We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC), em Albany Medical College e realizada de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparações Solução NOTA: O Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato foram adquiridos comercialmente cTnT-Cre 18 foi um presente do Dr. Jiao na Universidade do Alabama NFATc1-Cre.. foi um presente do Dr. Bin Zhou no Albert Einstein College of Medicine 19. Os ratinhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono em uma câmara fechada durante pelo menos 60 segundos, seguido por meios físicos de verificação morte por toracotomia bilateral, decapitação ou deslocamento cervical. <ol><li> Prepare Tamoxifeno. Dissolve-se 10 mg de Tamoxifeno em 10 ml de semente de girassol oieu. Uma vez que esteja completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS). Dissolve-se Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20129 g) em 1 L de água destilada e ajustar o pH para 7,4. </li><li> Prepare PBST: 0,1% de Tween-20 em PBS solução por dissolução de 100 ul de Tween-20 em 100 ml de PBS. </li><li> Preparar tampão de bloqueio. Adicione 3% de albumina de soro bovino a solução de bloqueio (BSA) por dissolução de 3 g de BSA em 100 mL de PBST contendo 0,2% de Tween-20. </li><li> Prepare CUBIC-1 (reagente 1). Misturar 25% em peso de ureia, 25% em peso de N, N, N &#39;, N&#39;-tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 15% em peso de Triton X-100 em dH2O </li><li> Prepare CUBIC-2 (reagente 2). Misturar 50% em peso de sacarose, 25% em peso de ureia, 10% em peso de 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol e 0,1% (v / v) de Triton X-100 em dH2O </li><li> Prepare Sca le A2: 4 M de ureia, 10% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH 2 O. Ajustar o pH para 7,7. </li><li> Prepare Sca le B4: ureia 8M e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O Ajustar o pH para 8,7. </li><li> Prepare Sca le 70: 4 M ureia, 70% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O </li></ol> 2. O tamoxifeno indução, isolamento de embriões e Fixação <ol><li> Tamoxifeno Indução e isolamento de embriões <ol><li> Usando um protocolo tubo de alimentação curva aprovado (ACUP 13-12007), sonda as fêmeas ratos R26Cre ERT2 Confetti (conectado por camundongos machos R26Cre ERT2) com 10 ug / g de Tamoxifen em embrionária dia de desenvolvimento E7.75 33. No dia embrionário 9,5 (E9.5) ou E10.5, eutanásia os ratos do sexo feminino com CO 2 e deslocamento cervical. </li><li> Após a verificação da morte do rato (ver secção 1 Nota), abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura e dissecar o corno uterino, remover as camadas de tubo uterino com a ajuda de tesouras e pinças, e relocar os embriões do 23,24 tuba uterina. <ol><li> Transferir os embriões para uma placa de Petri contendo PBS (pH 7,4). Sob o microscópio de dissecação, remover as camadas não-embrionárias (córion, saco vitelino e âmnio) com a ajuda da pinça. </li></ol></li><li> Com uma pinça e tesouras, recolher as amostras de mulheres do rato e da cauda do embrião para genotipagem conforme relatado anteriormente 22. Usando uma pipeta de plástico, transferir cada embrião para um poço de uma placa de 48 contendo 1 ml de PBS 1x. </li><li> Sob um microscópio de fluorescência, identificar os embriões / RFP / PCP positivas GFP por meio de um microscópio invertido com uma câmara. Descascar o pericárdio, usando uma pinça e gire o coração / embrião com a ajuda de pinças curvas para determinar o número de clones fluorescentes em ambos os lados do coração com os filtros GFP / RFP / CFP. Sem cortes são necessários. </li></ol></li><li> Depois de identificar GFP / RFP / embriões PCP positivos, lavar rapidamente os embriões duas vezes (2 min cada) com 1x PBS em the 48 bem-placa num agitador de placas à temperatura ambiente (TA). Isto irá remover o excesso de sangue. </li><li> Corrigir o coração do embrião / embrionário usando 4% de paraformaldeído (PFA) a TA. O tempo de fixação depende da idade e tamanho do tecido embrionário. Para corrigir o embrião E9.5 durante 2 h à TA. Os embriões estágio embrionário final exigem mais tempo de fixação, que pode até mesmo ser prolongada até 24 horas para o coração pós-natal. CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, evitar o contacto com a pele, olhos e mucosas. </li><li> Após a fixação, lavar o embrião / coração no poço de placa 48 por duas vezes (10 minutos cada) com PBS 1x num agitador de placas à TA. Isto remove o excesso de PFA a partir do embrião / coração. Os embriões são então processadas para toda coloração montagem e desobstrução dos tecidos. </li></ol> 3. Whole Mount Coloração NOTA: Depois de PFA fixação do embrião / coração é submetido a toda a coloração de montagem como segue. <ol><li> Permeabilizar o embrião / coração em um bem-placa de 48 usando 1 ml de PBST 0,1% durante 2 horas num agitador de placas à TA. </li><li> Seguindo permeabilização, mergulhe o embrião / coração em 1 ml de tampão de bloqueio, por 2 horas ou durante a noite num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Mergulha-se o embrião / coração ao endotelial PECAM anticorpo específico da célula (CD31), diluído (1: 100) em 0,3 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Lave o embrião / coração utilizando PBST 5 vezes, 30 minutos cada à temperatura ambiente num agitador de placas. Isto remove o excesso de anticorpo primário não ligado específico do tecido. </li><li> Mergulha-se o embrião / coração em anticorpo secundário anti-rato de cabra Alexa Fluor 647, diluído (1: 1000) em 1 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Repetir o passo 3.4 para lavar o anticorpo secundário. </li><li> Pós-fixar o embrião / coração com 4% de PFA durante 1 h à TA num agitador de placas e lava-se duas vezes com PBS, 5 minutos cada. </li><li> Coloração do embrião / coração com o corante nuclear 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluído em PBST a uma concentração de 0,01 mg / mL) durante 10 min num agitador de placas à TA. Siga com duas lavagens com PBS de 5 minutos cada. </li></ol> 4. Embrião / Clearing coração com Sca l e ou Método CUBIC NOTA: Depois de toda coloração montagem, o embrião / coração é submetido tanto ao Sca le ou método de compensação cúbica de tecido. A escolha do método depende do tamanho e idade do tecido embrionário. Para E11.5 ou embriões idade mais precoce, o uso Sca l e método de limpeza de tecidos, enquanto que para embriões mais velhos ou corações pós-natal é preferido o método de compensação cúbica de tecido. <ol><li> Escala de tecidos Método Clearing <ol><li> Incubar o embrião / coração com 1 ml de Sca l solução de e A2 em um frasco de cintilação (embrulhadas em papel de alumínio) com ocasionais agitação suave (à mão) durante 48 horas a 4 ° C. </li><li> Após a incubação Sca l e A2, incubar o embrião / coração com 1 mL de Sca l solução de e B4 a 4 ° C no mesmo frasco com agitação suave ocasional para anot-lhe 48 h. </li><li> Incubar o embrião / coração durante mais 48 h com 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C com agitação suave ocasional. Mount embrião usando 90% de glicerol (ver secção 5.1). </li></ol></li><li> Cúbica de tecido Método Clearing <ol><li> Para toda embrião / coração compensação cúbicos, mergulhe cada embrião / coração em 1 ml de CUBIC-1 com ocasional agitação suave durante 48 horas a 37 ºC 7. Após 48 horas, substitui a solução com o mesmo volume de reagente fresco CUBIC 1, e incuba-se a amostra para uma 48 horas adicionais a 37 ° C com agitação ocasional com a mão. </li><li> Lavar a cúbica-1 tratados coração / embrião com 1x PBS várias vezes à temperatura ambiente com agitação suave com a mão. Isso remove o excesso de solução CUBIC-1. </li><li> Depois de lavar a CUBIC-1 com PBS, mergulhar os embriões / corações em CUBIC-2 solução (1 g por embrião / coração) por 48 horas a 37 ºC com agitação ocasional gentil com a mão. Isto segue de montagem usando glicerol embrião / coração (ver secção 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Montagem Sample and Imaging NOTA: Os embriões desmatadas ou órgãos em Sca l e 70 ou cúbica-2 solução pode ser trabalhada diretamente com Escala 70 e cúbicas-2 solução como o meio de imagem, respectivamente. No entanto, considerando a vulnerabilidade das amostras embrionárias para reagentes de compensação, se as amostras não são imediatamente ser trabalhada, mas armazenada a longo prazo, armazenar as amostras em glicerol a 90%, seguindo o protocolo abaixo. <ol><li> Diretamente mergulhe o Sca le apuradas amostra em 1 ml de 90% de glicerol e armazenar a 4 ° C até imagiologia. </li><li> Lava-se a amostra tratada cúbicos com 1x PBS, duas vezes, 5 min cada e sequencialmente incubar a amostra com 1 ml de 30%, 50%, 70% e solução de glicerol a 90% durante 30 min cada. </li><li> Para imagiologia, transferir a amostra para uma placa de Petri de vidro de fundo com uma quantidade mínima de 90% de glicerol e imagem clones com um microscópio confocal equipado com duas capacidades de fotões. </li><li> Imagem do coração ou embrião no glicerol com um / 0.3 NA 10X, um 25X / 0.8 NA imersão, ou uma lente objetiva de corretiva 40X / 1.2 NA água. Imagem DAPI usando 2-fótons de excitação de um titânio coerente: a laser camaleão safira. A escolha do microscópio e a lente objectiva dependerá da finalidade das experiências, por exemplo, para super-resolução, um microscópio de fluorescência folha de luz poderia ser utilizado. </li></ol>

<ol>
	<li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+heart:+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells.">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology.">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart.">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+(HREM).">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li><li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development.">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted,+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo.">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium.">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation.">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li><li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterior+heart-forming+field:+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart.">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li><li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia.">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li><li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS.">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins:+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification.">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li><li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP.">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li><li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo.">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

O isolamento de embriões é um passo muito crítica. embriões E9.5 são muito frágeis e pequeno em tamanho, por isso o cuidado extra deve ser tomado para não danificar as estruturas do embrião / coração durante o isolamento. As camadas extras não-embrionárias que envolvem o embrião / cardíaca devem ser cuidadosamente removidos especialmente quando imagiologia todo o embrião. Isto permite a penetração de anticorpos e de compensação mistura profunda dentro dos tecidos embrionários, e também ajuda na remo...

Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a 1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos 3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) 4. O estudo da morfogênese cardíaca requer uma compreensão de detalhes inerentes estruturais em três dimensões (3D) e linhagem de células progenitoras cardíacas simples marcado com traçado durante o desenvolvimento cardíaco irá promover o entendimento da morfogênese cardíaca. Um número de métodos de tomografia secção base de alta resolução foram desenvolvidos no the passado poucas décadas a imagem Estrutura de órgãos 5,6; No entanto, estes métodos requerem, instrumentos especializados caros, mão de obra extensa, e carecem de organização estrutural detalhada em resolução de uma única célula na volumétrica final, reconstruído imagem 7,8. Imagiologia volumétrica 3D ao nível da célula individual fornece um meio para estudar diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular in vivo 7. No entanto, espalhamento de luz tecido permanece o principal obstáculo para imagiologia células e estruturas em 3D profundamente dentro do coração intacto. Lipídios são uma importante fonte de dispersão de luz, ea remoção de lípidos e / ou ajuste da diferença do índice de refração entre lipídios e seus arredores são abordagens potenciais para aumentar a transparência do tecido 8. Nos últimos anos, um número de métodos de limpeza de tecido foram desenvolvidos, que reduzir a opacidade do tecido e dispersão de luz, como BABB (álcool de benzilo e benzilo benzoate mistura) e DBE (tetra-hidrofurano e dibenzylether); mas nestes métodos, extinção de fluorescência permanece um problema 8-10. O solvente baseado métodos hidrofílicos, tais como SeeDB (frutose / tioglicerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar sinais fluorescentes, mas não tornem todo o órgão transparente 7,8,11. Em comparação, o método tecido desobstrução-Clareza torna o órgão transparente, mas exige um dispositivo de electroforese especializada para remover os lípidos 8,12, assim como Pact (técnica passiva clareza), que também requer a incorporação de hidrogel 7,13. Para informações detalhadas sobre todos os métodos de remoção de tecidos disponíveis, consulte a Tabela 1 em Richardson e Lichtman, et al. 7. Em 2011, Hama et al. Serendipitously descobriu uma mistura hidrofílica &#39;Sca le&#39; (uréia, glicerol e Triton mistura X-100), que torna o cérebro do rato e transpar embriãoent completamente, preservando sinais fluorescentes a partir de clones marcados 14. Isto permite a formação de imagens do cérebro intacto a uma profundidade de vários milímetros e reconstrução em grande escala de populações neuronais e as projecções com uma resolução subcelular. Susaki et ai. melhorada Sca le adicionando aminoálcoois e desenvolveu o (e desobstruídas cocktails claras de imagem cerebral e análise computacional) &#39;CÚBICAS &quot;método de compensação do tecido, o que aumentou a solubilização fosfolipídios, reduziu o tempo de compensação, e permitiu multicolor fluorescente imaging 8. No presente estudo, aproveitando a Sca le e técnicas de limpeza cúbica de tecido e alta resolução seccionamento óptico 3D, clones individuais dentro do coração durante cardiogenesis foram rastreados usando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato. A combinação do método de coloração de montagem inteira (WMS) desenvolvido anteriormente 21,22 com métodos de compensação de tecido mais permitidos para a coloração de outras proteínas em clones marcados e para o estudo do seu comportamento em um contexto volumétrica 3D. A combinação de tecido e de compensação WMS permite uma melhor compreensão dos papéis dos diferentes genes e proteínas durante o desenvolvimento cardíaco, e a etiologia de defeitos cardíacos. Este protocolo pode ser aplicado para estudar diferenciação de células progenitoras outro, o comportamento celular, e morfogénese eventos órgão durante o desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>2,2&amp;prime;,2&amp;prime;&amp;rsquo;-nitrilotriethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP16000</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Sunflower seed oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C Incubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48 well plates</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Microscope</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x15 mm&amp;nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&amp;nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Scintillating tubes</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

rastreamento clonal único e análise ao nível de todo o coração pode determinar o comportamento de células progenitoras cardíacas e diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco e permitir o estudo das bases celulares e moleculares da morfogênese cardíaca normal e anormal. tecnologias emergentes recentes de análises clonais individuais retrospectivos tornar o estudo da morfogênese cardíaca em resolução única célula viável. No entanto, a opacidade dos tecidos e espalhamento de luz do coração como a profundidade da imagem é aumentada dificultar imagem de todo o coração a uma resolução de uma única célula. Para superar esses obstáculos, um sistema de compensação de todo o embrião, que pode tornar o coração altamente transparentes para iluminação e detecção deve ser desenvolvida. Felizmente, nos últimos anos, muitas metodologias para sistemas de compensação de todo o organismo, tais como clareza, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, BABB e PACT foram relatados. Este laboratório está interessado nos mecanismos celulares e moleculares de cartãomorfogênese iac. Recentemente, estabelecemos única linhagem de células de rastreamento via ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti às células rótulo escassamente durante o desenvolvimento cardíaco. Nós adaptada várias metodologias de remoção de embriões inteiros, incluindo Sca le e cúbicos (, coquetéis de imagem cerebral claras desobstruídas e análise computacional) para limpar o embrião em combinação com toda a coloração de montagem a imagem clones individuais dentro do coração. O coração foi fotografada com sucesso na resolução de uma única célula. Descobrimos que Sca le pode limpar o coração embrionário, mas não podem efectivamente limpar o coração pós-natal, enquanto cúbico pode limpar o coração pós-natal, mas danifica o coração embrionário por dissolução do tecido. Os métodos descritos aqui irão permitir o estudo da função dos genes em um único clone de resolução durante a morfogénese cardíaca, o que, por sua vez, pode revelar a base molecular e celular de defeitos cardíacos.

Imaging o coração embrionário apuradas Formação do coração dos vertebrados é um processo morphogenic espaço-temporalmente regulados e depende da organização e diferenciação de células progenitoras de quatro fontes diferentes 1. As células a partir do primeiro campo do coração do crescente cardíaca irá dobrar para a linha mediana ventral, para formar um tubo cardíaco linear. As células a partir d...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K visualizações.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Vídeo: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biologia

Microscopia de folha de luz e limpeza de tecido para imagens cardíacas abrangentes

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Autor em destaque: Imagem de folha de luz personalizada para investigar estruturas miocárdicas em corações de roedores

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Bioengenharia

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Resumo

Explore mais vídeos

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato