Name: engineered vascularized muscle flap
Uploaded: 2016-01-11T09:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
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This research was supported by the FP7 European Research Council Grant 281501, ENGVASC.

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Technion. Para este procedimento, utilizaram-se ratinhos nus atímicos, para evitar a rejeição imunológica. Se utilizar outro tipo de mouse, os ratos devem ser raspada antes do procedimento cirúrgico e administração de ciclosporina (ou outro substituto anti-rejeição) é recomendado. 1. Preparação e andaime celular Embedding <ol><li> Prepare andaimes compostas de mistura 1: 1 de poli-L-láctico-ácido (PLLA) e poli láctico-co-glicólico-ácido (PLGA), da seguinte forma: <ol><li> Dissolve-se 500 mg de PLLA e 500 mg de PLGA em 10 mL de clorofórmio. </li><li> Adicionar 0,24 ml de solução de polímero a 0,4 g de partículas de cloreto de sódio reunidos em moldes de Teflon. Use um diâmetro sal de 212-600 m. Permitir que o clorofórmio se evaporar O / N. </li><li> Lixiviar o sal usando água destilada levando a scaffolds 3D porosas interligados. </li><li> Corte pedaços de polímerousando uma tesoura, em seguida, mergulhar em etanol a 70% (v / v) durante 30 min e lava-se 3 vezes em PBS durante 2 min antes da utilização. </li></ol></li><li> Prepara-se uma tri-cultura de células que se segue em 1: meio de células 1 endotelial (EGM-2 suplementado com os componentes do seu kit de marcador e meio de células do músculo (meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS ), 2,5% de tampão HEPES, 100 U / ml de penicilina, e 0,1 mg / ml de estreptomicina (Pen-Strep solução). <ol><li> Utilizar 0,5 x 10 6 mioblastos C2C12, 0,9 x 10 6 células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e 0,2 x 10 6 fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF). </li></ol></li><li> Misturar as células em conjunto num tubo de microcentrífuga e centrifugar a 200 xg durante 4 min, Aspirar o meio e re-suspender o sedimento em uma mistura de solução de matriz extracelular fria 4 ul de gelo e 4 ul de meio celular. </li><li> Cortar um pedaço de 10 mm x 7 mm x 1 mm (comprimento x largura x espessura) de PLLA / PLGUm andaime e propagar a suspensão de células numa placa de 6 poços, permitir que a solução de matriz extracelular para solidificar (30 min, 37 ° C, 5% de CO2) antes da adição de 4 ml de meio de células. </li><li> Incubar os andaimes para dez dias antes da implantação e substituir o meio todos os outros dias. </li></ol> 2. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico <ol><li> Prepare e esterilizar (autoclave) os seguintes instrumentos cirúrgicos: um pequeno, muito bem, tesoura reta, uma tesoura primavera, uma linha reta, pinça de ponta fina, uma pinça serrilhada e um suporte de agulha. </li><li> Prepara-se uma mistura de cetamina: xilazina solução num tubo de microcentrífuga por mistura de 425 ul de cetamina e xilazina 75 ul de uma seringa de 1 ml. </li><li> Dilui-se 0,3 mg / ml de buprenorfina em solução salina estéril (01:20). </li></ol> 3. Flap Construção (Graft Implantação) <ol><li> Usando uma seringa de insulina, anestesiar o rato por uma injecção intraperitoneal de cetamina: xilazina (35 ul por20 g de peso corporal). </li><li> Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) antes do opperation. </li><li> Posicione o mouse em uma fase aquecida a 37 ° C, para garantir a temperatura normal do corpo, e em seguida, prenda o rato usando uma bandagem adesiva. </li><li> Usando pontas de algodão, administrar pomada lubrificante para os olhos do mouse (para evitar a desidratação). </li><li> Utilizando pontas de algodão, limpo local da incisão com iodo e, em seguida, com 70% de etanol, para estabelecer um campo de trabalho asséptico. </li><li> Usando pequenas tesouras e pinças, fazer uma incisão através da pele, a partir do nível do joelho ao ligamento inguinal, paralela aos vasos femorais, até que a artéria e veia femoral (AV) navios estão expostos. </li><li> Segure a pele para baixo, usando um afastador, para obter um melhor acesso ao tecido. </li><li> Utilizando tesouras e pinças de mola, isolar cuidadosamente os vasos artéria e veia femorais a partir do tecido circundante. Iniciar a partir do nível do lig inguinalament à bifurcação dos vasos epigástricas superiores. Deixar a profunda intacto, de modo a preservar o fluxo de sangue para a perna e prevenir isquemia subsequente. </li><li> Dobre o enxerto (da Seção 1) em torno do AV femoral exposta, abaixo da profunda e acima da bifurcação para o tibial e AV proneal, ea participar nas suas extremidades, utilizando suturas de seda 8-0. </li><li> Para garantir a vascularização do implante pelos capilares brotando apenas os vasos femorais AV, enrole um pedaço de látex esterilizadas ao redor do enxerto, e sutura com 6-0. </li><li> Feche a pele sobrejacente usando 4-0 seda. </li><li> Monitorar de perto o mouse até a recuperação da anestesia e todos os dias depois, até que o enxerto é transferido como retalho. Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) duas vezes por dia durante 2-3 dias. NOTA: Use salina em qualquer fase, para evitar a desidratação do tecido exposto. </li></ol> 4. Flap Transferência <ol><li> Em um ouduas semanas após a implantação, anestesiar o rato por uma injecção intraperitoneal de cetamina: xilazina (35 mL / 20 g), usando uma seringa de insulina. </li><li> Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) antes do opperation. </li><li> Posicione o mouse em uma fase aquecida a 37 ° C, para garantir a temperatura normal do corpo, e em seguida, prenda o rato usando uma bandagem adesiva. </li><li> Usando pontas de algodão, aplique pomada lubrificante para os olhos do mouse (para evitar a desidratação). </li><li> Usando pontas de algodão, limpe o local da incisão (da área de joelho para o abdome) com iodo e, em seguida, com etanol 70%, para estabelecer um campo de trabalho asséptico. </li><li> Usando uma tesoura e uma pinça, abra cuidadosamente as suturas na pele e, usando uma tesoura, fazer uma incisão através da pele paralelamente ao ligamento inguinal, continuando através da pele ventral. </li><li> Retire cuidadosamente o pedaço de látex com uma pinça e expor a retalho vascularizado. </li><li> Usando um SCISSRUP e uma pinça, dissecar a retalho de tecido a partir do tecido circundante. </li><li> Utilizando um fórceps e um suporte de agulha, ligar a extremidade distal do AV femoral com 8-0 suturas de seda para evitar o sangramento a partir do AV. Em seguida, cauterizar o AV ao nível do joelho, distalmente para o tecido implantado dobrado e as suturas 8-0. </li><li> Suavemente transferir o AV femoral envolvido pelo enxerto, em direcção à parede abdominal ventral, evitando danos na artéria, para determinar a que distância deve ser feito o defeito de espessura total. CUIDADO: Puxar a artéria muito longe irá danificar a artéria. </li><li> Usando uma multa tesoura, fazer uma incisão na parede abdominal ventral. </li><li> Usando uma tesoura primavera, fazer uma incisão no músculo reto abdominal. Remover uma cerca de 1 cm x 0,8 centímetros segmento do músculo reto abdominal com a pele sobrejacente. </li><li> Transferir a AV femoral, envolvido pelo enxerto vascularizado, tal como uma aba axial, para o defeito de espessura total na Abdom ventralparede inal. </li><li> Suturar a aba para o tecido muscular circundante, utilizando 8-0 suturas de seda, para evitar hérnia. </li><li> Para evitar suturando os órgãos internos, aumentar o músculo com uma pinça de sutura quando a aba ao músculo abdominal. Deixar a pele ventral exposta para mimetizar o efeito de uma lesão na parede abdominal completa. </li><li> Cobrir a ferida na pele com uma gaze iodado e uma gaze esterilizada para evitar a contaminação da superfície exposta. </li><li> Suturar a pele da perna utilizando 4-0 suturas de seda. </li><li> Monitorar de perto o mouse até a recuperação da anestesia e todos os dias depois, até a recuperação do retalho. Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) duas vezes por dia durante 2-3 dias. </li><li> NOTA: Utilize soro fisiológico em qualquer fase para evitar a desidratação do tecido exposto. </li></ol> 5. Determinação do ultra-som de perfusão vascular do enxerto NOTA: Antes da transferência, o perfusão vascularf o enxerto é medida em uma e duas semanas após o implante, por ultra-sonografia. <ol><li> Anestesiar o rato usando 2% de isoflurano. </li><li> Posicione o mouse em um palco móvel aquecida a 38 ° C, para garantir a temperatura normal do corpo, e em seguida, prenda o rato usando uma bandagem adesiva. </li><li> Encontre os vasos artéria e veia femoral com transdutor não-linear definido no modo-B. </li><li> Examine a permeabilidade dos vasos femorais do enxerto utilizando o transdutor de definir o modo Doppler colorido. </li><li> Prepare agente não específico contraste de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Conectar um cateter na veia da cauda (12 cm tubo com uma agulha 27 G) para uma seringa de 1 ml cheio com solução salina. Fixe a seringa ao lado do mouse sobre a fase de aquecimento (para evitar o movimento da seringa). </li><li> Conecte o cateter à veia da cauda do rato e segura a agulha. </li><li> Injectar alguma da solução salina para assegurar que ambas as injecções são feitas na veia e para preenchera tubagem com solução salina (para evitar bolhas de ar). </li><li> Encha uma seringa de 1 ml com 70 ul de agente de contraste e substituir a solução salina com uma seringa da seringa agente de contraste. </li><li> Defina-se a ultra-sons para injecção imagem do agente de contraste. Em propriedades de modo não-linear configurar o número de quadros a 1.500 e o pulso de ruptura de 30% das armações. NOTA: Após o pulso de ruptura, as microbolhas voltar a encher os recipientes a uma taxa que depende da taxa de fluxo das microbolhas nos capilares e é independente da taxa de injecção de microbolhas. O número de quadros pode ser alterado de acordo com o tempo de enchimento 19,20. </li><li> Lentamente injectar o agente de contraste na veia da cauda. </li><li> Captar imagens no modo de contraste não-linear do sistema de ultra-som de alta-resolução. </li><li> Analisar os resultados usando o software, conforme descrito previamente 19,20. <ol><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) na imagem obtida immediatamente após o pulso de ruptura no modo de contraste. O ROI deve delinear a área preenchida apenas pelo agente de contraste. </li><li> Calcula-se a intensificação de pico (PE), que é a razão entre a intensidade média do sinal não-linear após a injecção das microbolhas contra após o pulso ruptura, e é uma medida do volume de perfusão. </li><li> Calcula-se a taxa de fluxo, a qual é determinada a partir do tempo (T), que decorre até que o sinal de pico (P). </li></ol></li></ol> 6. Determinação do grau de vascularização do enxerto NOTA: A extensão da vascularização do enxerto de tecido é determinada de uma ou duas semanas após o implante. <ol><li> Usando uma seringa de insulina, anestesiar o rato por uma injecção intraperitoneal de cetamina: xilazina (35 mL / 20 g). </li><li> Usando uma seringa de 1 ml, por via intravenosa injectar 200 ul de 10 mg / ml de dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-Dextrano, MW = 500,000) na veia da cauda. &lt;/ li&gt; <li> Dez segundos após o término da injecção, o rato eutanásia por deslocação cervical. </li><li> Abra a perna do rato e expor o enxerto. </li><li> Lavar a área do enxerto com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e aplicam-se 10% de formalina tamponada neutra. </li><li> Imagem do enxerto na perna do rato, utilizando um microscópio confocal. </li><li> Quantificar a densidade de vasos funcional (FVD). <ol><li> Isolar o canal verde (excitação = 488 nm) das imagens microscópicas confocal. </li><li> Passar as imagens resultantes através de um filtro passa-alto, a fim de acentuar as estruturas de alto contraste. </li><li> Usar um filtro despeckling para remover o ruído que pode ter sido amplificado pelo filtro passa-alto. </li><li> Configure o valor do limiar na imagem resultante; o valor de limiar é ajustado de modo que as características e as estruturas na imagem original são visíveis na imagem binária. </li><li> Aplicar um limite de tamanho para que apenas grupos de pixels conectados maior do que o definido size limiar permanecer na imagem binária. </li><li> Esboço do esqueleto dos navios no enxerto utilizando o algoritmo de Zhang-Suen 21. </li><li> Calcular o FVD pela soma dos comprimentos da linha média de cada recipiente e dividindo o resultado pela área da ROI. </li></ol></li></ol> 7. A coloração histológica e imuno do enxerto <ol><li> A coloração imuno <ol><li> Depois de imagem confocal, recuperar o enxerto usando uma pequena tesoura e uma pinça. Dissecar as embarcações AV nas duas extremidades do enxerto e recuperar o enxerto. </li><li> Corrigir os enxertos em 10% formalina tamponada neutra por 30 minutos - 2 horas. </li><li> Coloque os enxertos em cassetes de Histologia e loja em etanol a 70% até parafina. </li><li> Incorporar em parafina usando um padrão de fixação e incorporação de protocolo 22 e fatiar os tecidos embebidos em parafina em 5 mm fatias utilizando um micrótomo. Fatie todo o tecido perpendicularmente à AVembarcações. </li><li> Desparafinar as secções embebidas em parafina, por imersão em 100% de xileno, duas vezes, durante 10 min cada. </li><li> Dispor as lâminas em um frasco de 250 ml de Coplin plástica. </li><li> Rehidratar por imersões em série em concentrações decrescentes de etanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% e água duplamente destilada (ADD)) durante 3 minutos cada. </li><li> Preparar a solução de antigénio de desmascaramento diluindo 2,35 ml de solução de antigénio de desmascaramento com 250 mL de ADD. Aquece-se a solução de antigénio desmascaramento durante 2 minutos num forno de microondas configurado para 95 ° C. </li><li> Inserir as lâminas para a solução de antigénio desmascaramento pré-aquecida e o calor novamente durante 3 minutos num forno de microondas configurado para 95 ° C. Arrefecer as lâminas a 50 ° C. </li><li> Aqueça novamente por 2 min e depois arrefecer a RT. </li><li> Incubar as lâminas em 3,3% de H 2 O 2 em solução de metanol, durante 10 min, à RT para extinguir a actividade da peroxidase endógena e depois lavar duas vezes em PBS. </li><li> Preparar uma câmara de incubação: lugar molhado absofolhas rbent dentro de uma caixa de histologia e secar as lâminas através de limpadores de pára-tarefa delicada. </li><li> Círculo área da fatia na lâmina utilizando uma caneta hidrofóbica e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, com cerca de 50 ul de solução de soro de cabra (2%, preparado em PBS) por cada fatia de bloqueio. </li><li> Dilui-se o anticorpo de coelho anti-CD31 anticorpo 1:50 em solução de bloqueio, aplicar cerca de 50 ul de anticorpo por fatia e incubar S / N, a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada. </li><li> Dilui-se a biotinilado de cabra anti-coelho secundário de anticorpo de 1: 400 em PBS, as lâminas lugar ao longo de aproximadamente 50 ul de anticorpo por fatia e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada. </li><li> Dilui-se estreptavidina-peroxidase 1: 400 em PBS, aplicam-se aproximadamente 50 ul por fatia e incubar com as lâminas durante 30 min, à RT. Lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada. </li><li> Aplicar aproximadamente 50 ul de aminoetilcarbazole (AEC) substrato por fatia, de acordo com o fabricante &amp; #8217; s instruções. Mergulhar as lâminas em DDW para parar a reacção. </li><li> Manchar os núcleos em azul por imersão das secções em cerca de 50 ul de solução de hematoxilina de Mayer durante 2 min. Delicadamente lave em água e, em seguida, cobrir as seções com meio de montagem. </li><li> Quantificar coloração CD31-positivo usando uma abordagem de duplo-cego. Coloração CD31 aparece como uma mancha marrom. Escolha 4-5 campos diferentes em um campo de visão de ampliação 40X sob um microscópio binocular. Contar o número de lúmenes CD31-positivas. <ol><li> Calcula-se a média do número de lúmenes CD31-positivo por andaime, dividindo o número total de lúmens contados com o número de campos e o fieldarea (de acordo com os dados binocular). NOTA: O volume de reagente aplicado deve ser suficiente para cobrir toda a fatia descrito. </li></ol></li></ol></li><li> Coloração histológica <ol><li> Corrigir enxertos em 10% formalina tamponada neutra. </li><li> Enxertos Incorporar em parafina usando o padrãofixação e procedimentos de incorporação. </li><li> Remover a parafina das secções embebidas em parafina, por imersão em xileno, duas vezes 100% durante 10 min. </li><li> Lavagem rápida duas vezes para reidratação em 100% isopropanol. </li><li> Lavagem rápida duas vezes 95% de etanol. </li><li> Lavar três vezes na água da torneira. </li><li> Mergulhe em Hematoxilina para 10 min. </li><li> Lavar três vezes na água da torneira. </li><li> Immere em Eosina por 2 min. </li><li> Lavagem rápido desidratar em 95% de etanol duas vezes. </li><li> Rápido lavagem 100% isopropanol duas vezes. </li><li> Rápido lavagem 100% de xileno duas vezes. </li><li> Cubra com DPX cola com tampa de vidro 1,5 mm de espessura. </li><li> Imagem usa o microscópio no 40X. </li></ol></li></ol> 8. Mechanical Assessment Propriedades <ol><li> Recuperar o enxerto usando uma pequena tesoura e uma pinça. </li><li> Lavar o enxerto em PBS. </li><li> Medir a largura e a espessura do enxerto e calcular a área da secção transversal como a largura multiplicado pela espessura. </li><li> NosPT O instrumento de teste para gerar uma curva de tensão-deformação de enxertos hidratados. <ol><li> Monte o enxerto entre os apertos de tração do sistema e medir o comprimento final entre as duas alças (ou seja, comprimento inicial). </li><li> Aplicar uma taxa de deformação de 0,01 mm / seg, até a falha. </li><li> Registar a força desenvolvida e deslocamento utilizando o protocolo do fabricante. </li><li> Gerar uma curva de tensão-deformação em Matlab. <ol><li> Calcular estirpe de acordo com o deslocamento dividido pelo comprimento inicial. O stress é calculada como a força medida dividida pela área de corte transversal. </li><li> Determinar a rigidez como a inclinação da região linear-o na curva de tensão-deformação e o ponto máximo da curva é a força de tracção máxima. </li></ol></li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infarct+stabilization+and+neovascularization+mediated+by+VEGF-loaded+PEGylated+fibrinogen+hydrogel+in+a+rodent+myocardial+infarction+model.">Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model.</a> Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).</li><li>Nillesen, S. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+angiogenesis+in+acellular+scaffolds+by+combined+release+of+FGF2+and+VEGF.">Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF.</a> J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).</li><li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fabrication+of+functional+three-dimensional+tissues+with+perfusable+blood+vessels.">In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels.</a> Nat Commun. 4, 1399 (2013).</li><li>Tee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+engineered+cardiac+muscle+flaps+in+syngeneic+rats.">Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats.</a> Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).</li><li>Morritt, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering+in+an+in+vivo+vascularized+chamber.">Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber.</a> Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Os avanços na engenharia de tecidos foram atingidos com uma crescente demanda por tecidos substitutos para a reconstrução de vários tipos de tecido. Uma variedade de sintéticos e biológicos 1,17,18 14-16 materiais, bem como métodos de fabricação foram avaliados quanto à sua capacidade para responder a estas exigências. No entanto, apesar dos progressos no tratamento clínico e em engenharia de tecidos, a restauração de defeitos da parede abdominal de espessura total continua a ser um d...

Defeitos da parede abdominal, muitas vezes surgem após trauma grave, o tratamento do câncer, queimaduras e remoção de malha infectado. Esses defeitos envolvem frequentemente perda de tecido significativa, exigindo procedimentos cirúrgicos complicados e apresentando um grande desafio para os cirurgiões plásticos de reconstrução 1-4. Pesquisadores de engenharia de tecidos que procuram novas fontes de tecidos artificiais têm explorado diferentes materiais, fontes de células e fatores de crescimento. Restaurações de sucesso de vários tecidos, tais como 5,6 traqueia, bexiga 7, 8, córnea, ossos e pele 9 10, por implantação de tecidos artificiais foram relatados previamente. No entanto, a fabricação de um tecido vascularizado espessura de engenharia, em particular para a reconstrução de defeitos grandes, continua a ser um desafio significativo na engenharia de tecidos. Um dos principais fatores que limitam a espessura de uma construção de tecido viável é o controle do suprimento de oxigênio para seus contrastituent células. Quando depender de difusão, construir espessura é limitado ao de uma camada muito fina. A distância máxima entre o oxigénio e os capilares de fornecimento de nutrientes in vivo é de aproximadamente 200 pM, que se correlaciona com o limite de difusão de oxigénio 11,12. Vascularização insuficiente pode resultar em isquemia tecidual e escalar a reabsorção de tecido ou necrose 13. Além disso, o material ideal para a reconstrução de tecidos utilizados devem ser biocompatíveis e não-imunogénico. Ele também deve ser capaz de promover uma maior integração de células hospedeiras com o biomaterial, e manter a integridade estrutural. Vários biológicos 14-16 e sintéticas 1,17,18 matrizes tenham sido previamente exploradas para a reconstrução de tecidos, no entanto a sua utilização permanecem limitados devido à falta de fornecimento de sangue eficaz, infecções ou tecido força insuficiente. Neste estudo, um biocompatível, célula-EMBandaime edded composta por Food and Drug Administration (FDA) de ácido poli -aprovado L-láctico (PLLA) / poli ácido láctico-co-glicólico (PLGA), foi implantado em torno da artéria e veia femoral (AV) navios de um ratinho nu e separadas a partir do tecido circundante, assegurando vascularização a partir de apenas os vasos AV. Uma semana após a implantação, o enxerto era viável, grosso e bem vascularizado. Este tecido vascularizado espesso com os vasos AV, foi então transferido como um retalho pediculado a um defeito de espessura total abdominal no mesmo mouse. Uma semana após a transferência, o retalho foi viável, vascularizado e bem integrado com o tecido circundante, tendo força suficiente para suportar vísceras abdominais. Assim, a aba de engenharia de espessura, o tecido vascularizado, tendo um pedículo autólogo, apresenta um novo método para a reparação de defeitos da parede abdominal de espessura total.

<table><tbody><tr><td>small fine straight scissors</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>spring scissors</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>straight forceps with fine tip</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>serrated forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Small vessel cauterizer&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>5686</td><td></td></tr><tr><td>Sedaxylan</td><td>Euravet</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>Clorketam 1000</td><td>Vetoquinol</td><td>4A0726B</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>4-0 silk sutures</td><td>Assut sutures</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>6-0 polypropylene sutures</td><td>Assut sutures</td><td>9351F</td><td></td></tr><tr><td>8-0 silk sutures</td><td>Assut sutures</td><td>684568</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe (6 mm needle)</td><td>BD</td><td>324911</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 high-resolution ultrasound system</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 non-linear transducer</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromarker non-targeted contrast agent</td><td>VisualSonics inc.</td><td>VS-11694</td><td></td></tr><tr><td>tail vein catheter</td><td>VisualSonics inc.</td><td>VS-11912</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 software</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran</td><td>Sigma</td><td>FD500S</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>antigen unmasking solution</td><td>Vector laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-peroxidase</td><td>Jackson&amp;nbsp;</td><td>016-030-084</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&#039;s hamatoxylin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS-16</td><td></td></tr><tr><td>aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit</td><td>Life technologies, Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>00-2007</td><td></td></tr><tr><td>Vectamount</td><td>Vector laboratories</td><td>H-5501</td><td></td></tr></tbody></table>

engineered vascularized muscle flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

Vascularização do enxerto e perfusão in vivo Os enxertos foram implantadas uma ou duas semanas, antes da sua transferência como abas axiais. Em um e duas semanas pós-implantação, a observação bruta da área do enxerto revelou enxertos de tecidos vascularizados e viáveis. Estes enxertos provou ser altamente vascularizado, tal como determinado por imunocoloração positiva de CD31 (Figura 1A), e altamente perfundidos, como evidenciado por injecção na veia ...

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Engineered Vascularized Muscle Flap

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Projetado retalho do músculo vascularizada

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.2K visualizações.  Kaplan Medical Center. To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps. 

Vídeo: Engineered Vascularized Muscle Flap

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Bioengenharia

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Model of Free Tissue Transfer: The Rat Epigastric Free Flap

Free tissue transfer has been increasingly used in clinical practice since the 1970s, allowing reconstruction of complex and otherwise untreatable defects resulting from tumor extirpation, trauma, infections, malformations or burns. Free flaps are particularly useful for reconstructing highly complex anatomical regions, like those of the head and neck, the hand, the foot and the perineum. Moreover, basic and translational research in the area of free tissue transfer is of great clinical potential. Notwithstanding, surgical trainees and researchers are frequently deterred from using microsurgical models of tissue transfer, due to lack of information regarding the technical aspects involved in the operative procedures. The aim of this paper is to present the steps required to transfer a fasciocutaneous epigastric free flap to the neck in the rat.
This flap is based on the superficial epigastric artery and vein, which originates from and drain into the femoral artery and vein, respectively. On average the caliber of the superficial epigastric vein is 0.6 to 0.8 mm, contrasting with the 0.3 to 0.5 mm of the superficial epigastric artery. Histologically, the flap is a composite block of tissues, containing skin (epidermis and dermis), a layer of fat tissue (panniculus adiposus), a layer of striated muscle (panniculus carnosus), and a layer of loose areolar tissue.
Succinctly, the epigastric flap is raised on its pedicle vessels that are then anastomosed to the external jugular vein and to the carotid artery on the ventral surface of the rat's neck. According to our experience, this model guarantees the complete survival of approximately 70 to 80% of epigastric flaps transferred to the neck region. The flap can be evaluated whenever needed by visual inspection. Hence, the authors believe this is a good experimental model for microsurgical research and training.

This paper describes the steps required to raise a fasciocutaneous epigastric free flap and transfer it to the neck in the rat.

Um Modelo de Transferência Tissue Free: The Rat epigástrica gratuito Flap

Free tissue transfer has been increasingly used in clinical practice since the 1970s, allowing reconstruction of complex and otherwise untreatable defects ...

Medicina

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, failed by the first steps of the reconstructive ladder. Despite promising aesthetic and functional outcomes, the main limiting factor remains the need for a drastically applied lifelong immunosuppression and its well-known medical risks, preventing broader indications. Therefore, lifting the immune barrier in VCA is essential to tip the ethical scale and improve patients&#39; quality of life using the most advanced surgical techniques. De novo creation of a patient-specific graft is the upcoming breakthrough in reconstructive transplantation. Using tissue engineering techniques, VCAs can be freed of donor cells and customized for the recipient through perfusion-decellularization-recellularization. To develop these new technologies, a large-scale animal VCA model is necessary. Hence, swine fascio-cutaneous flaps, composed of skin, fat, fascia, and vessels, represent an ideal model for preliminary studies in VCA. Nevertheless, most VCA models described in the literature include muscle and bone. This work reports&#160;a reliable and reproducible technique for saphenous fascio-cutaneous flap harvest in swine, a practical tool for various research fields, especially vascularized composite tissue engineering.

The present protocol describes the porcine fascio-cutaneous flap model and its potential use in vascularized composite tissue research.

Um modelo confiável de retalho fasciocutâneo suíno para estudos de bioengenharia de aloenxertos compostos vascularizados

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

Suínos como um módulo de treinamento para reconstrução Microvascular, cabeça e pescoço

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Projetado retalho do músculo vascularizada

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