gastrointestinal tract. However, few studies have addressed the importance of the microbiome in the proximal gut. Given that the duodenum is a major site for digestion and absorption, its microbiome is relevant to nutrition and liver disease and warrants further investigation. Here we detail a novel method for sampling the proximal luminal and mucosal gut microbiome in human subjects undergoing upper endoscopy by obtaining duodenal aspirate and biopsies. Specimen procurement is facile and unaffected by artifacts such as patient preparatory adherence, as might be the case in obtaining colonic samples during colonoscopy. The preliminary results show that the luminal and mucosal microbiomes differ significantly, which is likely related to environmental conditions and barrier functions. Therefore, a combination of duodenal aspirate and biopsies reveal a more comprehensive picture of the microbiome in the duodenum. Biopsies are obtained from the descending and horizontal segments of the duodenum, which are anatomically close to the liver and biliary tree. This is important in studying the role of bile acid biology and the gut-liver axis in liver disease. Biopsies and aspirate can be used for 16S ribosomal RNA sequencing, metabolomics, and other similar applications.

In this manuscript, we discuss a novel method to sample and analyze the duodenal microbiome. This method provides an accurate depiction of microbial diversity and composition in the duodenum and could be useful for further investigation of the duodenal microbiome.

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut ...