Helty Adisetiyo, doktora ve Shangxin Yang, doktora Protokolü gelişimi için teşekkür etmek istiyorum. Genel destek için uluslararası anne çocuk ergen AIDS klinik denemeler grubu (IMPAACT) tarafından Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) ulusal kurumları, Sağlık (NIH) Ödülü numaraları altında sağlanan UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) ve UM1AI106716 (IMPAACT LC), Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (NIMH) ortak fon ile. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Tüm iletişim kuralı adımlar için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılmalıdır ve sıkı kirlilik önleme yaklaşımlar alınması gerekir. Kirlenme örneklerin en aza indirmek için sonrası amplifikasyon çalışma alanları için alanları iş akışını öncesi amplifikasyon işten gözlemlemek. Kullanılan tüm malzemeler steril, ücretsiz RNase, Dnaz, DNA ve pyrogen. Tüm pipet ipuçları süzülür. Bir akış protokolü adımlardan (şekil 1) sağlanır.
1. örnek lizis
Not: Örnek lizis ve nükleik asit ayıklama mühendislik ve yordam denetimleri yerine çevre bakteri giriş örnekleri en aza indirmek için nerede bir temiz oda ortamında bir DNA/RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>Temiz Biyogüvenlik Kabini (BSC) çalışma alanı herhangi bir nükleik asit kirlenme ortadan kaldırmak için uygun yüzey temizleyici ile.</li>
		<li>Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° C'ye ayarlayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium thiocyanate lizis arabellek hazırlamak (tablo malzemeleri görmek)
	<ol>
<li>Lizis arabellek precipitates için kontrol edin. Precipitates 37 ° C'de ısınma tarafından yeniden dağıtılması</li>
		<li>6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) ile lizis tamponunun 600 µL her örnek için hazırlayın. Bir ekstra % 20 birim başına örnek göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numune hazırlama
	<ol>
<li>Tam yağlı süt donmuş, buz çözme. Aliquot 5 mL bütünün 15 mL veya BSC bir 5 mL steril tüp içine süt ve buz üzerinde tutun.</li>
		<li>5-mL süt aliquot 5000 x g 4 ° C'de hücreler cips için de 10 min için spin.</li>
		<li>Yağ katman kaldırmak için şimdi tüp, plastik spatula ile veya büyük üst katmanda pipet ucu delik.</li>
		<li>Pelet bozmadan, tüm süpernatant 100 µL dışında kaldırın.</li>
		<li>Pelet 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspending tarafından yıkayın.</li>
		<li>1 negatif kontrol steril PBS 1 mL 5 mL tüp ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>Süspansiyon temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarmak ve bir microcentrifuge 1 dk (oda sıcaklığında (RT) 5000 x g) için spin.</li>
		<li>1000 µL steril süzülmüş pipet ucu tüm süpernatant/yağ katmanı iptal etmek için kullanın.</li>
		<li>Ayıklama aynı gün kendine değil dondurursanız hücre bir etanol/kuru buz Bulamaç koyarak cips ve hemen-80 ° C dondurucu transfer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Örnek bozulma ve homojenizasyon (Boncuk atan)
	<ol>
<li>β-ME için Pelet içeren lizis arabelleği 600 µL ekleyin ve süspansiyon bir boncuk tüp aktarın.</li>
		<li>Her ayıklama toplu 12 10 örnekler, 1 negatif kontrol (3.7 yukarıdaki hazır) ve (bir sonraki adımda hazırlanan) 1 olumlu denetim içerir.<ol>
<li>1 pozitif kontrol lizis arabellek ve bakteriyel sahte örneği (kullanılan sahte bir kez hulâsa, bir konsantrasyon, DNA'ın yaklaşık 0.2 ng/µL kuran) 20 µL hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Girdap tüm tüpler 15 için şiddetle boncuk s.</li>
		<li>700-800 rpm'de sallayarak ile ısı kontrollü vortexer 10 dk, 37 ° C'de ısı örnekleri.</li>
		<li>Tüpler otomatik örnek topu bağdaştırıcı kümesi yükleyin.</li>
		<li>Boncuk 30 Hz değerinde 1 dk. için yendi.</li>
