Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde (1 R01 GM095384-01) atribuído à Floresta Rohwer. Agradecemos Epicentro, uma empresa Illumina para fornecer acesso antecipado a kits Ribo-Zero Epidemiologia. Agradecemos Mark Hatay para a concepção e produção do suporte de tubos de ultracentrifugação. Agradecemos Andreas Haas e Benjamin Knowles para leituras críticas e discussões sobre o manuscrito, e Lauren Paul para auxiliar o processo de filmagem.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomics virais As partículas virais são concentradas utilizando polietileno glicol (PEG) ou pequenos concentradores de volume. Em alguns casos, pode não ser necessária concentração, mas pré-filtração ou passos de centrifugação de baixa velocidade são usadas para remover as células eucarióticas e microbianas. Os lisados ​​virais será enriquecido e purificado utilizando ultracentrifugação de gradiente de densidade de 9,41 ou filtros de tamanho pequeno (por exemplo, 0,45 mm) para remover as células microbianas e eucarióticas grandes 25. Ultracentrifugação de gradiente de densidade é tipicamente realizada com soluções densos mas inertes, tais como sacarose ou cloreto de césio para isolar e concentrar as partículas virais 41. A separação física é baseada no tamanho e densidade de flutuação de partículas virais. Portanto, a escolha adequada do tamanho de poro do filtro e a rigorosa preparação de gradientes são essenciais para isolar as comunidades virais específicos, como o sucesso da recuperação físicaVLP determina a comunidade isolada 41 (isto é, partículas virais que não passam através do filtro ou queda na densidade de extracção não serão detectados no metagenome). Após o isolamento e concentração viral, pode haver contaminação material genómico não-viral presente na amostra, tanto na forma de ácidos nucleicos livres e microbiana e células eucarióticas. Portanto, é crítico para verificar a pureza de partículas virais em amostras (Figuras 1A e 1B). Um tratamento de clorofórmio é comumente utilizado para lisar as células remanescentes, seguido por tratamento com nuclease para degradar ácidos nucleicos livres antes da extracção do ácido nucleico. Uma advertência ao fluxo de trabalho apresentados foi a utilização de separação por gradiente de densidade para isolar partículas virais, uma vez que podem excluir partículas virais com invólucro que possam ser muito flutuante para entrar no gradiente de CsCl. Uma alternativa &quot;catch-all&quot; método é omitir a separ gradiente de densidadeção e isolar o DNA da comunidade dos 0,45 mm - filtrados tratados com clorofórmio e ADNase I. Esta abordagem é também apropriado para acomodar pequenos volumes de amostras, tais como aqueles a partir de esfregaços de sangue ou plasma. No entanto, isto pode resultar na contaminação bacteriana resistente ao clorofórmio e maior quantidade de ADN extracelular ADNase I resistente. Protocolos de seqüenciamento atuais requerem 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para a preparação biblioteca sequenciamento de DNA em que os rendimentos mais elevados proporcionar uma escolha mais ampla de opções de sequenciamento. A concentração de ADN de viromes geradas muitas vezes varia entre o limite inferior de detecção de mais do que 200 ng / mL. A quantidade de ácidos nucleicos virais recuperados podem ser insuficientes para a preparação da biblioteca de sequenciação directa. Em tais casos, a amplificação do ácido nucleico é essencial. Linker amplificação espingarda bibliotecas (LASLs) 2,42,43 e amplificação do genoma inteiro com base em múltiplos de amplificação de deslocamento (MDA) são os doismétodos mais comumente usados ​​para gerar DNA suficiente para sequenciamento. MDA métodos tais como aqueles baseados em phi29 polimerase de ADN são conhecidas por sofrer de viés de amplificação, e pode amplificar ADNcs e preferencialmente de ADN circular, resultando em taxonómico não quantitativo e caracterização funcional 44,45. Foi demonstrado uma versão optimizada do LASLs abordagem para introduzir apenas desvios mínimos, promove uma maior sensibilidade (para pequenas quantidades de material de partida), e é facilmente adaptado para diferentes plataformas de sequenciação 43. No entanto, a abordagem tem muitas etapas, requer equipamento especializado para minimizar a perda de DNA, e é limitado a modelos de dsDNA. No nosso laboratório, esta abordagem foi adaptada com sucesso para amplificar quantidade detectável e indetectável de DNA extraído a partir de lavage- broncoalveolar, e coral- VLP derivadas de água do mar (não publicadas e Hurwitz et ai. 46). Desenvolver pipelines de análise de dados tem classically sido um dos aspectos mais desafiadores da análise metagenômica viral devido à natureza altamente diversificada e em grande parte desconhecida das comunidades virais. Embora haja um número estimado de 10 8 genótipos virais na biosfera, até à data bases de dados virais atuais contêm ~ 4.000 genomas virais, o que é cerca de 1/100000 dessa diversidade viral total aproximado. Portanto, pesquisas baseadas em similaridade (como BLAST 47) para atribuição taxonômica e funcional em metagenomes virais possuem desafios inerentes. Muitas sequências de deixar de ter semelhanças significativas para genomas no banco de dados e, portanto, são classificados como desconhecido. Apesar de pesquisas baseadas em homologia são as aplicações mais importantes para a atribuição de taxonomia e função para a sequência de dados, abordagens alternativas com base na análise independente do banco de dados foram desenvolvidos 48- 50. Fancello et al. 51 fornecer uma revisão completa de ferramentas computacionais e algoritmos usados ​​em Viral metagenômica. Microbial Metagenomics Tipicamente, a quantidade total de DNA extraído a partir de comunidades microbianas tratados com lise hipotónica (HL-DNA) na gama de 20 ng a 5 mg. O rendimento é altamente dependente do estado de saúde do paciente e a quantidade de amostra de expectoração recolhida, o que explica as variações observadas na produção total de células HL-DNA extraído neste estudo (Tabela 2). Os passos críticos para gerar dados de sequência de boa qualidade dependem da qualidade de bibliotecas de sequenciação geradas. A Figura 2 mostra um intervalo de tamanho típico para as bibliotecas de sequenciação geradas a partir de ADN microbiano derivado de expectoração CF utilizando um procedimento de fragmentação de ADN baseada em enzimática. O tamanho óptimo biblioteca é dependente da escolha da plataforma de sequenciação e aplicação, e, por conseguinte, o processo de fragmentação pode ser optimizado, se necessário, através de métodos alternativos, tais como sonicação e a nebulização. Além deos resultados representativos apresentados, o sucesso do método apresentado na expectoração CF recolhidos a partir de vários doentes em vários pontos de tempo é também ilustrado na Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10. Estudos anteriores 9,10 sugerem que cada paciente abriga um conjunto exclusivo de comunidade microbiana que muda ao longo do tempo, refletindo assim a persistência dos principais jogadores dentro da comunidade enquanto as flutuações são provavelmente devido a perturbações, tais como tratamentos com antibióticos. Se essas flutuações ocorrem diariamente, mesmo sem perturbações externas ou devido ao processo de amostragem e processamento de amostras, ainda está em questão. Com base na metagenômico HL-ADN e análise amplicão ADNr 16S, a amostragem de 7 dias longitudinal mostra que a variação diária de perfis microbianas sem perturbação antibiótico (Dia 1, 2, e 3) foi mínima (Figuras 3A e 3B). Após a introduçãoprodução de antibióticos orais imediatamente após a amostragem Dia 3, mudanças no perfil da comunidade tornou-se evidente no dia 4. Enquanto o antibiótico ciprofloxacina atinge um amplo espectro de bactérias patogénicas conhecidas, tais como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Streptococcus pneumoniae, o tratamento aumentou a abundância relativa de P. aeruginosa, enquanto diminui o Streptococcus spp. e P. melaninogenica. By Day 6, a comunidade recuperou lentamente para a estrutura inicial da comunidade de partida. Os resultados sugerem que as flutuações de perfis microbianos dentro de um único paciente é mais provável devido a perturbações da comunidade nas vias aéreas. Dada a consistência entre os perfis microbianos de bibliotecas 16S rDNA e metagenomes de DNA HL-derivada, que descartou os preconceitos provenientes dos primers 16S rRNA utilizados neste estudo. Uma possível explicação para as diferenças observadas em toda 16S rDNA taxonômicoperfis al gerados a partir de ADN total e HL-ADN derivado (Figura 3B) pode ser a presença de quantidades elevadas de Pseudomonas spp. ADN extracelular após o tratamento antibiótico. Isto é apoiado pelas descobertas de que estas diferenças foram mais aparentes no dia 7, três dias após o tratamento antibiótico, que tem como alvo Pseudomonas spp. em adição aos outros. A ciprofloxacina é comumente usada como tratamento de primeira linha em pacientes com FC e P. crônica infecção aeruginosa, embora o seu