Biz sunulan çalışmanın kritik tartışma için Dr. Alicia Mattiazzi teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe yoluyla (R01 HL-084487) ALE için desteklenmiştir.

Bu protokol ve tüm fareler taşıma UC Merced Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (No 2008-201) tarafından onaylandı. parakeets yapılan deneyler Bilimsel Araştırma Venezüella Enstitüsü (Ivic) bilimsel komisyon tarafından kurulan hayvan kullanımı için genel politikalarına göre 1999 yılında yapılmıştır. 1. Langendorff Kurma Hazırlık <ol><li> 140 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0.33 HPO 4, 10 glukoz, 10 HEPES 2 Na mM aşağıdaki çözünen konsantrasyonlarını ihtiva eden Tyrode çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.4&#39;e Tyrode çözeltisi pH&#39;sini ayarlamak ve 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre solüsyonu. </li><li> 60 mL&#39;lik şırıngalara Tyrode çözeltisi ve 11, 12 Şekil 4&#39;te gösterilen kurulumu yatay Langendorff her boru yerleştirin. tüm hava kabarcıklarını yok etmek için emin olun. </li><li><strong&gt; Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, bir batırılmış plastik &quot;hava taş&quot; kullanılarak% 100 O2 ile dengelenmesi Tyrode çözeltisi. <ol><li> O 2 tanka plastik boru bağlayın. </li><li> 60 ml şırınga içinde Tyrode çözeltisi içine 5 &quot;tüp düşürmek için plastik Tee adaptörü ekleyin. </li><li> Tyrode çözeltisi içine 2 fokurdayacaktır dışarı O yüzden 5 &quot;borusunun ucuna plastik bir hava taşı takın. </li></ol></li><li> bir kanül olarak kullanılan bir iğne etrafında bir emilemeyen cerrahi sütür yerleştirin. İğne farklı çözümler retro-perfüzyon sağlar, manifold (bakınız Şekil 4) ile birleştirilir. Son olarak, kalbin aort iğne içine kanüle edilecektir. </li></ol> 2. Hayvan Hazırlama ve kalp Diseksiyon <ol><li> heparin ile fare tartılır ve enjekte (ex. Fare ağırlığı 20 g, 20 adet veya 200 mL enjekte), boyunları kırılarak ötenazi önce 15 dakika. Uyutmak parakeets göre to hayvan kullanımı için IACUC protokolü kılavuzları ve daha sonra servikal dislokasyon ile devam edin. NOT: 8 haftalık fareler ya da 20 gr parakeets kullanın. </li><li> Euthanization sonra göğüs boşluğunda kalp kaldırmak. Fareler için tarif edildiği gibi aynı şekilde parakeet kalpleri ekstrakte edin. <ol><li> etanol ile fare göğüs temizleyin. </li><li> Diseksiyon makas kullanarak, alt karın bölgesinde bir kesi yapmak ve daha sonra boyun doğru tarafı yukarı kesti. </li><li> kesim doku geri çekin ve aşağı pin. </li><li> diyaframı kesti. kalbi zarar görmemesi için diyaframın keserken dikkatli olun. </li><li> akciğerleri ve çevresindeki doku çıkarın. </li><li> sıkarak olmadan kalbini kepçe için cımbız kullanın. mümkün olduğunca uzun süre aorta kesin. </li></ol></li><li> yaklaşık 1 mL Tyrode çözeltisi ile küçük bir tartın teknede kalbi taşıyın. </li><li> olmayan bir emilebilir cerrahi sütür kullanarak, üzerinden yatay Langendorff aparat üzerine aorta kravatiğne. İki ince cımbız yardımıyla kalp aort bağlayın. Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri bulunan vanayı açarak retro perfüzyon başlayın. </li><li> Kalp 10 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. kan ve boya yüklemeden önce kalbi çevreleyen yağ dokusu temizlemek için bu kez kullanın. cımbız ile kalbin tabanına yakın yağlı doku çekin ve küçük diseksiyon makas kullanarak kesti. Diseksiyon mikroskobu görünümü altında bu yaptığınızdan emin olun. </li></ol> 3. Sitosolik Ca 2 + Ölçümler: Boya Rhod-2AM Hazırlama <ol><li> boya, 50 ug içeren boya üreticisi tarafından sağlanan özel paket plastik bir şişeye DMSO içinde% 20 Pluronic 20 uL (iyonik olmayan bir yüzey aktif madde) ekleyin. </li><li> kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> iyonik olmayan yüzey aktif madde ve berrak bir cam şişe içinde özel bir paket plastik şişeden boya ile karışık DMSO aktarın. Tyrode Solu 1 ml ekleyinşeffaf cam şişeye yon. </li><li> banyo sonikatör 15-20 dakika süreyle sonikasyon. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca peristaltik pompalar kullanılarak boya serpmek. <ol><li> Boya odasında boya yerleştirin. </li><li> manifolduna bağlı diğer boru hatları sıkıştırmak için mekanik bir kelepçe kullanın. kelepçe manifoldu üzerine yerleştirilir. Bu 60 ml şırınga bağlı boru içine herhangi bir akışı önlemek olacaktır. </li><li> boya dolaşan başlamak için perfüzyon peristaltik pompa açın. Hemen 60 ml şırınga altında 3 yollu vanasını kapatın. </li><li> kalbine perfüze edilmiş boya sirküle kalp aşağıdaki emme peristaltik pompaya bağlı olan bir küçük boru yerleştirin. </li></ol></li></ol> 4. İçi SR Ca 2 + Ölçümler: Boya Mag-Fluo4AM Hazırlama <ol><li> Rhod-2AM ile aynı şekilde Mag-Fluo4AM hazırlayın. adım adım talimatlar için bölüm 3&#39;e bakınız. </li><li> afteboya yükleme r, retro perfüzyon başlamak için Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri bulunan vanayı açın. manifoldu üzerindeki kelepçeyi çıkarmak için emin olun. </li><li> Yatay odasına Tyrode çözüm ekleyin ve 37 ° C&#39;ye kadar ısıtın. </li><li> 45 dakika Tyrode çözeltisi ile retro-perfuse sitozolik boya kaldırmak için. </li></ol> 5. Membran potansiyeli ölçümü: Boya Di-8-ANEPPS Hazırlama <ol><li> boya 5 mg içeren boya şişeye% 99 5 ml etanol ekleyin. </li><li> Kısım Bir tekrarlayıcı pipet kullanarak 500 ayrı 1 ml plastik şişeleri içine 10 uL. </li><li> -20 ° C de hızlı vakum ve mağaza kurutun. </li><li> kurutulmuş boya 10 mikrogram ile plastik şişeye 20% 20 uL pluronik DMSO içinde ekleyin. </li><li> kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> Plastik şişeden taksimatlı bir silindir (10 mL) Pluronic ve boya ile DMSO içeren karışımı aktarın. nihai VO Tyrode çözeltisi ekleyin5 mL lume. </li><li> banyo sonikatör 20-25 dakika süreyle sonikasyon. </li><li> peristaltik pompalar kullanılarak 30 dakika boyunca kalp içine serpmek. Bölüm 3.5 kademeli talimatlarına bakın. </li></ol> 6. Epikardiyal Sinyalleri Kayıt <ol><li> boya yükledikten sonra, manifold üstünde kelepçe kaldırarak Tyrode çözeltisi ile kalbi retro serpmek. Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri olarak bulunan vanasını açın. 10 dakika boyunca retro perfuse Tyrode çözüm kalbi stabilize etmek. </li><li> Tyrode çözeltisi ile yatay oda doldurun ve 37 ° C banyo sıcaklığının getirmek için Peltier ünitesine açın. </li><li> Kalbin yüzeyinde fiber optik yerleştirin. <ol><li> 2 ml pipet içindeki fiber optik yerleştirin ve sonra bir micromanipulator pipet takın. </li><li> Biraz LV yüzeyine karşı fiber optik basın Mikromanipülatör kullanın. </li></ol></li><li> Dışarıdan hea adımlamakBir dalga üreteci tarafından kontrol edilen bir uyarıcı ile rt. <ol><li> 1 ms genişliğinde bir kare darbe sağlamak için dalga jeneratörü Program. </li><li> dışarıdan Senkronize edilecek stimülatörü ayarlayın ve dalga jeneratörü harici girişi bağlayın. </li><li> uyarıcısı her çıkışına, sonunda lehimlenmiş bir akupunktur iğnesi ile bir tel bağlayın. </li><li> yaklaşık olarak 3 mm birbirinden kalbin üst hem de akupunktur iğneleri yerleştirin. </li><li> iğneler dokuda yerleştirilir sonra, elektrik çarpmasını önlemek için stimülatörü çıkışını açmak. </li></ol></li><li> satın alma yazılımında, 10 kHz satın alma frekansını ayarlayın. </li></ol> 7. Endokardial Sinyalleri Kayıt <ol><li> boya yükledikten sonra kalbi stabilize etmek için 6.1 ve 6.2 adıma bakın. </li><li> Fiber optik boyutu hakkında keskin bir 23Ga noktası kullanarak, septum yakın LV kalbin yüzeyinde küçük bir delik yapmak. </li> &lt;li&gt; mikromanipülatör kullanarak endokarda ilk fiber optik konumlandırılmasına yardımcı olmak için bir intravitreal cerrahi sklerotomi adaptörünü yerleştirin. </li><li> Dışarıdan kalbi adımlamak. 6.4 adıma bakın. </li><li> satın alma yazılımında, 10 kHz satın alma frekansını ayarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells.">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+intracellular+Ca2++transients+in+beating+rat+hearts.">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li><li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials.">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li><li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp.">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+L-type+Ca(2+)+current+and+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes.">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li><li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K++currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes.">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Ca2++depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion.">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2++after+perfusion+arrest+in+isolated,+perfused+mouse+heart.">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca(2+)+signaling+in+intact+mouse+heart.">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li><li>Mej&#237;a-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy:+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart.">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pfl&#252;gers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li><li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials.">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li><li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+shortens+the+refractoriness+of+Ca2++release+and+reduces+rate-dependent+Ca2+-alternans+in+intact+mouse+hearts.">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Sparks+and+Ca2++waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2++overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts.">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li><li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium:+evidence+for+a+role+of+Ito.">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li><li>Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+bases+for+electrophysiological+distinctions+among+epicardial,+midmyocardial,+and+endocardial+myocytes+from+the+free+wall+of+the+canine+left+ventricle.">Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle.</a> Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).</li><li>Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium.">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li><li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial,+Midmyocardial,+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle.">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li><li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall.">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li><li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle.">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+optical+imaging:+looking+inside+the+heart.">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li><li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+optocardiography.">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li><li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts.">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, kardiyak miyositlere ex vivo fonksiyonu değerlendirmek için yerel alan floresan tekniklerini anlatan merkezli. Bir bağlanmış bir ortamda, bu hücrelerin bir çalışma, sadece daha fizyolojik değil, aynı zamanda, organ düzeyinde patolojileri değerlendirmek için son derece uygundur. Eksitasyon-kasılma kaplin (ECC) altında yatan hücresel olaylar hücre içi Ca 2 + dinamiklerini izlemek moleküler probların kullanımı ile tüm organ düzeyinde (Rhod 2 sitozolik Ca 2+,</su...

Kalp damar sisteminin merkezi organıdır. Kalbin kasılma intrasellüler artışa [Ca2 +] tarafından başlatılır. Hücre içi Ca 2 + sürümde elektrik uyarılabilmenin ve değişimler arasındaki ilişki tarihsel enzimatik ayrışmış hücreleri 1, 2 olarak ele alınmıştır. Bununla birlikte, kalp hücreleri, elektriksel olarak, metabolik ve mekanik, 4 3 bağlanmış. Izole zaman miyositler sadece fiziksel Kuplajsız değildir, fakat farklı katmanlardan miyositler ayrışma 5 boyunca karıştırılır. Bundan başka, voltaj kenetleme şartları altında izole edilmiş hücrelerin çalışma ortaya çıkan büyük bir avantaj, 6, 7, 8, bir elektrik sinsityum ALWA olarak kalbin iç doğasına rağmenys dokusunda 3 bulunanların hücreleri ayrışmış nasıl işlevsel olarak farklı sorusunu oluşturmaktadır. Bu yazıda, sağlam kalbinde yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) tekniklerinin kullanımı ile kardiyak fizyoloji bilgisine elde gelişmeleri açıklar. LFFM gibi sitozolik Ca 2+, içi sarkoplazmik retikulum (SR) Ca 2+ ve membran potansiyeli gibi çoklu fizyolojik değişkenleri ölçmek için floresan göstergeler kullanır. Bu ölçümler ventrikül basıncı 9, 10, Elektrokardiyogram 9, elektrik aksiyon potansiyeli (AP), iyon akımı kayıtları ve kafesli bileşikler 4 flaş fotoliz 11 ile aynı anda ve bağlantılı olarak elde edilebilir. Buna ek olarak, bu ölçümler yakınında yüksek frekanslarda sağlam kalp ilerleme hızı ile elde edilebilirFizyolojik oranlarda r. Çeşitli makaleler rağmen 9, 11, 12, 13, 14 LFFM teknikleri kullanarak grubumuz tarafından yayınlanmıştır, bu teknikle ilgili teknik karmaşıklıklar karinesi kalp ve diğer organlarda ex vivo fizyolojik olayları okuyan büyük miktarlarda kullanımını engellemiştir. LFFM tekniği (Şekil 1) doku ile temas halinde olan bir çoklu optik fiber kullanılarak elde epifloresans ölçümlerine dayanır. herhangi bir temas floresan görüntüleme tekniği gibi, optik çözünürlük çapı ve lif sayısal açıklık (NA) bağlıdır. lif A NA yüksek ve daha küçük çaplı ölçümlerinin uzaysal çözünürlüğü artacaktır. NAS ve elyaf çapları sırasıyla 0.22 mm 0.66 ve um 1 ila 50 arasında olabilir. İçindeNA katlama bir büyük katı açı gelen fotonları kabul ederek gürültü oranı (S / N) sinyali artıracaktır. Epifloresans cihazı olarak hareket etmek amacıyla, ışık huzmesi bir asferik lens veya Epifloresans amacı ile optik fiber içine odaklanmış nerede lens NA ve fiber maç. Bu eşleştirme uyarma ve fluorofor tarafından yayılan fotonlar geri toplamak için enerji transferini maksimuma çıkarır. dokuda yüklenen eksojen floresan göstergeleri heyecanlandırmak için, farklı ışık kaynakları ve aydınlatma modları kullanılabilir. Darbeli yerel alan floresan mikroskobu 3, 12 (PLFFM) kullanarak ilk çalışmalarda düşük maliyetli pikosaniye lazer (Şekil 1a, PLFFM) kullanılmıştır. ışık kaynağının Bu tip büyük ölçüde nedeniyle boya kasar olmadan aydınlatma alanı altında florofor moleküllerinin heyecan verici büyük bir fraksiyonun büyük bir avantaja sahiptirkısa nabız 12 süreleri. Buna ek olarak, ultra bakliyat kullanımı boya 12 floresan ömrü değerlendirmesini sağladı. Floresans ömrü Ca2 + bağlanmış boya molekülleri kısmını ölçmek için kullanılabilecek bir özelliktir. Ne yazık ki, Darbeli darbe genliği bakliyat ve varyasyon zamana jittering boyasına ligand tarafından üretilen parlaklıkta meydana gelen değişiklikler büyük olduğu durumlarda, bu deney strateji uygulanmasını sınırlar. Sürekli dalga (CW) lazeri genellikle LFFM (Şekil 1b, CLFFM) içindeki ana aydınlatma kaynağı olarak kullanılır. Lazer ışını sürekli olarak doku aydınlatmak veya ferroelektrik modüle edilebilir. kirişin ferroelektrik modülasyon ışığın mikrosaniye bakliyat üretimi sağlar. Bu modülasyon dış donanım ile kontrol edilebilir. Bu prosedür sadece dramatik t azaltırO ışık darbeleri zamansal jittering değil, aynı zamanda farklı dalga boylarında ışınları karıştırma sağlar. Kirişlerin karıştırma farklı lazerler çoklayıcı ışınları ile yapılır. Bunun bir sonucu olarak, farklı bir spektral özelliklere sahip olan birden fazla boya, örneğin, fizyolojik değişikliklerin çeşitli ölçümler yapmak için büyük bir heyecan olabilir Rhod-2 sitosolik Ca2 + için MagFluo4-içi SR Ca2 + ve di-8-ANEPPS için için membran potansiyeli. LFFM ışık kaynağı olarak lazer mevcut çeşitli avantajları olmasına rağmen, ışık kaynaklarının başka tür ışık yayan diyot (LED) gibi kullanılabilir. Bu durumda, uyarım ışığı kaynağı, bir InGaN LED (Şekil 1c, PLEDFM) oluşuyordu. iletim bandı elektronlar değerlik bandında deliklerle recombine zaman LED&#39;ler, fotonlar kendiliğinden yayılır. katı hal lazerleri ile farkı emisyon diğer fotonlar tarafından uyarılan olmadığıdır. Bu eşevrelı olmayan bir kiriş meydana getirir veLED&#39;ler için daha geniş bir spektral emisyon. yüksek güç LED Farklı türleri kullanılabilir. Di-8-ANEPPS Ca kullanılarak AP kayıtları için 2 + geçici Fluo-4 veya MAG-Fluo-4, 485 nm&#39;de (mavi) ve 20 nm&#39;lik bir yarı genişliği tipik tepe emisyon olan bir LED kullanılan kullanılarak kaydedildi (Şekil 1d). Rhod-2 ile kaydedilmiş Ca 2 + transientler için, LED 540 nm (yeşil) ve 35 nm (Şekil 1d) yarım genişlikte tipik bir tepe emisyonu vardı. LED&#39;ler bir grup dalga boyunda yayar ve bu nedenle onların spektral emisyon daraltmak için filtreleri gerektirir. Buna ek olarak, darbeli ışığı 20 ms&#39;den süresi 1.6 kHz&#39;lik bir hızda oluşturulabilir. LEDLER hızlı bir güç MOSFET alan etkili transistör ile pulse edildi. Farklı göstergeler ile eş zamanlı olarak kayıtlar zaman çoklama LED&#39;ler tarafından yapılabilir. Ne yazık ki, LED&#39;ler tarafından yayılan ışık, bir lazer ışınına göre fiber optik üzerine odaklanmak daha zordur. Böylece, bize büyük dezavantajıLED&#39;ler ing emisyon profilleri, ana eksenden açısal yer değiştirmelere (± 15 °), ve bir yardımcı optik düzeltmek için kullanılması gerekir olmasıdır. Daha önce tarif edilmiş olan optik konfigürasyonlarda tümünde, uyarım ışık dikroik ayna yardımıyla yansıtılır. kiriş sonra doku üzerinde konumlandırılmış bir modlu fiber optik üzerine bir asferik lens ve mikroskop objektif ile odaklanmıştır. Herhangi bir epifluorışıma düzenlemede olduğu gibi, dikroik ayna da yayılan ışık uyarma ayırmak için hizmet eder. yayılan ışık spektrumu herhangi yansıyan uyarma çıkarmak için geri bariyer filtresi üzerinden geçecek. Son olarak, yayılan ışık, bir fotodetektör (Şekil 1) üzerinde bir hedefi ile odaklanmıştır. elektrik akımına ışık iletim silikon çığ fotodiyotları ile gerçekleştirilir. Bu diyotlar hızlı tepki ve düşük ışık algılama sağlayan yüksek duyarlılığa sahip.çığ fotodiyotlar tarafından üretilen fotoakım iki şekilde amplifiye edilebilir: a transempedans kuvvetlendirici bir voltaj (Şekil 1 f) içine mevcut dönüştürmek için bir direnç geribesleme elemanı (Şekil 1 E) sahip olan ya da entegratör tarafından. İlk yaklaşımı kullanarak, çıkış voltajı fotoakım ve geri bildirim direnci ile doğru orantılıdır. Pikosaniye lazer darbelerinin direnç tespit tipik bir örneği Şekil 2a, 2b ve 2c&#39;de gösterilmiştir. Paneli 2a transempedans yükselticinin çıkışı göstermektedir ve panel 2b bir yıldız işareti (*) ile belirtilen aralığın bir zaman genişleme gösterir. Bir tepe izleme algoritması floresan yanıtları 12 zirve (kırmızı) ve taban (yeşil) saptamak amacıyla yapılmıştır. Baz floresan ölçümü ortam lig getirdiği çığ fotodiyot karanlık akımı ve etkileşimler hem bilgi sağlarht ve elektromanyetik kavrama. Tepe ve bazların bir temsili Şekil 2c&#39;de gösterilmektedir. Bu rakam, bir dayak parakeet kalbin kalp döngüsü sırasında Ca2 + bağlı boya (Rhod-2) yaydığı floresan göstermektedir. İkinci yöntemde, birleştiricinin çıkışı gerilim akım ve kapasitif geri besleme bir fonksiyonudur (Şekil 2D, 2E ve 2F). Herhangi bir dış aydınlatma ilk ve darbeli LED&#39;den uygulamalı ışık darbeleri ile ikinci: Şekil 2f iki ardışık entegrasyon döngüleri gösterir. Ayrıntılı bir açıklama Şekiller 2G ve 2 içinde sunulmaktadır. Bu yaklaşım, daha zahmetli olmasına rağmen nedeniyle geri kapasitör termal gürültü olmaması daha büyük bir S / N sağlar. enstrüman ikaz ışığı tüm kontrol ve çoğullama üretir ve headstage entegrasyon ve res komutları bir zamanlama aşamasını kapsamaktadıret dönemleri. Bu, genellikle aynı zamanda bir veri bir on-line regresyon hesaplama tarafından entegre çıkış sinyalinin sayısal farklılaşmasını gerçekleştiren bir dijital sinyal işleme devresi ile gerçekleştirilir. bir dirençli geri kullanılması durumunda, bir A / D toplama kartı kullanılabilir. Son olarak, LFFM tekniği son derece çok yönlüdür ve birden fazla bölgeye kayıt için adapte edilebilir. ışık yolu bir ışın ayırıcı ekleme bize iki fiber optik içine ışık split sağlar. Her optik fiber tel daha sonra eksojen floresan probları bir, bağımsız bir şekilde, tahrik doku ve kayıt emisyon farklı bölgelere yerleştirilebilir. Bu değişiklik fizyolojik değişkenleri nasıl etkilediğini anatomik bölgesel farklılıklar değerlendirmek için bize izin verir. Şekil 3, bu iki fiber optik transmural elektrikli veya hücre içi ölçmek için kullanılan CW uyarma ışık bölmek üzere kullanıldığı bir ışın ayırıcı göstermektedir [Ca2 +] seviyeleri with minör-invaziv. Transmural sinyaller tek endokardiyumda lif ve ventriküler duvar epicardium katmandaki diğer koyarak kaydedilebilir. Bu nedenle, LFFM tekniği farklı bölgelerde hücresel sinyallerin zaman sürecini ölçmek için yeteneği ve bölgesel değişiklikler patolojik durumlar altında meydana test etmek için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

kalbinde, moleküler sinyal çalışmaları genellikle izole miyositlerde yapılmaktadır. Ancak, bu tür iskemi ve aritmi gibi birçok patolojik durum sadece tamamen tüm organ düzeyinde anlaşılabilir. Burada, bozulmamış kalbinde hücresel sinyallerin ölçümünü sağlar yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) spektroskopik tekniğini sunuyoruz. teknik, bir Langendorff perfüze kalp ve flüoresan sinyal kaydetmek için bir optik elyafın bir kombinasyonuna dayanmaktadır. LFFM normal ve patolojik şartlar altında kalbi incelemek için kardiyovasküler fizyoloji alanında çeşitli uygulamalar vardır. Birden fazla kalp değişkenler farklı floresan göstergeler kullanılarak izlenebilir. Bunlar sitozolik [Ca2 +], intra-sarkoplazmik retikulum [Ca2 +] ve membran potansiyelleri bulunmaktadır. eksojen floresan sondalar heyecanlı ve yayılan floresan LFFM Epifloresans tekniğinin üç farklı düzenlemeler ile tespitBu çalışmada sunulan s. Bu teknikler arasında merkezi farklar uyarma ve ikaz ışığı modüle edilir yolda kullanılan ışık kaynağının türü vardır. sürekli dalga LFFM (CLFFM) uyarma sürekli lazer ışığı kullanır iken darbeli LFFM (PLFFM) lazer ışık darbeleri kullanır. Son olarak, ışık yayan diyotlar (LED), bir üçüncü ışık kaynağı olarak kullanıldı. Bu sigara, tutarlı bir düzenleme darbeli LED floresan mikroskobu (PLEDFM) olarak adlandırılır.

Endokardiyuma ve epikarda AP ve Ca 2 + transientler ventriküler duvar boyunca sinyalleri karşılaştırmak için, bir fiber optik endokarda konumlandırılmış ve endokard diğer. epicardium gelen biriyle endokarda kaydedilen bir AP morfolojisi karşılaştırılması transmural fonksiyonunu değerlendirmek için en iyi yoldur. vent...

Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Görüntüleme.  University of California, Merced.  kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir. 

Video: Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Gelişim Biyolojisi

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biyoloji

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biyomühendislik

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition (fibrosis) and cellular misalignment, can affect electrical conduction, introduce electromechanical dysfunctions and, eventually, lead to arrhythmia. Current predictive models of these functional alterations are based on non-integrated and low-resolution structural information. Placing this framework on a different order of magnitude is challenging due to the inefficacy of standard imaging methods in performing high-resolution imaging in massive tissue. In this work, we describe a methodological framework that allows imaging of whole mouse hearts with micrometric resolution. The achievement of this goal has required a technological effort where advances in tissue transformation and imaging methods have been combined. First, we describe an optimized CLARITY protocol capable of transforming an intact heart into a nanoporous, hydrogel-hybridized, lipid-free form that allows high transparency and deep staining. Then, a fluorescence light-sheet microscope able to rapidly acquire images of a mesoscopic field of view (mm-scale) with the micron-scale resolution is described. Following the mesoSPIM project, the conceived microscope allows the reconstruction of the whole mouse heart with micrometric resolution in a single tomographic scan. We believe that this methodological framework will allow clarifying the involvement of the cytoarchitecture disarray in the electrical dysfunctions and pave the way for a comprehensive model that considers both the functional and structural data, thus enabling a unified investigation of the structural causes that lead to electrical and mechanical alterations after the tissue remodeling.

We report a method for mesoscopic reconstruction of the whole mouse heart by combining new advancements in tissue transformation and staining with the development of an axially scanned light-sheet microscope.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler