Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca 2+ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca 2+ intracelular sinais em muitos tipos de células 8-10. 1. Preparação de células <ol><li> Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor. </li><li> Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco de cultura de tecidos com 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Após separação, adicionar um volume igual de meio de cultura para inactivar a tripsina. </li><li> Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro e as células em pratos de semente de imagem de fundo de vidro, a uma densidade de 3-7 x 10 4 culas por prato. Selecione as células para experimentos com imagens quando chegar a 60% de confluência (2-3 dias). </li></ol> 2. Preparação de Soluções e Reagentes <ol><li> Prepare uma CA 2+ molecular contendo tampão HEPESsolução de sal de (Ca 2+ -HBSS) composto por (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, e 10 de glucose; pH = 7,4 à temperatura ambiente (TA) com NaOH. Prepare Ca 2+ -HBSS sem a adição de glicose e armazenar a 4 ° C; adicionar a solução de glicose imediatamente antes da utilização. </li><li> Solubiliza-se formas de membrana permeante do Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP 3 (200 uM), e EGTA (100 mM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) contendo 20% de Pluronic F-127. Alíquota estes reagentes em tubos Eppendorf e armazenamento, protegido da humidade e da luz, à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 3. Carregando Cells com uma membrana de permeant Cal-520, ci-IP 3 e EGTA <ol><li> Preparar o &quot;tampão de carga&quot; diluindo soluções de reserva de permeante da membrana Cal-520 e ci-IP 3 até uma concentração final de 5 uM e 1 uM, respectivamente, em Ca 2+ -HBSS. </li><li> Aspirar cumedia LTURE e lavar as células através da substituição de mídia com Ca 2+ -HBSS três vezes. </li><li> Remover Ca 2+ -HBSS e incubar as células em tampão de carga, durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover tampão de carregamento e enxaguar células, substituindo mídia com Ca 2+ -HBSS três vezes. <ol><li> Se desejado, nesta etapa, as células de carga com EGTA / AM por diluição da solução de reserva até uma concentração final de 5 uM em Ca 2+ -HBSS e, em seguida, as células incubar durante 30-60 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após esta incubação, lavar as células três vezes com Ca 2+ -HBSS antes de prosseguir para o passo 3.5. </li></ol></li><li> Incubar as células em Ca 2+ -HBSS durante 30 min para permitir a desesterificação de reagentes carregados. </li><li> Imediatamente antes de imagem, substitua Ca 2+ -HBSS com &quot;fresco&quot; Ca 2+ -HBSS, a fim de remover qualquer corante que pode ter vazado para o banho durante a incubação final. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Aquisição de Imagem <ol><li> Coloque uma pequena gota de óleo de imersão para o objetivo 100X APO TIRF (NA 1,49). </li><li> Montar o prato de imagem na fase do microscópio invertido e trazer as células em foco utilizando luz transmitida. É importante proteger o prato de imagem para impedir o movimento durante a gravação. </li><li> Iluminar as células com um laser de 488 nm, a fim de excitar Cal-520 e recolher a fluorescência emitida (λ&gt; 510 nm) usando uma câmara EMCCD alta velocidade. NOTA: O pacote de software que opera o microscópio permite ao utilizador para traduzir uma lente de focagem, permitindo que o feixe de laser a ser introduzido quer no bordo extremo da abertura traseira objectivo (por excitação TIRF) ou mais centralmente (para a excitação &quot;WF&quot;). </li><li> Usando o software EMCCD, reduzir o campo de imagem a partir da plena 512 x 512 pixels, a fim de coletar dados na resolução temporal necessário para capturar Ca 2+ eventos locais. NOTA: Por exemplo, quad centeraquisição de 256 x 256 pixels acelera a taxa de aquisição de 66 fps. Também é possível aumentar ainda mais a taxa de quadros da câmera EMCCD para 500 fps usando uma função Modo de recorte isolado. </li><li> Configure o software para gravar automaticamente alguns segundos de atividade basal, entregar um flash UV para as células e continuar a gravação para outra 10-30 seg. NOTA: Um lampejo de UV é entregue utilizando uma fonte de luz de arco de xénon introduzido através de um espelho dicróico UV reflectindo na porta traseira do microscópio. A duração e intensidade do lampejo de UV é ajustado empiricamente para evocar uma frequência desejada de Ca 2+ acontecimentos locais. </li><li> Salvar arquivos como imagem pilhas para análise off-line. </li></ol> 5. Automated Ca 2+ Análise Imagem NOTA: É possível visualizar, processar e analisar dados capturados usando muitos pacotes de software comerciais. No entanto, temos desenvolvido um algoritmo para automatizar rapidamente uma identificaçãod análise de Ca 2+ sinais locais. Uma descrição detalhada dos filtros espaciais e temporais utilizados neste algoritmo, a geração dos Af / F 0 e identificação / rotinas de análise pode ser encontrado em 11. Este algoritmo foi desenvolvido para rodar na plataforma Python software open-source, e pode ser obtido, juntamente com a amostra de dados experimentais e instruções detalhadas de usuários, pelo autor correspondente e-mails (ismith@uci.edu). <ol><li> Converta arquivos a serem importados para o algoritmo escrito sob medida para o formato de arquivo multi-plano .tiff. </li><li> Localize a pasta que contém o algoritmo de análise e dê um duplo clique no run.exe. </li><li> Selecione o arquivo .tiff a ser analisado. </li><li> Escolha os parâmetros de análise na caixa de diálogo aberta. Veja a Figura 2A para parâmetros padrão para os dados de exemplo. </li><li> Determinar o nível de preto para ser deslocada da pilha pela imagem seja movendo o cursor para uma parte do campo de visão que n fazot conter uma célula (ver Figura 2B) ou digitando manualmente um nível de preto usando o prompt de &#39;Black Nível Definir&#39;. </li><li> Observe quatro janelas na tela seguinte análise pelo software (Figura 2C-F). C é uma imagem monocromática de descansar fluorescência a partir de células que está sendo analisado. Quadrados brancos sobrepostos na imagem são os locais de evento, determinados como as posições centróide funções de Gauss bidimensionais que equipam os eventos. </li><li> Clique em cada local do evento ou pressione as teclas do cursor para navegar entre os eventos. Ao fazê-lo a subtracção do fundo, Gaussian alisou mudanças de relação de fluorescência (Af / F 0) em cada um desses sites de atualização na janela D. NOTA: Red destacou os acontecimentos estão determinados a se originam de que determinado site e não de &quot;sangrar-through &#39;de atividade localizada para locais adjacentes. O traço azul mais baixo indica que o sinal de fluorescência no local seleccionado excedeu a detecçãolimiar, enquanto que a linha preta identifica eventos provenientes desse local particular (que corresponde ao vermelho eventos realçado). </li><li> Clique sobre um evento vermelho destaque para actualizar a janela E que mostra a evolução temporal do evento, e a janela F, que mostra o perfil espacial do evento, calculados sobre o curso de tempo, em conjunto com o perfil espacial da função de Gauss ajustada. </li><li> Manualmente todos os eventos que foram identificados para que os artefatos podem ser rejeitada de análise. Excluir tais eventos clicando o botão direito no vermelho destacou os acontecimentos. NOTA: Em nossas mãos, fluxo de Ca2 + através dos canais individuais IP 3 R evoca sinais com Af / F 0 cerca de 0,11, então é provável que sejam falsos positivos quaisquer &#39;eventos&#39; detectados sensivelmente menores do que isso. </li><li> Exportar dados Ao selecionar &#39;Salvar em Excel &quot;ou exportação de dados em uma base por célula desenhando em torno da célula de interesse e selecionando&quot; Salvar CellR17 ;. NOTA: Os dados são salvos na mesma pasta que a pilha de imagem original. </li></ol>

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca 2+ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 + sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficien...

Os íons de cálcio (Ca 2+) ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica 1. Uma maneira através da qual Ca 2+ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca 2+ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca 2+] contração gatilho no tecido muscular liso 2 Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca 2+ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória 3 gene. Citosólico livre [Ca 2+] é mantida a ~ 100 nM em repouso, mas pode levantar-se rapidamente de várias micro-molar seguindo o influxo de Ca2 + no citosol através de canais de Ca2 + de iões -permeable localizados na membrana do plasma e pela a libertação de Ca2 + a partir de s intracelularestores. O nosso laboratório concentra-se o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3 R), que forma um canal de Ca2 + de libertação localizado na membrana do retículo endoplasmático (ER). Após a ligação de ambos IP3 e Ca 2+ para a activação citosólica sítios do receptor, o canal IP R 3 se abre para libertar o Ca2 + sequestrado dentro do lúmen do ER. A libertação de Ca2 + pode permanecer limitada espacialmente, para um pequeno grupo de IP 3 Rs para gerar um microdomínio citosólica locais de Ca2 + (Ca2 + sopro 4), ou, dependendo da proximidade de aglomerados vizinhos de IP 3 Rs, pode propagar ao longo de uma célula através do recrutamento de vários sites de sopro através de um processo de Ca2 + induzida por Ca2 + -release (CICR) 5,6. A introdução de pequenas molécula fluorescente de Ca 2+ corantes indicadores desenvolvido por Roger Tsien 7, juntamente com o avançado imagi microscopiatécnicas Ng, facilitou muito a nossa compreensão do Ca 2+ sinalização. Recentes avanços em câmeras usadas para microscopia agora permitir transitórias de imagem locais Ca 2+ eventos como puffs com inédita resolução espacial e temporal. Atualmente câmeras EMCCD disponíveis permitem imagem com 128 x 128 pixels em&gt; 500 quadros seg -1 (fps) e da nova geração de complementar semicondutor de óxido metálico (CMOS) câmeras proporcionar maior pixels de resolução e velocidade ainda mais rápido à custa de um pouco maior níveis de ruído. Em conjunto com a microscopia de reflexão interna total (TIRF) agora é possível imagem única Ca 2+ eventos canal 8,9. Esta abordagem permite que a imagem de centenas de canais / eventos simultaneamente, ao gerar grandes conjuntos de dados (cerca de 1 GB por min) que tornam o processamento manual, identificação visual e análise impraticável e colocar um ônus sobre o desenvolvimento de algoritmos automáticos. 2+ sinais locais em células de mamíferos intactos usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Demonstramos ainda um algoritmo desenvolvido no ambiente Python open-source que automatiza a identificação e análise de Ca2 + eventos locais fotografados por ambos TIRF e microscopia de campo largo epi-fluorescência convencional (WF). Embora estas abordagens descrevemos no contexto da PI 3 -generated Ca 2+ sinais, eles são facilmente recuperáveis ​​para estudar alterações locais na citosólica [Ca 2+] emanados a partir de uma variedade de canais de Ca2 + de iões -permeable localizados quer na superfície membrana ou organelas intracelulares 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Citossólica Ca 2+ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca 2+ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca 2+ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca 2+ microdomínios (Ca 2+ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de 2+ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros&gt; 500 s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca 2+ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local 3 mediada por Ca 2+ sinais em células de mamíferos intactos carregados com Ca2 + indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca 2+ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca 2+ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.

Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP 3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP 3 suscitou transientes de Ca2 + puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP <s...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K visualizações.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

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Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Neurociência

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Imagem de cálcio de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autor em destaque: Investigando a interrupção viral da sinalização epitelial intestinal - insights de pesquisa e direções futuras 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

Visualizando mudanças no Circuito Neuron-Glia com a Técnica de Imagem de Cálcio

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagem de alta resolução para detecção de microdomínios de Ca2+ em células T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a ativação inicial da resposta imune adaptativa para intervenção terapêutica

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Imagem local Ca

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Dissecação de locais de Ca^{2 +} sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca^{2 +}

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Visualizando mudanças no Circuito Neuron-Glia com a Técnica de Imagem de Cálcio

Imagem de microdomínios iniciais de Ca²⁺ em células T primárias