		<li>Adaptör seti sökmeye ve el ile geçiş adaptörü ile örnek plakalar sol robotik kol araç şu robot kol için ayarla.</li>
		<li>Boncuk için başka bir 1 dk 30 Hz'de yendi.</li>
		<li>Santrifüj tüpleri için 25 ° C'de 3 dk 17,200 x g de</li>
		<li>Tüm süpernatant değil almak birisi örnek veya boncuk üstündeki yağ tabakasının örnek dibinde kalan ve bir homogenizer sütun için geçerli için dikkatli olmak bir 200 µL pipet ile kaldırmak.</li>
		<li>Homogenizer sütun maksimum hızda, 17,200 x g, 25 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi</li>
		<li>DNA ve RNA (herhangi bir diğer tüp kullanmayın) arıtma için otomatik araç ile kullanmak için bir 2 mL üreticinin microcentrifuge tüp eluate 350 µL aktarın. Herhangi bir kalıntı yağlı katman aktarmak için dikkatli olun.</li>
		<li>Akış yoluyla birim daha az 350 µL ise, β-ME ile lizis tampon 350 µL son bir hacim için ekleyin.</li>
		<li>Örnekleri RT için en fazla 2 saat devam etmeden önce otomatik DNA arıtma aleti kullanarak nükleik asit yalıtım için terk veya-80 ° C'de dondurmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çalışma alanını Temizleme
	<ol>
<li>Temiz tüm yüzeylerde enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın sonra % 70 etanol ile sprey ve yüzey silin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izole DNA/RNA
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>Isı blokta açın ve 70 ° c sıcaklık ayarlayın</li>
		<li>Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın</li>
		<li>10 mM Tris-Cl, pH 8,5, 50 mL tüp ile 70 ° c içeren elüsyon arabellek (EB) sıcak</li>
		<li>350 ısınmak donmuş örnek lysates 2 mL tüpler 37 ° c kadar tamamen µL çözdürülen herhangi bir çökelti (yaklaşık 10 dakika).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA arıtma
	<ol>
<li>Girdap ve 2 mL tüpler ile örnek kısaca santrifüj (3000 x g 10 için s).</li>
		<li>2 mL tüpler otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik, üreticinin yönergelerini başına takip shaker içine yerleştirin.</li>
		<li>Rotor adaptörleri almak ve onları örnek sayısına göre tepsi kurmak.</li>
		<li>Örnek'ın kimliği (ID) göre her rotor adaptör etiketleyin.</li>
		<li>Kapakları kesme ve DNA ve RNA için bireysel spin sütunları kenarlarını düzeltmek.</li>
		<li>DNA spin sütun koleksiyon tüp olmadan rotor adaptör yerleştirin. Toplama tüp atmak.</li>
		<li>Koleksiyon tüpler 1,5 mL etiketleyip rotor adaptör yerleştirin.</li>
		<li>Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.</li>
		<li>Üretici 1000 µL filtre-ipuçları ipucu raflar yerleştirin.</li>
		<li>2-mL üreticinin microcentrifuge Tube (başına belirli makine Protokolü yönergeleri) örnek sayısını temel alan RNase free su ekleyin.</li>
		<li>Tüp boru yuvaya microcentrifuge tüp Slots "A" takın.</li>
		<li>Reaktif şişeleri ve 10 mL minimum hacmi ile doldurun kalan herhangi bir reaktif atmak.</li>
		<li>Reaktif şişe raf (hariç EB şişe) Reaktif şişe takın.</li>
		<li>Sıcak EB reaktif şişe pozisyon 6 50 mL tüp sizden ekleyin.</li>
		<li>Onay 1,5 mL tüpler rotor adaptörleri sıkıca yerleştirilir.</li>
		<li>Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "ekstraksiyon kiti" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Kit'in adı 350 µL bölümü A özel DNA" → düzenlemek elüsyon birime 100 µL (varsayılan) veya düşük biyokütle örnekleri → için 50 µL "Start."</li>
		<li>Tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarın ve onları tepsiye yerleştirin.</li>
		<li>Rotor adaptör pozisyon 3 DNA spin sütundan atmak.</li>
		<li>Rotor adaptörleri atmayın, RNA pozisyonu 2.</li>
		<li>Pozisyon 3 eluted DNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −20 ° C.</li>
		<li>Herhangi bir örnek üzerinde aksi takdirde atma bırakılırsa örnek içeren tüpler shaker ve −20 ° C, deposunda toplamak.</li>
