Agradecemos ao Dr. Alicia Mattiazzi para a discussão crítica do trabalho apresentado. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 HL-084487) para ALE.

Este protocolo e todo o tratamento ratos foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a UC Merced (No. 2008-201). Experimentos com periquitos foram realizadas em 1999, de acordo com as condições gerais do uso de animais estabelecida pela comissão científica do Instituto Venezuelano de Pesquisas Científicas (IVIC). 1. Langendorff Set Up Preparação <ol><li> Preparar a solução de Tyrode contendo as seguintes concentrações de soluto em mM: 140 de NaCl, 5,4 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 de glucose, 10 de HEPES. Ajuste o pH da solução de Tyrode a 7,4 com NaOH e filtra-se a solução através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Carregar a solução de Tyrode para as seringas 60 mL e toda a tubagem de Langendorff o plano horizontal definido 11, 12 ilustradas na Figura 4. Certifique-se de eliminar todas as bolhas de ar. </li><li><strong&gt; Equilibrar solução de Tyrode com 100% de O2 usando um &quot;pedra de ar&quot; plástico submerso tal como ilustrado na Figura 4. <ol><li> Ligar a tubagem de plástico para um tanque de O2. </li><li> Adicionar um adaptador T de plástico para reduzir a &quot;tubo 5 na solução de Tyrode na seringa de 60 mL. </li><li> Anexar uma pedra de ar de plástico para o fim do &quot;tubo 5 de modo O2 vai borbulhar para dentro da solução de Tyrode. </li></ol></li><li> Coloque uma sutura cirúrgica não absorvível em torno de uma agulha usada como uma cânula. A agulha é acoplado ao colector (ver Figura 4) que permite que retro-perfusão com soluções diferentes. Finalmente, aorta do coração vai ser transferida por cânula para a agulha. </li></ol> 2. Preparação Animal e Coração Dissecção <ol><li> Pesar e injetar o mouse com heparina (ex. Rato de peso de 20 g, injetar com 20 unidades ou 200 ul) 15 min antes da eutanásia por deslocamento cervical. Anestesiar periquitos de acordo com to guias uso de animais de seu protocolo IACUC e então prosseguir com deslocamento cervical. NOTA: Use 8 semanas ratos velhos ou 20 g de periquitos. </li><li> Tiraram o coração do interior da cavidade torácica após a eutanásia. Extrair corações parakeet exactamente da mesma maneira como descrito para os ratos. <ol><li> Limpe o peito do rato com etanol. </li><li> Com uma tesoura de dissecção, fazer uma incisão no abdômen inferior e, em seguida, cortar os lados em direção ao pescoço. </li><li> Puxe o tecido cortado e fixá-lo. </li><li> Cortar o diafragma. Tenha cuidado ao cortar o diafragma para evitar danificar o coração. </li><li> Remover os pulmões e do tecido circundante. </li><li> Use uma pinça para colher o coração sem apertar. Cortar a aorta tanto tempo quanto possível. </li></ol></li><li> Transportar o coração em um pequeno pesar barco com cerca de 1 mL de solução de Tyrode. </li><li> Usando uma sutura cirúrgica não absorvível, amarrar a aorta para o aparelho de Langendorff horizontal através de umagulha. Amarre a aorta do coração com o auxílio de duas pinças finas. Comece retro-perfusão através da abertura da válvula situado em série com as seringas de 60 ml contendo solução de Tyrode. </li><li> Permitir que o coração estabilizar durante 10 min. Use esse tempo para limpar o sangue e o tecido gordo em torno do coração antes do carregamento do corante. Puxar o tecido adiposo perto da base do coração com pinças e cortadas usando pequenas tesouras de dissecação. Certifique-se de fazer isso sob o ponto de vista de um microscópio de dissecação. </li></ol> 3. Ca citosólico 2 + Medidas: Preparando Dye Rhod-02:00 <ol><li> Adiciona-se 20 uL da plurónico a 20% (um agente tensioactivo não-iónico) em DMSO para um frasco de plástico embalados especial fornecida pelo fabricante de corante contendo 50 g do corante. </li><li> Misturar por pipetagem cima e para baixo, evitando bolhas. </li><li> Transferir o DMSO misturado com o agente tensioactivo não iónico e do corante a partir do frasco de plástico embalados especial para um frasco de vidro transparente. Adicionar 1 ml de Tyrode solução para o frasco de vidro transparente. </li><li> Sonicar durante 15-20 min num sonicador de banho. </li><li> Perfundir o corante utilizando bombas peristálticas durante 30 min à temperatura ambiente. <ol><li> Coloque o corante na câmara de corante. </li><li> Usar um grampo mecânico para comprimir todas as outras linhas de tubos ligados ao colector. O grampo é colocado acima do colector. Isto irá evitar qualquer refluxo para a tubagem ligada para as seringas de 60 ml. </li><li> Ligar a bomba peristáltica para começar a perfusão de circulação do corante. Imediatamente fechar a válvula de 3 vias abaixo da seringa de 60 mL. </li><li> Posicionar um pequeno tubo que está ligado à bomba peristáltica de sucção ao lado do coração para recircular o corante que tenha sido perfundidos no coração. </li></ol></li></ol> 4. Intra-SR Ca 2+ Medidas: Preparando Dye Mag-Fluo4AM <ol><li> Prepara-Mag Fluo4AM da mesma maneira como Rhod-02:00. Consulte a seção 3 para obter instruções passo a passo. </li><li> afteR carregamento do corante, abrir a válvula situada em série com as seringas de 60 ml contendo solução de Tyrode para começar a retro-perfusão. Certifique-se de remover o grampo acima do colector. </li><li> Adicionar solução de Tyrode com a câmara horizontal e aquecer até 37 ° C. </li><li> Retro-aspergir com solução de Tyrode durante 45 minutos para remover o corante citosólica. </li></ol> 5. potencial de membrana Medidas: Preparando Dye Di-8-ANEPPS <ol><li> Adicionar 5 ml de etanol a 99% para o frasco de tinta que contém 5 mg de corante. </li><li> Alíquota de 10 uL em 500 frascos de plástico 1 mL individuais utilizando uma pipeta de repetidor. </li><li> Desidratar no vácuo velocidade e armazenar a -20 ° C. </li><li> Adicionar 20 uL de 20% de Pluronic em DMSO para um frasco de plástico com 10 ^ g do corante dessecada. </li><li> Misturar por pipetagem cima e para baixo, evitando bolhas. </li><li> Transferir a mistura contendo DMSO com Pluronic e corante a partir do tubo de plástico a um cilindro graduado (10 mL). Adicionar uma solução de Tyrode a VO definitivalume de 5 mL. </li><li> Sonicate para 20-25 min num sonicador de banho. </li><li> Perfundir para o coração durante 30 minutos utilizando bombas peristálticas. Consulte as instruções passo a passo na Seção 3.5. </li></ol> 6. Gravar sinais epicárdicas <ol><li> Após o carregamento do corante, retro-perfundir o coração com solução de Tyrode, removendo o grampo por cima do colector. Abrir a válvula situada em série com a seringa de 60 ml contendo solução de Tyrode. solução de Tyrode-rociar retro durante 10 minutos para estabilizar o coração. </li><li> Encher a câmara horizontal com solução de Tyrode e ligar o aparelho de Peltier para trazer a temperatura do banho para 37 ° C. </li><li> Posicionar a fibra óptica na superfície do coração. <ol><li> Coloque a fibra óptica dentro de uma pipeta de 2 ml e em seguida, anexar a pipeta para um micromanipulador. </li><li> Use o micromanipulador para pressionar ligeiramente o fibra óptica contra a superfície do VE. </li></ol></li><li> Externamente andar pelo heata com um estimulador controlado por um gerador de ondas. <ol><li> Programar o gerador de onda para fornecer um impulso quadrado com uma largura de 1 ms. </li><li> Defina o estimulador para ser sincronizado externamente e ligar a entrada externa para o gerador de onda. </li><li> Para cada uma das saídas do estimulador, ligar um fio com uma agulha de acupunctura soldada no final. </li><li> Coloque as duas agulhas de acupuntura no ápice do coração aproximadamente 3 mm de distância um do outro. </li><li> Só depois de as agulhas são colocadas no tecido, ligar a saída do estimulador para evitar o choque eléctrico. </li></ol></li><li> No software de aquisição, ajustar a frequência de aquisição até 10 kHz. </li></ol> 7. Gravar sinais endocárdicos <ol><li> Consulte a etapa 6,1 e 6,2 para estabilizar o coração após o carregamento do corante. </li><li> Utilizando um ponto afiado 23Ga sobre o tamanho da fibra óptica, faça um pequeno orifício na superfície do coração no ventrículo esquerdo perto do septo. </li> &lt;li&gt; Coloque um adaptador cirurgia esclerotomia intravítrea para auxiliar no posicionamento da primeira fibra óptica no endocárdio usando um micromanipulador. </li><li> Externamente ritmo do coração. Consulte o passo 6.4. </li><li> Em software de aquisição, ajustar a frequência de aquisição até 10 kHz. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo é centrada em descrever as técnicas de fluorescência de campo locais para avaliar a função dos miócitos cardíacos ex vivo. O estudo destas células em um ambiente acoplado é não só mais fisiológico, mas também é altamente adequada para a avaliação de nível patologias de órgãos. Os eventos celulares subjacentes acoplamento de excitação-contracção (ECC) pode ser avaliado em todo o nível do órgão com o uso de sondas moleculares que monitoram Ca2 + intracelular dinâm...

O coração é o órgão central do sistema cardiovascular. A contracção do coração é iniciado por um aumento intracelular [Ca2 +]. A relação entre a excitabilidade elétrica e as mudanças no intracelular liberação de Ca2 + tem sido historicamente estudado em células enzimaticamente dissociada 1, 2. No entanto, as células cardíacas estão electricamente, metabolicamente e mecanicamente acoplada 3, 4. Quando isolado, os miócitos não são só fisicamente desacoplado, mas miócitos de diferentes camadas são misturados durante a dissociação 5. Além disso, apesar das enormes vantagens que surgiram a partir do estudo de células isoladas, sob condições de fixação de tensão, 6, 7, 8 a natureza intrínseca do coração como um alwa sincício elétricays coloca a questão de como funcionalmente diferentes são células dissociadas das presente no tecido 3. Neste artigo, descrevemos os avanços obtidos no conhecimento da fisiologia cardíaca através da utilização de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais (LFFM) no coração intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiplas variáveis fisiológicas, como citosólica de Ca2 +, intra retículo sarcoplasmático (RS) Ca 2+ e potencial de membrana. Estas medições podem ser obtidos simultaneamente e em conjunto com a pressão ventricular 9, 10, eletrocardiogramas 9, potenciais de ação elétricos (APs), gravações atuais iónicos e fotólise de compostos enjaulados 4, 11. Além disso, estas medidas podem ser obtidas pelo ritmo do coração intacto em frequências mais altas pertor para taxas fisiológicas. Apesar de vários artigos 9, 11, 12, 13, 14 foram publicados pelo nosso grupo usando técnicas LFFM, a presunção de complexidades técnicas associadas com esta técnica tem impedido a sua utilização maciça em estudar fenômenos fisiológicos ex vivo no coração e outros órgãos. A técnica LFFM (Figura 1) é baseado em medidas epifluorescência obtidos usando uma fibra óptica multimodo em contacto com o tecido. Como qualquer técnica de imagiologia de fluorescência de contacto, a resolução óptica depende do diâmetro e a abertura numérica (NA) da fibra. Um diâmetro maior e menor de NA da fibra irá aumentar a resolução espacial das medições. AEs e diâmetro das fibras pode variar 0,22-0,66 e de 50 um a 1 mm, respectivamente. Dentrovincar a AN irá melhorar a relação sinal-ruído (S / N), aceitando fotões que chegam a partir de um ângulo sólido maior. A fim de actuar como um dispositivo de epifluorescência, o feixe de luz é focado na fibra óptica com uma lente asférica ou um objectivo epifluorescência onde a NA da lente e o fósforo de fibra. Esta correspondência maximiza a transferência de energia para a excitação e para recolher de volta os fótons emitidos pelo fluoróforo. A fim de excitar os indicadores fluorescentes exógenos carregados no tecido, diferentes fontes de luz e modos de iluminação pode ser utilizada. Nossos estudos pioneiros utilizando a microscopia pulsada de campo local de fluorescência 3, 12 (PLFFM) empregue um laser low-cost de picossegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fonte de luz tem a enorme vantagem de excitar uma grande fracção de moléculas fluoróforo sob a área de iluminação, sem branqueamento substancialmente o corante devidoao pulso curto durações 12. Além disso, a utilização de impulsos ultracurtos permitiu a avaliação do tempo de vida de fluorescência do corante 12. O tempo de vida de fluorescência é uma propriedade que pode ser utilizada para quantificar a fracção de moléculas de corante ligado ao Ca2 +. Infelizmente, a tremulação temporal dos pulsos e das variações na amplitude de impulso-para-impulso de limitar a aplicação desta estratégia experimental para casos em que a alteração na fluorescência produzida pela ligação com o ligando corante é grande. Onda contínua (CW) lasers são usados geralmente como a principal fonte de iluminação em LFFM (Figura 1b, CLFFM). O feixe de laser pode continuamente iluminar o tecido ou pode ser modulado ferroelectrically. A modulação ferroeléctrica do feixe permite a geração de impulsos de luz microssegundos. Esta modulação pode ser controlada pelo hardware externo. Este procedimento não só reduz drasticamente tele jittering temporal dos pulsos de luz, mas também permite misturar vigas de diferentes comprimentos de onda. A mistura de vigas é feito por multiplexagem de diferentes raios laser. Como consequência, vários corantes possuindo diferentes propriedades espectrais pode ser animado para realizar medições de uma variedade de variáveis fisiológicas, por exemplo, Rhod-2 para o Ca2 + citosólico, MagFluo4 para administração intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS para potencial de membrana. Embora lasers apresentam várias vantagens como a fonte de luz em LFFM, outros tipos de fontes de luz podem ser utilizados, incluindo díodos emissores de luz (LEDs). Neste caso, a fonte de luz de excitação consistiu de um LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). Em LEDs, os fótons são espontaneamente emitida quando elétrons da banda de condução recombinar com furos na banda de valência. A diferença com lasers de estado sólido é que a emissão não é estimulada por outros fotões. Isto resulta num feixe coerente e não-uma emissão espectral mais amplo para os LEDs. Podem ser usados ​​diferentes tipos de LEDs de alta potência. Para as gravações PA usando Di-8-ANEPPS e para Ca 2+ transientes registados utilizando Fluo-4 ou MAG-Fluo-4, utilizou-se um diodo emissor de luz que tem um pico de emissão a 485 nm típico (azul) e uma meia largura de 20 nm (Figura 1D). Para Ca 2 + transientes gravados com Rhod-2, o LED teve um pico de emissão típica a 540 nm (verde) e uma meia largura de 35 nm (Figura 1d). LEDs emitem em um comprimento de onda de banda e, portanto, exigem filtros para reduzir sua emissão espectral. Além disso, a luz pulsada pode ser gerado a uma taxa de 1,6 kHz com duração de 20 uS. Os LEDs foram pulsadas com uma potência MOSFET de efeito de campo transistor rápido. gravações em simultâneo com diferentes indicadores pode ser realizada por tempo-de multiplexação os LEDs. Infelizmente, a luz emitida pelos LEDs é mais difícil de foco para uma fibra óptica em relação a um feixe de laser. Assim, a principal desvantagem de nósing LEDs é que os seus perfis de emissão têm deslocamentos angulares (± 15 °) em relação ao eixo principal, e uma óptica auxiliar deve ser usada para corrigir o problema. Em todas as configurações ópticas anteriormente descritos, a luz de excitação é reflectida com a ajuda de um espelho dicróico. O feixe é subsequentemente focada por uma lente asférica e uma objectiva de microscópio sobre uma fibra óptica multimodo que é posicionada sobre o tecido. Como em qualquer arranjo de epifluorescência, o espelho dicróico também serve para separar a excitação da luz emitida. O espectro de luz emitida viaja de volta através de um filtro de barreira para remover qualquer excitação reflectida. Por fim, a luz emitida é focada, com uma objectiva para um fotodetector (Figura 1). A transdução de luz a corrente eléctrica é feita pelos fotodíodos de avalanche de silício. Estes diodos têm uma resposta rápida e uma alta sensibilidade permitindo a detecção de pouca luz. ofotocorrente produzida pelos fotodiodos de avalanche pode ser amplificado em duas formas: um amplificador de transimpedância resistiva tendo um elemento de retorno (Figura 1e) ou por um integrador para converter a corrente em tensão (Figura 1F). Usando o primeiro método, a tensão de saída é proporcional à fotocorrente e a resistência de realimentação. Um exemplo típico de detecção resistiva de pulsos de laser de picossegundos é mostrado nas Figuras 2a, 2b e 2c. Painel 2a ilustra a saída do amplificador de transimpedância e o painel 2b mostra uma expansão no tempo do intervalo indicado com um asterisco (*). Um algoritmo de rastreamento de pico foi implementada para detectar o pico (vermelho) e a base (verde) para as respostas fluorescentes 12. A medição da fluorescência de base fornece informações tanto da corrente escura do fotodiodo avalanche e as interferências introduzido por lig ambienteht e acoplamento electromagnético. Uma representação de picos e bases é mostrado na Figura 2c. Esta figura ilustra a fluorescência emitida pelo corante (Rhod-2) ligado ao Ca2 + durante o ciclo cardíaco de um coração a bater periquito. No segundo método, a tensão de saída do integrador é uma função de realimentação de corrente e capacitiva (Figuras 2d, 2e, 2f). Figura 2f mostra dois ciclos de integração consecutivos: o primeiro sem iluminação exterior eo segundo com pulsos de luz aplicada a partir de um diodo emissor de luz pulsada. Uma descrição detalhada é apresentada nas Figuras 2G e 2H. Esta abordagem, apesar de mais laborioso, proporciona uma maior S / N devido à ausência de ruído térmico no condensador de realimentação. O instrumento inclui um estágio de tempo que gera todo o controle e multiplexação da luz de excitação e comanda a integração headstage e resperíodos et. Esta é normalmente realizada com um circuito de processamento de sinal digital que executa também uma diferenciação digital do sinal de saída integrado calculando uma regressão on-line dos dados. No caso de se utilizar um gabarito resistiva, qualquer de A / D placa de aquisição pode ser usado. Finalmente, a técnica LFFM é altamente versátil e pode ser adaptado para gravar a partir de mais do que uma região. Adicionando um divisor de feixe no caminho da luz nos permite dividir a luz em duas fibras ópticas. Cada fibra óptica pode então ser colocado em diferentes regiões de tecido para um, independentemente, excita e emissão ficha das sondas fluorescentes exógenos. Esta modificação permite-nos avaliar como anatômica diferenças regionais influenciam variáveis ​​fisiológicas. A Figura 3 mostra um separador de feixe a ser utilizado para separar a luz de excitação CW de tal modo que duas fibras ópticas são utilizados para medir transmural intracelular eléctrica ou [Ca 2+] níveis with minor-invasivo. transmurais sinais podem ser gravados pela colocação de uma fibra no endocárdio e a outra na camada epicárdio da parede ventricular. Portanto, a técnica LFFM tem a capacidade de medir o curso de tempo dos sinais celulares em diferentes regiões e pode ser utilizado para testar se as alterações regionais ocorrer em situações patológicas.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hyrdoxide</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m nylon membrane filter</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Manifold MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C/L peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Isostim stimulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Waveform generator</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing ID:1/32&quot; OD:3/32&quot; Wall 1/32&quot;</td><td>Component Supply</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing ID:3/32&quot; OD:5/32&quot; Wall 1/32&quot;</td><td>Component Supply</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adapter luer lock to 3-way valve</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>Tee adapters and plastic fittings</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Plastic clamp</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Acupunture needles</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>60 mL BD syringe with luer-lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Dichroic mirror 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Longpass colored glass filter 590 nm&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator for laser</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Multimode fiber optic 200 &amp;micro;m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LEDs blue</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LEDs green</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Cube beam splitter, non-polarizing</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36&quot; Length, Dovetail Optical Rail</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5&quot; Width, Dovetail Carrier</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0.75&quot; Travel, micrometer stage</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail optical rail 3&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Dovetail rail carrier 1&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche photodiode Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Objective holder XY Translator&amp;nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum breadboard 6&quot; x 6&quot;</td><td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus otpical table 4&#039; x 6&#039;</td><td>ThorLabs</td><td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel cap screws</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic&amp;nbsp; sheet</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy gel&amp;nbsp;</td><td>Walmart/Home Depot</td><td>2-part 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Precision glide needle</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Wire shelve posts 36&quot;</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Wire shelves</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Post and angle clamp</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringe for dye chamber</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Rubber stopper</td><td>Home Science Tools</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

No coração, os estudos de sinalização molecular são geralmente realizadas em miócitos isolados. No entanto, muitas situações patológicas, tais como isquemia e arritmias só pode ser totalmente entendido a todo o nível do órgão. Aqui, apresentamos a técnica de espectroscopia de fluorescência microscopia de campo local (LFFM) que permite a medição de sinais celulares no coração intacto. A técnica baseia-se numa combinação de um coração perfundido de Langendorff e fibras ópticas para gravar sinais fluorescentes. LFFM tem várias aplicações no campo da fisiologia cardiovascular para estudar o coração em condições normais e patológicas. Várias variáveis ​​cardíacas pode ser monitorizada utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estes incluem citosólica [Ca2 +], retículo sarcoplasmático intra-[Ca 2+] e potenciais de membrana. As sondas fluorescentes exógenos são animado e a fluorescência emitida detectada com três arranjos diferentes de técnica LFFM epifluorescências apresentada neste artigo. As diferenças central entre estas técnicas são o tipo de fonte de luz utilizada para excitação e sobre a forma como a luz de excitação é modulada. O LFFM pulsada (PLFFM) usa pulsos de luz laser, enquanto onda contínua LFFM (CLFFM) usa luz laser contínuo para a excitação. Finalmente, diodos emissores de luz (LEDs) foram usadas como uma fonte de luz terceiro. Este arranjo não coerente é chamado pulsada microscopia de fluorescência LED (PLEDFM).

AP e Ca 2 + transientes em endocárdio e epicárdio A fim de comparar os sinais do outro lado da parede ventricular, uma fibra óptica é posicionada no endocárdio e a outra no epicárdio. Comparando-se a morfologia de um AP gravado a partir do endocárdio com um a partir do epicárdio é a melhor maneira de avaliar a função transmural. A parede ventricular é altam...

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Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K visualizações.  University of California, Merced.  No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas. 

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Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biologia do Desenvolvimento

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Bioengenharia

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition (fibrosis) and cellular misalignment, can affect electrical conduction, introduce electromechanical dysfunctions and, eventually, lead to arrhythmia. Current predictive models of these functional alterations are based on non-integrated and low-resolution structural information. Placing this framework on a different order of magnitude is challenging due to the inefficacy of standard imaging methods in performing high-resolution imaging in massive tissue. In this work, we describe a methodological framework that allows imaging of whole mouse hearts with micrometric resolution. The achievement of this goal has required a technological effort where advances in tissue transformation and imaging methods have been combined. First, we describe an optimized CLARITY protocol capable of transforming an intact heart into a nanoporous, hydrogel-hybridized, lipid-free form that allows high transparency and deep staining. Then, a fluorescence light-sheet microscope able to rapidly acquire images of a mesoscopic field of view (mm-scale) with the micron-scale resolution is described. Following the mesoSPIM project, the conceived microscope allows the reconstruction of the whole mouse heart with micrometric resolution in a single tomographic scan. We believe that this methodological framework will allow clarifying the involvement of the cytoarchitecture disarray in the electrical dysfunctions and pave the way for a comprehensive model that considers both the functional and structural data, thus enabling a unified investigation of the structural causes that lead to electrical and mechanical alterations after the tissue remodeling.

We report a method for mesoscopic reconstruction of the whole mouse heart by combining new advancements in tissue transformation and staining with the development of an axially scanned light-sheet microscope.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

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