espectro de atividade inclui a maioria dos patógenos associados à FC. Trabalhamos com a hipótese de que o tratamento com antibióticos erradica comunidades sensíveis, incluindo Streptococcus spp. e, portanto, criar um nicho preenchido por P. resistente aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa pode ganhar resistência, através do aumento de suas comunidades de biofilme e DNA extracelular foi mostrado para ser o principal suporte estrutural de sua arquitetura biofilme 52. Mesmo quando tele recuperou a estrutura da comunidade, DNA extracelular pode ter permanecido no CF escarro. Portanto, estes dados sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem apresentados neste fluxo de trabalho potencialmente beneficiar não só na remoção do ADN humano derivada, mas também ADN extracelular microbiana derivada que podem deturpar os perfis microbianas reais. Metatranscriptomics A alta qualidade metatranscriptome deve conter relativamente poucas sequências de RNA ribossomal (rRNA) e representam uma amostragem imparcial das transcrições da comunidade (mRNA). Devido à semi-vida curta e limitada quantidade de ARNm, é crítico que o protocolo, como apresentado aqui, reduz o manuseamento da amostra para maximizar o número de transcritos recuperados. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. Estes incluem Microb Enrich, Ribo-Zero, e específicas de cada amostra h subtrativoybridizations 53 que são baseados em hibridação de oligonucleótido, e o ARNm-kit APENAS que se baseia na actividade enzimática do RNA alvo contendo uma exonuclease &#39;monofosfato 5. Além disso, várias abordagens para enriquecimento de mRNA, tais como o MessageAmp Kit II-Bactérias que preferencialmente polyadenylates e amplifica ARN linear também estão disponíveis. Alguns destes métodos (por exemplo, de mRNA-ONLY, Microb E Xpress eo MessageAmp) são usadas simultaneamente para máxima eficiência. No entanto, a eficácia de todas estas abordagens estão limitadas, especialmente quando se trabalha com rRNA parcialmente degradado, como frequentemente observado no ARN total extraído de amostras de FC. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser usado para gerar metatranscriptomas consistindo de ARNm tanto eucarióticas e procarióticas. Além disso, o (A) da cauda poli adicionado às sequências pode reduz a quantidade de dados de sequências úteis. Regiões com trechos homopoliméricas tendem a ter menores escores de qualidade, causing um número significativo de lê para ser filtrados por sequenciação e software de pós-sequenciamento, e a duração média de leitura útil após o corte fora de poli (A) caudas serão significativamente reduzidos em 54. Lidar com as comunidades microbianas CF complexos e RNA parcialmente degradado (Figuras 4A e 4C), nosso estudo anterior mostrou que o método de captura de hibridização pelo kit Ouro Ribo-Zero foi mais eficaz na remoção tanto rRNA humano e microbiana em comparação com os combinam tratamentos com outros kits 9 (Tabela 3). Os dados resultantes permite a análise simultânea de ambos hospedeiro humano e transcritos microbianas. Dependendo do rendimento e qualidade do RNA, assim como a escolha final da plataforma de sequenciamento, muitos desses processos, incluindo o passo a síntese de cDNA podem ser simplificados, com geração biblioteca seqüenciamento. Por exemplo, o ARN tratado Ribo-Zero pode ser usado para fazer a sequenciação metatranscriptome libraries utilizando o kit RNA-Seq ScriptSeq Biblioteca Preparação. Análise metagenômica de comunidades associadas a animais fornece uma representação abrangente da entidade funcional global que inclui o acolhimento e de suas comunidades associadas. O fluxo de trabalho aqui apresentado é adaptável a uma variedade de amostras associado a animais complexos, especialmente aqueles que contêm muco espesso, grandes quantidades de resíduos celulares, o DNA extracelular, proteínas e complexos de glicoproteína, bem como células hospedeiras para além do microbiano e viral desejado partículas. Mesmo que as partículas virais e microbianas podem ser perdidos a cada passo, as partículas de isolamento e purificação são essenciais para minimizar a quantidade de ADN do hospedeiro. Enquanto os dados metagenomics fornece potenciais metabólicas das comunidades examinados, metatranscriptomics complementar esta revelando a expressão diferencial de funções codificadas 9. Uma avaliação abrangente dos dados genómica e transcrições rendeu novas insireitos à dinâmica das interações com a comunidade e facilita o desenvolvimento de terapias melhorando 9,10,55.

<html> Comunidades virais e microbianas associadas com o corpo humano têm sido investigados extensivamente na última década, através da aplicação de tecnologias de sequenciamento 1,2. Os resultados conduziram ao reconhecimento dos micróbios importância na saúde humana e da doença. A principal iniciativa partiu do projeto humano microbiome que descreve as bactérias (e alguns archaea) residentes na pele humana, e dentro de cavidades orais, vias respiratórias, trato urogenital e do tracto gastrointestinal 3. Mais estudos microbioma de saudáveis ​​vias respiratórias humanas através de lavado bronco-alveolar (BAL) 4,5 e swabs de nasofaringe 4 demonstraram que o pulmão pode servir como um dispositivo de recolha de amostras ambientais, resulta na colonização microbiana transitória nas vias aéreas. No entanto, o impacto da colonização microbiana em superfícies das vias respiratórias com deficiência pode levar a infecções pulmonares graves e crónicos, tais como as observadas em pacientes de fibrose cística (FC). t &quot;&gt; CF é uma doença genética letal causada pela mutação no regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) 6. Estas mutações dão origem a proteínas CFTR defeituoso que por sua vez afecta o transporte de iões transepitelial através da superfície apical do epitélio. A doença afecta múltiplos sistemas orgânicos, mas a maioria de mortalidade e morbidade é atribuível à doença pulmonar FC 7. A CF pulmão fornece um ecossistema único para a colonização microbiana. O defeito no transporte de íons provoca muco para acumular-se nas vias aéreas CF, criando microambientes que consistem em aeróbia , microaerofilia, e compartimentos anaeróbios ancorados por uma superfície mucosa rico em nutrientes estática. Esta ambiente facilita a colonização e proliferação de micróbios, incluindo bactérias, vírus, e fungos. aguda e infecções microbianas pulmonares crónicas levam a respostas imunitárias constantes mas ineficaz, resultando em extensa remodelação das vias respiratórias, a perda de capacidade pulmonar, e, finalmente, pulmoinsuficiência pulmonar. Comunidades bacterianas associadas com a CF de pulmão foram bem descritas por meio de abordagens cultura-dependentes e independentes de cultivo, que incluem usando 16S RNA ribossomal (rRNA) sequenciamento gene 8 e metagenomics espingarda 9,10. A abordagem baseada em rRNA 16S é capaz de caracterizar uma vasta gama de espécies microbianas e capturar grandes mudanças na diversidade comunidade. No entanto, ele é limitado em sua resolução na definição das comunidades (resumidos na Claesson et al. 11, 2010) e as previsões de potenciais metabólicas se limitam a essas funções gerais conhecidos para a taxa identificados. Portanto, 16S rRNA métodos de sequenciação do gene são insuficientes para a precisão analítica taxonômica e funcional necessária das diversas comunidades microbianas presentes nos pulmões de FC. A abordagem metagenômica descrito aqui complementa a abordagem baseada em rRNA 16S, supera suas limitações, e permite uma maneira relativamente eficazpara analisar tanto a taxonomia comunidade microbiana e conteúdo genéticas nos pulmões com FC. ADN microbiana isolada a partir de amostras associado a animais, muitas vezes contém uma grande quantidade de ADN do hospedeiro. Expectoração ou amostras de tecido de pulmão com FC geralmente contêm uma grande quantidade de ADN libertado pelos neutrófilos humanos na resposta imune, muitas vezes, maior do que 99% do DNA total de 12 - 14. Embora algumas células humanas intactas pode estar presente, a maior parte deste ADN é livre em solução ou adsorvido à superfície de micróbios. Além disso, a presença de tampões de muco viscoso excepcionalmente, detritos celulares e outros contaminantes desconhecidos complicam ainda mais o isolamento de células microbianas. Vários métodos foram testados para empobrecer a estas amostras de ADN humano, incluindo gradientes de Percoll a humano a partir de células microbianas separado 15, o tratamento com DNase I, o brometo de etídio monoazide para degradar selectivamente DNA humano 16, e o kit MolYsis, tudo com sucesso limitado.<html> Até à data, o processo mais eficiente de purificação de ADN microbiano para expectoração de FQ foi uma modificação do processo descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Esta abordagem, aqui conhecido como método de lise hipotónico (HL), utiliza uma combinação de β-mercaptoetanol para a redução de mucina ligações dissulfureto, lise hipotónica de células eucarióticas, e tratamento com DNase I de ADN solúvel 9. Apesar da falta de alternativas ao método HL levantou algumas preocupações devido a (i) possíveis vieses resultantes da lise indesejada de micróbios e (ii) se as flutuações observadas na composição da comunidade 9,10 são um artefato de variações associadas com o processamento da amostra. Para além da geração de metagenomes espingarda, que abordar estes problemas, comparando os perfis de genes de rRNA 16S e o ADN total extraído a partir de DNA microbiano do método HL utilizando o mesmo conjunto de amostras de expectoração recolhidos a partir de um único paciente em sete dias consecutivos. ent &quot;&gt; Em comparação com as comunidades microbianas, a caracterização das comunidades virais associados com animais é limitado 18,19 As comunidades virais em CF das vias aéreas só foram caracterizadas minimamente 20 -.. 22 O primeiro estudo metagenômico caracterizar o DNA de comunidades virais em CF das vias aéreas mostraram que a maioria dos vírus associados com os pulmões com FC são fagos 20. O potencial metabólico de fago na FQ e indivíduos sem FC foi significativamente diferente. Especificamente, as comunidades de fagos em indivíduos com FC realizada genes reflectora de adaptações hospedeiras bacterianas para a fisiologia de CF das vias aéreas, e virulência 20. metagenomic estudos subsequentes bacterianas do vírus no tecido pulmonar FC demonstrou heterogeneidade espacial distinto de comunidades virais entre as regiões anatômicas 22. Além disso, o tecido pulmonar FC abrigou a diversidade viral menor observado até agora em qualquer ecossistema 22. A maioria dos vírus identificados foram fagoscom o potencial para infectar patógenos CF. No entanto, os vírus eucarióticos como o vírus do herpes, adenovírus e vírus do papiloma humano (HPV) foram também detectadas. Em um caso, onde foram observados quistos no tecido do pulmão durante a dissecção, mais de 99% de um genoma de vírus do papiloma humano foi recuperado, mesmo que o paciente nunca foi diagnosticado com um papiloma ou carcinoma pulmonar. Isso indica que a diversidade viral presente reflete não só a gravidade dos danos nos tecidos, mas também pode expor e explicar uma doença uncharacterized subjacente. Os protocolos descritos aqui fornecer uma maneira simples, mas poderosa para isolar partículas virais (VLPs) a partir de amostras que consistem em grandes quantidades de muco espesso, de acolhimento e células microbianas, DNA livre, bem como restos celulares. Complementando metagenômica, metatranscriptomics é usado para monitorar a dinâmica na expressão gênica em toda a comunidade microbiana e o anfitrião 9,23. Neste caso, tanto microbiana e host ARNm devem ser preferencialmente seleccionado. Uma vez que os mRNAs não estão poliadenilados bacterianas, um ARNm método suspenso baseado em oligo-dT, não pode ser explorado. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser utilizado em amostras associadas hospedeiras-se as amostras são conhecidas por conter grandes quantidades de ARNm eucariota. Muitas amostras associado a animais, expectoração de FQ, contêm uma elevada densidade de células, para além de grandes quantidades de detritos celulares e nucleases que incluem as RNases. Assim, outro desafio é evitar uma forte degradação do RNA durante metatranscriptome processamento. Na maioria dos casos, o RNA total extraído de expectoração CF é parcialmente degradado, o que limita as aplicações a jusante e utilidade do ARN derivado. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. A eficácia dessas abordagens se limita, contudo, especialmente quando se trabalha com parcialmente degradada rRNA 9,24. Os métodos empregados aqui permitired para a recuperação de RNA total parcialmente degradada adequado para jusante remoção total rRNA eficiente. A comparação directa da eficiência de remoção de rRNA a partir de ARN total parcialmente degradado comparando dois conjuntos diferentes foi ilustrada por Lim et ai. (2012) 9. No geral, o objetivo deste artigo é o de fornecer um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar metagenomes espingarda virais e microbianas, e um metatranscriptome, a partir de uma única amostra associada ao animal, utilizando amostra de escarro induzido como um exemplo. Fluxo do laboratório molecular deverá incluir as áreas de pré e de pós-amplificação separados para minimizar a contaminação cruzada. Os métodos são facilmente adaptáveis ​​a outros tipos de amostras, tais como o tecido 22, nasofaringe e orofaringe cotonetes 25, a lavagem broncoalveolar (BAL) e de coral (dados não publicados). Cada amostra deve ser processado imediatamente após a coleta, especialmente quando metagenomics microbianas e conheceuatranscriptomics estudos são desejados. Se as amostras foram congeladas, que limita o isolamento de células microbianas intactas para metagenomes microbianos como o congelamento potencialmente romper a integridade da célula. No entanto, o congelamento não exclui metatranscriptomics e isolamento viral, mas a qualidade do ARN e da quantidade de partículas virais recuperados podem ser afectadas pelo processo de congelação-descongelação. É importante notar que a expectoração induzida tem servido como fonte primária de amostras em muitos estudos associados a pacientes adultos e outras doenças pulmonares crônicas 26,27 como BAL pode ser muito invasivo. Em nossos estudos, amostras de escarro foram coletadas com um método de amostragem cuidadosa e consistente, ou seja, na sequência de bochechos e lavagem da cavidade oral, utilizando solução salina estéril para manter a contaminação micróbios orais dentro das amostras de escarro para um mínimo.

<table><tbody><tr><td>Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td></tr><tr><td>Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Zirconia-silicate beads were used in this study</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, molecular grade (dry powder)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.45 &amp;micro;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I enzyme&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diameter: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &amp;frac12; in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 fixed angle rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Previously bought from Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td></tr><tr><td>Total rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td></tr><tr><td>Cesium chloride&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

A acessibilidade de high-throughput seqüenciamento revolucionou muitas áreas da biologia. A fim de entender melhor as comunidades microbianas associadas virais e do hospedeiro, um fluxo de trabalho abrangente para a extração de DNA e RNA foi desenvolvido. O fluxo de trabalho ao mesmo tempo gera metagenomes virais e microbianas, assim como metatranscriptomas, a partir de uma única amostra para o sequenciamento de próxima geração. O acoplamento destas abordagens fornece uma visão geral de ambas as características taxonómicas e as funções de comunidade codificado. Os métodos apresentados usar Fibrose Cística (FC) expectoração, um tipo de amostra problemático, porque é extremamente viscosa e contém uma quantidade elevada de mucinas, ADN livre de neutrófilos, e outros contaminantes desconhecidos. Os protocolos descritos aqui direcionar esses problemas e com sucesso recuperar DNA viral e microbiana com a contaminação de DNA humano mínima. Para complementar os estudos Metagenômica, um protocolo metatranscriptomics foi otimizado para recuperar tanto microbianae mRNA host que contém relativamente poucas seqüências de RNA ribossômico (rRNA). Uma visão geral das características dos dados é apresentada para servir de referência para avaliar o sucesso dos métodos. Amostras adicionais CF escarro também foram coletadas para (i) avaliar a consistência dos perfis microbioma em sete dias consecutivos dentro de um único paciente, e (ii) comparar a consistência da abordagem metagenômica para a sequenciação à base de gene 16S RNA ribossomal. Os resultados mostraram que a flutuação diária das perfis microbianas sem perturbação antibiótico foi mínimo e os perfis de taxonomia das bactérias comuns associadas CF eram altamente semelhantes entre as bibliotecas 16S rDNA e metagenomes gerados a partir do DNA -derived lise hipotônica (HL). No entanto, as diferenças entre os perfis taxonómicas 16S rDNA gerado a partir de ADN total e HL-ADN derivado sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem em beneficiar não só a remoção do ADN de origem humana, mas também extracellul-microbiana derivadaDNA ar que podem deturpar os perfis microbianos reais.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K visualizações.  San Diego State University.  Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais. 

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Análise metagenômica de Silagem

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genética

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Biologia do Desenvolvimento

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Neurociência

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Biologia

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...