		<li>Protokolü "Kit'in adı 350 µL Bölüm B RNA" RNA'ın daha fazla arıtma ile devam edin.</li>
		<li>RNA arıtma yaklaşık 350 µL akışı-rotor adaptörleri orta konumda olan aracılığıyla üzerinden yapılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA arıtma
	<ol>
<li>RNA spin sütun koleksiyon tüp ve kapak olmadan rotor adaptör yerleştirin.</li>
		<li>Yeni 1,5 mL tüpler koleksiyonu etiket ve el kitabında belirtildiği gibi rotor adaptör ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.</li>
		<li>Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "Üretici Kit" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Standart bölümü B RNA" → "Başlangıç."</li>
		<li>Rapor tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarmak ve tepsiye koyun.</li>
		<li>RNA spin sütun 3 konumdan atmak.</li>
		<li>3 konumundaki 30 eluted µL RNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −80 ° C.</li>
		<li>Reaktif şişe kaldırın.</li>
		<li>Rotor adaptör içeriği uygun tehlikeli atık kanallar aracılığıyla atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Temiz iş istasyonu
	<ol>
<li>Tüm otomatik DNA/RNA arıtma gerecin aksesuarları, reaktif raflar, tepsi ve diğer herhangi bir yüzey gibi enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın ve ile durulayın sprey (DI) su deiyonize sonra koyup kuruyuncaya kadar bırakın.</li>
		<li>Enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm sprey otomatik araç ile sadece üretici onaylanmış, santrifüj ile birlikte kullanılan tüm yüzeyler içini silin, 10 dakikadır bırakın ve % 70 etanol ile silin. Araç zarar verebilir dekontaminasyon çözümlerin diğer türleri kullanmayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hedeflenen 16S PCR Set-up
Not: Kurulum 16S PCR için belirlenen ön amplifikasyon çalışma alanı temiz oda içinde bulunan gerçekleştirilir. Reaktifler ve örnekleri hazırlanan ve PCR nüsha (96 toplam nüsha gerçek örnekleri ve ayıklama pozitif ve negatif kontrolleri artı 2 PCR su kontrol dahil 30 örnekleri, her örnek için gerçekleştirmek için sıvı işleyicisi üzerine yüklenen kombine örnekleri ve denetimleri). PCR reaksiyonları toplandı ve kapalı sonra örnek plaka bisiklet için bir sonrası amplifikasyon bölgesinde yer alan bir termal cycler transfer edilir.
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>PCR iş istasyonunuzu temizledikten. Sprey bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, takip ve sonunda % 70 etanol.</li>
		<li>16S PCR çalışma hazırlama (bkz: hedefli 16S PCR çalışma) bir doğru örnek liste ve ata farklı barkodlu astar her örnek9. Çalışma sayfası ve (bkz: plaka 1) plaka haritalar yazdırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR ana karışım hazırlama Not: 16S astar seçimi belirli çalışma için ilgi bölge dayanır ve çalışma veya örnek türüne göre değişebilir. Bu nedenle, astar siparişi vermeden önce bu 16S rRNA en iyi hangi alanda ilgi belirli çalışma için mikropların yükselterek onaylamak önemlidir. Yazılı olarak bu 16S V4 bölge amplifikasyon için iletişim kuralıdır. Farklı astar/bölge seçilmişse, termal Bisiklet tavlama sıcaklığı ayar gerektirebilir.<ol>
<li>Her şeyi hazırlamak için PCR iş istasyonu içinde çalışmak.</li>
		<li>50-100 µL DNA örnekleri-20 ° c ve gerekli tüm Kimyasalları almak ve onları buz çözme. Girdap ve kısa bir süre spin aşağı.</li>
		<li>Astar 5 mikron 20 µL en küçük bir birim içinde çalışma konsantrasyonu için önceden seyreltilmiş.</li>
		<li>Yalnızca çalışma sayfasında hesaplama göre ileri astar ile belirli 5 mL tüp ana PCR karışımında hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Robot sıvı işleyicisi otomatik PCR kurulum için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Örnekleri, 32-şey gerecin örnek adaptörü almak ve 50-100 µL üretici yönergelerine göre 96-şey plaka haritaya göre DNA örnekleri yükleyin.<ol>
<li>Her PCR plaka için temiz örnek tüpte 30 µL PCR su koyarak 2 negatif denetimlerini ayarlayın.</li>
			<li>Tüm örnekleri açık konumda kilitli kapaklar ile 32-şey gerecin örnek bağdaştırıcısında yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ters astar9 için<ol>
<li>Belirli Bar kod içeren her ters astar kapağını çıkarın #'tek bir seferde (değişiklik eldiven arasında çapraz bulaşma önlemek için).</li>
			<li>En fazla 32 astar gerecin reaktif bağdaştırıcısında yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96-şey PCR tabak almak ve çalışma adı, örnek numarası, Tarih ve teknisyen baş harfleri ile etiketleyin.</li>
		<li>Robot sıvı işleyicisi yükleme<ol>
<li>Reaktif adaptör B1 bulunduğu yer. Bir kenar efekti önlemek için dikkatli bir şekilde bağdaştırıcı kavrama tarafına karşı bir kenarına yerleştirin ve yavaş yavaş diğer kenarına getirmek. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.</li>
			<li>Yer konum C1 örnek adaptör. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.</li>
			<li>Girdap 5 mL ana mix, kapağı açın ve pozisyon a cihazın ana mix ve reaktif blok üzerine yerleştirin.</li>
			<li>PCR plaka yarı etekli PCR plakaları tutma amaçlı 96-şey gerecin bağdaştırıcısında yerleştirin.</li>
			<li>Çalıştır başlatın ve yeni bir dosya olarak kaydedin.</li>
			<li>Yönergeleri izleyin ve onay işaretini her sorulduğunda: bir, ipuçları vardır, iki, atık kutusu kullanılabilir ve üç, başla.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çalışma tamamlandıktan sonra hata iletileri için makine kontrol ederek hiçbir hataları olduğunu doğrulayın.</li>
		<li>12 veya 8 şerit kapaklar, girdap ile plaka şiddetle, mühür ve bir 96-şey plaka spinner kullanarak 1dk için spin aşağı ve buz üzerinde veya buzdolabında yerleştirin.</li>
		<li>Ters astar ve örnekleri içeren tüpler kaldırın.</li>
		<li>96-şey plaka sonrası amplifikasyon odasına götürün ve termal cycler ve döngüsü (bkz. Tablo 1) termal Bisiklete binme koşullardan tabloya göre tabağa yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hedeflenen 16S Post-PCR kalite kontrol Jel Elektroforez için teyp tabanlı platformu kullanarak
Not: Post-PCR kalite kontrol (QC) ve tüm sonraki adımları laboratuar bir belirlenmiş sonrası amplifikasyon alanda yapılmaktadır. DNA otomatik DNA/RNA parça Çözümleyicisinde analiz edilir.
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>İş istasyonu bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, ardından püskürtme ve % 70 etanol tarafından nihayet temiz.</li>
		<li>Tüm malzeme ve ekipman gerekli toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaktifler hazırlamak
	<ol>
<li>Örnek arabellek ve merdiven 30 dk en az 25 ° c ısı kontrollü vortexer yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reaktifleri ısınma iken, PCR örnekleri 3 PCR çoğaltır her örnek için bir tek tüp havuzu tarafından hazırlamak</li>
	<li>Cihazda örnekleri yükleyin.</li>
	<li>Kısaca girdap ve tüpler havuza alınan PCR ürünü ile aşağı spin.</li>
	<li>Cihazın 96-şey plaka RT bir raf yerleştirin ve etiketleyin.</li>
	<li>Kısaca girdap ve spin örnek arabellek ve merdiven aşağı.</li>
	<li>3 µL örnek arabellek 96 iyi plaka (ihtiyacı en az 53 µL/ekran teyp) her şey için ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri çift sayıda çalıştırın; Tek sayıda örnekleri, örnek arabelleği 4 µL boş bir kuyuya ekleyin.</li>
	<li>Merdivenin 1 µL bir merdiven için de ekleyin.</li>
	<li>Harita ekleyin 1 µL havuza alınan PCR ürününün belirlenen için de.</li>
	<li>Kapak plakasını folyo mühür ile</li>
	<li>Girdap gerecin vortexer ve adaptör 2.000 devir / dakikada 1 dakika kullanarak plaka.</li>
	<li>Örnek varsa tüp alt aşağı spin kabarcıklar konum aşağı tekrar çevir.</li>
	<li>Yazılımını başlatın.</li>
	<li>Ekran teyp ve yükleniyor İpuçları araç yükleyin.</li>
	<li>96-şey adaptörle parçası analyzer içine örnekleri yükleyin.</li>
	<li>Koşuya denetleyicisi yazılımıyla ayarlayın.</li>
	<li>Hatta numaralı kuyu seçtiğinizden emin olun.</li>
	<li>Örnek kimliklerini yazın.</li>
	<li>Kontrol edin tüm kuyu ekran teyp gri renkle vurgulanır.</li>
	<li>Pipet ipuçları analyzer tanır emin olun.</li>
	<li>Başlat'ı seçin ve (ad, örnek numaraları ve Tarih çalışma) sonuçları kaydetmek için bir dosya adı belirtin.</li>
	<li>Daha fazla bilgi için üreticinin yönerge bakın.</li>
	<li>Çalışma tamamlandıktan sonra ipucu, ekran teyp ve tüpleri atmak.</li>
	<li>16S tepe nM (315-450 bp V4 için arasında) verileri analiz. Bu zirve seçilen astar bağlı olarak değişir.</li>
</ol>5. Kütüphane hesaplama, Havuzu, temizlik ve QC
<ol><li>Amplicon boyutu ve Derişim tüm örneklerinin belirledikten sonra havuz son istenen hacim ve nM havuza alınan kitaplığı için elde etmek için kitaplıklarına (bkz. örnek hesaplama).</li>
	<li>Temizlik ve silis-zar bazlı bir saflaştırma kullanarak havuza alınan kitaplığı kit PCR ürünlerinin, üretici göre konsantresi ( Tablo malzemelerigörmek) iletişim kuralı.<ol>
<li>DNA 50 µL son hacmi ile elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizlenmiş Kütüphane konsantrasyonu hemen bir yer için bir çift telli DNA yüksek hassasiyet kit kullanarak üreticinin protokole göre ölçmek.<ol>
<li>Havuza alınmış ve temizlenmiş Kütüphane 2 µL 198 µL seyreltme arabellek artı boya (1: 100 seyreltme) ile sulandırmak.</li>
		<li>Fluorometrik aygıttan ölçülen değeri kaydedin ve seyreltme faktörü göre dönüştürün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Havuza alınan kitaplığının (ng/µL) okuma konsantrasyon kullanarak, Kütüphane Derişim nm hesaplayın. 1 µL su katılmamış Kütüphane OD260/280 microvolume Spektrofotometre üzerinde ölçmek için kullanın. Not: Yeterli saflık kütüphanesinin 1.8-2.0 değeri gösterir.</li>
	<li>Sonraki nesil sıralama için hazır kadar son Kütüphane-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system.">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System.">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental,+tongue,+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity.">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).</li><li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome.">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).</li><li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects:+Tools,+techniques,+and+challenges.">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+human+microbiome+research.">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research.">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52 (2017).</li><li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing:+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing.">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561 (2017).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome.">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li><li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study.">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li><li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk.">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li><li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8(+)+T+cells+in+human+breast+milk.">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li><li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women.">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li><li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

16S rRNA, hedeflenen yeni nesil sıralama microbiome karakterizasyonu18için yaygın olarak kullanılan, hızlı bir tekniktir. Ancak, toplu iş etkileri, çevresel kirlenme, örnek Çapraz bulaşma, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik dahil olmak üzere birçok faktör, olumsuz deneysel sonuçlar etkiler ve onların yorumu7,19 yıkmak , 20. en iyi sağlam 16S analizleri kolaylaştırmak için microbiome iş...

İnsanlar kolonize mikrobiyal toplulukların insan sağlığı ve hastalığı etkileyen metabolizma, bağışıklık geliştirme, duyarlılık hastalık ve aşı ve ilaç tedavisi1, yanıt için önemli olduğuna inanılan 2. microbiota insan sağlığı üzerindeki etkisi şu anda anlamak için çaba vurgulamak ile tanımlanmış anatomik bölmeleri (Yani, deri, bağırsak, oral, vb), yanı sıra yerelleştirilmiş sitelerle ilişkili mikroplar tanımlaması Bu bölmeler3,4. Araştırmacı bu çabalarına destek hızlı ortaya çıkması ve mikrobiyal genetik içeriği (microbiome) analiz için bir örnek kitlesel paralel bir platform sağlayan yeni nesil sıralama (NGS) teknolojilerin artan erişilebilirlik olduğunu. Pek çok fizyolojik örnekleri için karmaşık ve bol ilişkili microbiome (Yani, dışkı), ancak, bazı örnekler için microbiome tarafından düşük mikrobiyal biyokütle (Yani, insan sütü, alt solunum yolu) nerede temsil edilir duyarlılık, deneysel eserlerin ve olası bulaşma önemli konular haline. Microbiome çalışmaları ve uygun deneysel tasarım ortak sorunları birden çok gözden makaleler5,6,7,8konu oldu.
Burada sunulan sağlam bir NGS deneysel boru hattı insan sütü microbiome karakterize rRNA 16S V4 bölge9 hedeflenen sıralama üzerinde temel alır. İnsan sütü Microbiome analizi değil karmaşık sadece bir doğal olarak düşük mikrobiyal biyokütle10, ama Ayrıca tarafından yüksek düzeyde insan DNA'sı11,12,13,14 arka plan ve potansiyel ertelenmiş ayıklanan nükleik asit PCR inhibitörleri15,16 . Piyasada bulunan ayıklama kitleri ve örnek hazırlama toplu işlemleri arasında değişkenlik en aza indirmeye yardımcı yarı otomatik platformlar bu protokolü kullanır. O örnekleri protokol her adımda doğrulamak ve boru hattı sağlamlık'bağımsız bir ölçü sağlamak için kalite kontrol işlenir iyi tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleştirmek. İletişim kuralı olarak açıklanan insan sütü örnekleri özgü olsa da, bu tabure, rektal, vajinal, Cilt, areolar ve sözlü temizleme bezi10,17de dahil olmak üzere diğer örnek türleri kolayca uyarlanabilir ve için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir microbiome analizleri gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA extraction kit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature-controlled vortexer</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&amp;szlig;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>bead tube</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automated sample disruptor adapter set</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB tube</td><td></td><td></td><td>manufacturer&#039;s microcentrifuge tube in kit</td></tr><tr><td>QIAcube and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automated DNA/RNA purification instrument</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>non-enzymatic decontamination solution</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>elution buffer</td></tr><tr><td>QIAgility and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>robotic liquid handler</td></tr><tr><td>PCR water</td><td>MO BIO</td><td>17000-</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcoded reverse primers</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 and related plasticware</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td></tr><tr><td>D1000 reagents for Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Çalışmalar mikrobiyal toplulukların nispeten ucuz, hızlı ve yüksek işlem hacmi sıralama gelişimi ile yaygın hale gelmiştir. Ancak, tüm bu teknolojileri ile gibi tekrarlanabilir sonuçlar birleştirmek uygun önlemler ve denetimleri bir laboratuvar iş akışı üzerinde bağlıdır. Bu özellikle düşük-biyokütle örnekleri ile nerede bakteriyel DNA kirletici yanıltıcı sonuçlar üretebilir önemlidir. Bu makalede mikroplar insan meme süt örneklerinden bir düşük - için orta - throughput ölçekte 16S ribozomal RNA (rRNA) V4 bölgesinin hedeflenen sıralama kullanarak tanımlamak için yarı otomatik bir iş akışı ayrıntıları. Tam yağlı süt de dahil olmak üzere gelen numune hazırlama protokolünü açıklar: örnek lizis, nükleik asit ayıklama, amplifikasyon 16S rRNA gen ve Kütüphane hazırlık kalite kontrol önlemleri ile V4 bölgesinin. Önemlisi, protokol ve tartışma belirgin hazırlama ve analiz düşük-biyokütle örnekleri de dahil olmak üzere çevre, reaktif tarafından uygun pozitif ve negatif kontrol eder, PCR inhibitörü kaldırma, örnek kirlenme konuları göz önünde bulundurun veya deneysel kaynakları ve tekrarlanabilirlik sağlamak amacıyla tasarlanan deneysel en iyi yöntemler. Açıklandığı gibi protokol insan sütü örnekleri için belirli ise, harika veya koruma arabellekte stabilize donmuş temizleme bezi, toplanan örnekleri de dahil olmak üzere çok sayıda düşük ve yüksek biyokütle örnek türleri için uyarlanabilir.

Burada sunulan Protokolü oluşturulan veri buluşma Protokolü duyarlılık, özgüllük ve kirlenme kontrolü için kriterler emin olmak için önemli kalite kontrol (QC) adımları içerir. Protokolün ilk QC adım PCR güçlendirme 16S V4 bölgesinin (Şekil 2) izler. Bir µL PCR ürününün her örnekten 315-450 bp (Şekil 2, kırmızı ok) beklenen boyut aralığı içinde olduğunu onaylamak için Elektroforez tarafından...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.

Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Görüntüleme.  University of California at Los Angeles. Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.

Video: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

Sucul Habitatlardan Hidrokarbon Metabolize Edici Özelliğe Sahip Bakteri Türlerinin İzolasyonu, Çoğaltılması ve Tanımlanması

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Çevre

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biyoloji

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Bakteriyosin Etkilerini Farenin Bağırsak Mikrobiyolojisi Üzerine Etkileyen Bir Yöntem

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Specimen Collection and Analysis of the Duodenal Microbiome

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut microbiome has been typically studied through fecal specimen collections. The ease of obtaining fecal samples has resulted in many studies that have revealed information concerning the distal luminal gastrointestinal tract. However, few studies have addressed the importance of the microbiome in the proximal gut. Given that the duodenum is a major site for digestion and absorption, its microbiome is relevant to nutrition and liver disease and warrants further investigation. Here we detail a novel method for sampling the proximal luminal and mucosal gut microbiome in human subjects undergoing upper endoscopy by obtaining duodenal aspirate and biopsies. Specimen procurement is facile and unaffected by artifacts such as patient preparatory adherence, as might be the case in obtaining colonic samples during colonoscopy. The preliminary results show that the luminal and mucosal microbiomes differ significantly, which is likely related to environmental conditions and barrier functions. Therefore, a combination of duodenal aspirate and biopsies reveal a more comprehensive picture of the microbiome in the duodenum. Biopsies are obtained from the descending and horizontal segments of the duodenum, which are anatomically close to the liver and biliary tree. This is important in studying the role of bile acid biology and the gut-liver axis in liver disease. Biopsies and aspirate can be used for 16S ribosomal RNA sequencing, metabolomics, and other similar applications.

In this manuscript, we discuss a novel method to sample and analyze the duodenal microbiome. This method provides an accurate depiction of microbial diversity and composition in the duodenum and could be useful for further investigation of the duodenal microbiome.

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut ...