This research was supported by the FP7 European Research Council Grant 281501, ENGVASC.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato delle Etico di esperimenti su animali del Technion. Per questa procedura, topi nudi atimici sono stati usati per evitare il rigetto immunologico. Se si utilizza un altro tipo di mouse, i topi dovrebbero essere rasata prima della procedura chirurgica e la somministrazione di ciclosporina (o un altro sostituto anti-rigetto) è raccomandato. 1. Ponteggio Preparazione e Cell Embedding <ol><li> Preparare ponteggi composto da 1: 1 miscela di poli-L-lattico-acido (PLLA) e polilattico-glicolico-co-acido (PLGA), nel modo seguente: <ol><li> Sciogliere 500 mg di PLLA e 500 mg di PLGA in 10 ml di cloroformio. </li><li> Aggiungere 0,24 ml della soluzione di polimero a 0,4 g di particelle di cloruro di sodio raccolti in Teflon stampi. Utilizzare un diametro di 212-600 micron di sale. Lasciare che il cloroformio evaporare O / N. </li><li> Percolare il sale utilizzando acqua distillata che porta a interconnessi scaffold 3D porosi. </li><li> Tagliare pezzi di polimeriutilizzando un paio di forbici, poi immergere in 70% di etanolo (v / v) per 30 minuti e lavare 3 volte in PBS per 2 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare un tri-coltura delle seguenti cellule in 1: medio cella 1 endoteliale (EGM-2 integrato con i componenti del suo kit proiettile e medie cellule muscolari (mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM), supplementato con siero bovino fetale al 10% (FBS ), 2,5% tampone HEPES, 100 U / ml di penicillina, e 0,1 mg / ml di streptomicina (Pen-Strep Solution). <ol><li> Utilizzare 0,5 x 10 6 C2C12 mioblasti, 0,9 x 10 6 vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) e 0,2 x 10 6 normali fibroblasti dermici umani (NHDF). </li></ol></li><li> Mescolare insieme le cellule in una provetta e centrifugare a 200 xg per 4 minuti, aspirare il terreno e risospendere il pellet in una miscela di soluzione di matrice extracellulare freddo 4 microlitri ghiaccio e 4 microlitri medio cellule. </li><li> Tagliare un pezzo di 10 mm x 7 mm x 1 mm (lunghezza x larghezza x spessore) PLLA / PLGUn ponteggio e Seed la sospensione cellulare in una piastra da 6 pozzetti, lasciare che la soluzione matrice extracellulare solidificare (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) prima di aggiungere 4 ml di mezzo cellulare. </li><li> Incubare le impalcature per dieci giorni prima dell&#39;impianto e sostituire il mezzo a giorni alterni. </li></ol> 2. Prima di avviare la procedura chirurgica <ol><li> Preparare e sterilizzare (autoclave) i seguenti strumenti chirurgici: un piccolo, multa, forbici diritte, un paio di forbici a molla, una scala, pinze punta fine, una pinza dentata e un porta-aghi. </li><li> Preparare una miscela di ketamina: soluzione xylazina in una provetta mescolando 425 ml di ketamina e 75 xylazina microlitri in una siringa da 1 ml. </li><li> Diluire 0,3 mg / ml in soluzione fisiologica sterile buprenorfina (1,20). </li></ol> 3. Flap costruzione (Graft impianto) <ol><li> Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xylazina (35 microlitri per20 g di peso corporeo). </li><li> Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation. </li><li> Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Utilizzando punte di cotone, amministrare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione). </li><li> Usando punte di cotone, pulire il sito di incisione con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico. </li><li> Utilizzando piccole forbici e pinze, fare un&#39;incisione attraverso la pelle, dal livello del ginocchio per legamento inguinale, parallelo ai vasi femorali, fino l&#39;arteria femorale e vena (AV) navi sono esposti. </li><li> Tenere la pelle verso il basso con un divaricatore, per ottenere un migliore accesso al tessuto. </li><li> Utilizzando forbici primavera e pinze, isolare con cura i vasi arteria e vena femorale dal tessuto circostante. Inizia dal livello della lig inguinaleament alla biforcazione dei vasi epigastrici superiori. Lasciare la profunda intatto, al fine di preservare il flusso di sangue alla gamba e prevenire la conseguente ischemia. </li><li> Piegare l&#39;innesto (dal punto 1) intorno al AV femorale esposta, sotto la profunda e al di sopra della biforcazione al tibiale e proneal AV, e unire le estremità con 8-0 punti di sutura in seta. </li><li> Per garantire la vascolarizzazione dell&#39;impianto dai capillari che spuntano solo dai vasi femorali AV, avvolgere un pezzo di lattice sterile intorno al trapianto, e suturare con 6-0 punti di sutura. </li><li> Chiudere la pelle sovrastante con 4-0 punti di sutura in seta. </li><li> Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall&#39;anestesia e ogni giorno successivo, fino a quando l&#39;innesto viene trasferito come lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni. NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase, per evitare la disidratazione del tessuto esposto. </li></ol> 4. Flap Transfer <ol><li> Ad una odue settimane dopo l&#39;impianto, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g), utilizzando una siringa da insulina. </li><li> Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation. </li><li> Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Utilizzando punte di cotone, applicare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione). </li><li> Utilizzando punte di cotone, pulire il sito di incisione (dalla zona del ginocchio per l&#39;addome) con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico. </li><li> Utilizzando un paio di forbici e pinze, aprire con attenzione i punti di sutura nella pelle e, utilizzando un paio di forbici, fare un&#39;incisione attraverso la pelle parallela al legamento inguinale, proseguendo attraverso la pelle ventrale. </li><li> Rimuovere con attenzione il pezzo di lattice con una pinza ed esporre il lembo vascolarizzato. </li><li> Utilizzando un SCISSors e pinze, sezionare il lembo di tessuto dal tessuto circostante. </li><li> Utilizzando una pinza e un porta-aghi, legare l&#39;estremità distale del femore AV con 8-0 punti di sutura in seta per prevenire le emorragie dal AV. Poi, cauterizzare la AV a livello del ginocchio, distalmente al tessuto impiantato ripiegato e le suture 8-0. </li><li> Trasferire delicatamente il AV femorale avvolto dal trapianto, verso la parete addominale ventrale, evitando di danneggiare l&#39;arteria, per determinare a quale distanza il difetto a tutto spessore dovrebbe essere fatto. ATTENZIONE: Tirando l&#39;arteria troppo per evitare di danneggiare l&#39;arteria. </li><li> Utilizzando una multa forbici, fare un&#39;incisione nella parete addominale ventrale. </li><li> Utilizzando un paio di forbici a molla, fare un&#39;incisione nel muscolo retto addominale. Rimuovere un segmento x 0,8 centimetri circa 1 cm del muscolo retto addominale con la pelle sovrastante. </li><li> Trasferire il AV femorale, avvolto dal trapianto vascolarizzato, come un lembo assiale, al difetto a tutto spessore nel abdom ventralemuro inale. </li><li> Suturare il lembo di tessuto muscolare circostante, utilizzando 8-0 punti di sutura in seta, per evitare ernia. </li><li> Per evitare di sutura gli organi interni, aumentare il muscolo con una pinza quando la sutura del lembo al muscolo addominale. Lasciare la cute ventrale esposta per simulare l&#39;effetto di una completa difetto della parete addominale. </li><li> Coprire la ferita della pelle con garza iodato e una benda sterile per prevenire la contaminazione della superficie esposta. </li><li> Suturare la pelle della gamba utilizzando 4-0 suture di seta. </li><li> Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall&#39;anestesia e ogni giorno successivo, fino recupero del lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni. </li><li> NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase per evitare la disidratazione del tessuto esposto. </li></ol> 5. Determinazione di Ecografia Vascolare perfusione del Graft NOTA: Prima di trasferimento, la perfusione vascolare of l&#39;innesto viene misurata a una e due settimane dopo l&#39;impianto, con l&#39;ecografia. <ol><li> Anestetizzare il mouse utilizzando 2% isoflurano. </li><li> Posizionare il mouse su una fase mobile riscaldato a 38 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Trova l&#39;arteria e vena vasi femorali con trasduttore non lineare impostata sul B-mode. </li><li> Esaminate la pervietà dei vasi femorali dell&#39;innesto utilizzando il trasduttore impostato sulla modalità colore Doppler. </li><li> Preparare agente non mirato contrasto secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Collegare un catetere vena della coda (12 cm tubo con un ago 27 G) ad una siringa da 1 ml riempito con soluzione fisiologica. Fissare la siringa accanto al mouse sulla fase di riscaldamento (per evitare il movimento della siringa). </li><li> Collegare il catetere alla vena della coda del mouse e fissare l&#39;ago. </li><li> Iniettare alcuni dei salina sia garantire che le iniezioni vengono effettuate in vena e per riempireil tubo con soluzione salina (per evitare bolle d&#39;aria). </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con 70 ml di mezzo di contrasto e sostituire la siringa salina con la siringa agente di contrasto. </li><li> Impostare la ultrasuoni per iniezione immagine del mezzo di contrasto. Nelle proprietà della modalità non lineare impostare il numero di fotogrammi da 1.500 e l&#39;impulso di interruzione 30% delle esposizioni. NOTA: Dopo l&#39;impulso interruzione, le microbolle ri-riempire i vasi ad una velocità che dipende dalla portata delle microbolle nei capillari ed è indipendente dalla velocità di iniezione delle microbolle. Il numero di fotogrammi può essere modificato a seconda del tempo di riempimento 19,20. </li><li> Iniettare lentamente il mezzo di contrasto nella vena della coda. </li><li> Cattura immagini in modalità contrasto non lineare del sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione. </li><li> Analizzare i risultati utilizzando il software, come descritto in precedenza 19,20. <ol><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) sull&#39;immagine ottenuta immediatamente dopo l&#39;impulso interruzione nel contrasto modalità. Il ROI dovrebbe delineare l&#39;area riempita solo dal mezzo di contrasto. </li><li> Calcolare il miglioramento picco (PE), che è il rapporto tra l&#39;intensità media del segnale non lineare dopo l&#39;iniezione delle microbolle contro dopo l&#39;impulso interruzione, ed è una misura del volume di perfusione. </li><li> Calcolare la portata, che è determinato dal tempo (T) che deve trascorrere prima del segnale di picco (P). </li></ol></li></ol> 6. Determinazione della misura di Graft Vascolarizzazione NOTA: Il grado di innesto di tessuto vascolarizzazione è determinata una o due settimane dopo l&#39;impianto. <ol><li> Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g). </li><li> Uso 1 siringa ml, per via endovenosa iniettare 200 ml di 10 mg / isotiocianato-destrano coniugato ml fluoresceina (FITC-destrano, MW = 500.000) nella vena della coda. &lt;/ li&gt; <li> Dieci secondi dopo il completamento dell&#39;iniezione, eutanasia il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Aprire la gamba del mouse e esporre l&#39;innesto. </li><li> Lavare la zona di innesto con tampone fosfato (PBS) e applicare il 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Immagine l&#39;innesto nella gamba del mouse, utilizzando un microscopio confocale. </li><li> Quantificare densità dei vasi funzionale (FVD). <ol><li> Isolare il canale verde (eccitazione = 488 nm) delle immagini microscopiche confocale. </li><li> Passare le immagini risultanti attraverso un filtro passa-alto, per accentuare le strutture ad alto contrasto. </li><li> Utilizzare un filtro despeckling per rimuovere il rumore che potrebbe essere stato amplificato dal filtro passa-alto. </li><li> Impostare il valore di soglia sulla immagine risultante; il valore di soglia è regolata in modo che le caratteristiche e le strutture dell&#39;immagine originale sono visibili nell&#39;immagine binaria. </li><li> Applicare una size-soglia in modo che solo i gruppi di pixel connessi più grandi del siz definitae soglia rimangono nell&#39;immagine binaria. </li><li> Delineare lo scheletro dei vasi del trapianto utilizzando l&#39;algoritmo di Zhang-Suen 21. </li><li> Calcolare il FVD sommando le lunghezze della linea mediana di ciascun recipiente e dividendo il risultato per l&#39;area della ROI. </li></ol></li></ol> 7. immunoistologica e istologica colorazione della Graft <ol><li> Colorazione immunoistologico <ol><li> Dopo confocale, recuperare il trapianto utilizzando un piccolo forbici e pinze. Sezionare i vasi AV nelle due estremità dell&#39;innesto e recuperare l&#39;innesto. </li><li> Fissare gli innesti nel 10% formalina tamponata neutra per 30 minuti - 2 ore. </li><li> Posizionare gli innesti in cassette istologia e conservare in etanolo al 70% fino a paraffina. </li><li> Incorpora in paraffina utilizzando una fissazione standard incorporare il protocollo 22 e affettare le paraffina tessuti in 5 micron fette utilizzando un microtomo. Tagliate tutto il tessuto perpendicolarmente al AVvasi. </li><li> Deparaffinare sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte, per 10 minuti ciascuno. </li><li> Disponete le diapositive di una da 250 ml di plastica vaschetta Coplin. </li><li> Reidratare per immersioni seriali in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% e acqua bidistillata (DDW)) per 3 minuti ciascuno. </li><li> Preparare la soluzione smascheramento dell&#39;antigene diluendo 2,35 ml di soluzione di smascheramento dell&#39;antigene con 250 ml di DDW. Riscaldare la soluzione antigene smascheramento per 2 minuti in un forno impostato a 95 ° C. </li><li> Inserire i vetrini nella soluzione di antigene smascheramento preriscaldata e riscaldare di nuovo per 3 minuti in un forno a microonde impostato a 95 ° C. Raffreddare i vetrini a 50 ° C. </li><li> Riscaldare di nuovo per 2 minuti e poi raffreddare a RT. </li><li> Incubare i vetrini in 3,3% H 2 O 2 soluzione in metanolo per 10 minuti, a temperatura ambiente per estinguere l&#39;attività di perossidasi endogena e quindi risciacquare due volte in PBS. </li><li> Preparare una camera di incubazione: posto abso bagnatofogli rbent all&#39;interno di una scatola di istologia e asciugare le diapositive usando tergicristalli compito delicato. </li><li> Circle l&#39;area della sezione sul vetrino utilizzando una penna idrofobico e incubare per 30 min a temperatura ambiente, con circa 50 ml di siero di capra una soluzione bloccante (2%, preparato in PBS) per fetta. </li><li> Diluire il coniglio anti-CD31 anticorpo 1:50 in soluzione bloccante, applicare circa il 50 microlitri anticorpo per fetta e incubare O / N, a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Diluire la capra biotinilato anti-coniglio anticorpo secondario 1: 400 in PBS, posto sopra scivoli circa 50 ml di anticorpi per fetta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Diluire streptavidina-perossidasi 1: 400 in PBS, applicare circa 50 microlitri per fetta e incubare con vetrini per 30 minuti, a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Applicare circa 50 ml di aminoethylcarbazole (AEC) substrato per fetta, secondo il produttore &amp; #8217; s istruzioni. Immergere i vetrini in DDW per arrestare la reazione. </li><li> Stain i nuclei in blu immergendo sezioni in circa 50 ml di soluzione di ematossilina di Mayer per 2 min. Lavare delicatamente in acqua e poi coprire le sezioni con mezzo di montaggio. </li><li> Quantificare CD31-positivo colorazione utilizzando un approccio a doppio cieco. CD31 colorazione appare come una macchia marrone. Scegliere 4-5 campi differenti in un campo visivo di ingrandimento 40X sotto un microscopio binoculare. Contare il numero di lumen CD31-positivo. <ol><li> Calcolare il numero medio di lumen CD31-positive per scaffold dividendo il numero totale di lumen contato con il numero di campi e fieldarea (secondo i dati binoculare). NOTA: Il volume di reagente applicato deve essere sufficiente a coprire l&#39;intera fetta delineato. </li></ol></li></ol></li><li> Colorazione istologica <ol><li> Fissare innesti nel 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Innesti Incorpora in paraffina utilizzando le normalifissazione e le procedure di incorporamento. </li><li> Rimuovere la paraffina dalle sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte per 10 min. </li><li> Lavaggio rapido due volte per la reidratazione in 100% di isopropanolo. </li><li> Lavaggio rapido due volte il 95% di etanolo. </li><li> Lavare tre volte in acqua di rubinetto. </li><li> Immergere in ematossilina per 10 min. </li><li> Lavare tre volte in acqua di rubinetto. </li><li> Immere in Eosina per 2 min. </li><li> Lavaggio rapido disidratare in etanolo al 95% due volte. </li><li> Veloce lavaggio 100% di isopropanolo due volte. </li><li> Veloce lavaggio 100% xilene due volte. </li><li> Coprire con colla DPX con vetro di copertura spessore di 1,5 mm. </li><li> Immagine utilizzando microscopio in 40X di ingrandimento. </li></ol></li></ol> 8. Proprietà meccaniche Assessment <ol><li> Recuperare l&#39;innesto con un piccolo forbici e pinze. </li><li> Sciacquare il trapianto in PBS. </li><li> Misurare la larghezza e lo spessore dell&#39;innesto e calcolare l&#39;area della sezione trasversale come larghezza moltiplicato per lo spessore. </li><li> Noivia e lo strumento di prova per generare una curva sforzo-deformazione degli innesti idrati. <ol><li> Montare l&#39;innesto tra le impugnature di trazione del sistema e misurare la lunghezza finale tra le due impugnature (ad esempio, lunghezza iniziale). </li><li> Applicare una velocità di deformazione di 0,01 mm / sec, fino alla rottura. </li><li> Registrare la forza sviluppata e lo spostamento utilizzando il protocollo del produttore. </li><li> Generare una curva sforzo-deformazione in Matlab. <ol><li> Calcolare ceppo secondo spostamento diviso per la lunghezza iniziale. Lo stress è calcolata come la forza misurata divisa per l&#39;area della sezione trasversale. </li><li> Determinare rigidità come la pendenza lineare regione nella curva sforzo-deformazione e il punto di massimo della curva è la resistenza a trazione. </li></ol></li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infarct+stabilization+and+neovascularization+mediated+by+VEGF-loaded+PEGylated+fibrinogen+hydrogel+in+a+rodent+myocardial+infarction+model.">Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model.</a> Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).</li><li>Nillesen, S. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+angiogenesis+in+acellular+scaffolds+by+combined+release+of+FGF2+and+VEGF.">Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF.</a> J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).</li><li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fabrication+of+functional+three-dimensional+tissues+with+perfusable+blood+vessels.">In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels.</a> Nat Commun. 4, 1399 (2013).</li><li>Tee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+engineered+cardiac+muscle+flaps+in+syngeneic+rats.">Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats.</a> Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).</li><li>Morritt, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering+in+an+in+vivo+vascularized+chamber.">Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber.</a> Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

I progressi in ingegneria dei tessuti sono stati raggiunti con una crescente domanda per i tessuti sostitutivi per la ricostruzione dei vari tipi di tessuto. Una varietà di sintesi 1,17,18 e biologici 14-16 materiali, nonché i metodi di fabbricazione sono stati valutati per la loro capacità di far fronte a queste esigenze. Tuttavia, nonostante i progressi nella cura clinica e in ingegneria dei tessuti, il restauro di difetti della parete addominale a tutto spessore rimane una sfida. Un tessuto a...

Difetti della parete addominale spesso sorgono a seguito di traumi gravi, il trattamento del cancro, le ustioni e la rimozione della rete infetti. Questi difetti spesso comportano una significativa perdita di tessuto, che richiedono procedure chirurgiche complesse e la presentazione di una grande sfida per i chirurghi plastici di ricostruzione 1-4. Ricercatori di ingegneria dei tessuti alla ricerca di nuove fonti per i tessuti artificiali hanno esplorato diversi materiali, fonti di cellule e fattori di crescita. Restauri positivo di vari tessuti, come trachea 5,6, vescica 7, cornea 8, 9 e osso pelle 10, per impiantazione di tessuti ingegnerizzati sono stati segnalati in precedenza. Tuttavia, la fabbricazione di uno spesso ingegneria tessutale vascolarizzato, in particolare per la ricostruzione di grandi difetti, rimane una sfida significativa in ingegneria dei tessuti. Uno dei principali fattori limitanti lo spessore di un costrutto tessuto vitale è il controllo dell&#39;alimentazione di ossigeno ad suoi svantaggicellule tituent. Quando basandosi sulla diffusione, costruire spessore è limitato a quello di uno strato molto sottile. La distanza massima tra ossigeno e nutrienti capillari fornitura in vivo è di circa 200 micron, che è correlato con il limite diffusione dell&#39;ossigeno 11,12. Vascolarizzazione insufficiente può provocare ischemia tissutale e aumentare al riassorbimento del tessuto o necrosi 13. Inoltre, il materiale ideale utilizzato per la ricostruzione del tessuto deve essere biocompatibile e non immunogenica. Deve anche essere in grado di promuovere una maggiore integrazione di cellule ospiti con il biomateriale, e mantenendo l&#39;integrità strutturale. Vari biologici 14-16 e sintetiche 1,17,18 matrici sono stati precedentemente esplorati per la ricostruzione dei tessuti, ma il loro uso rimane limitato a causa della mancanza di afflusso di sangue efficace, infezioni o la forza del tessuto insufficiente. In questo studio, un biocompatibile, cell-embimpalcatura edded composto da Food and Drug Administration (FDA) l&#39;acido L-lattico poli -approvato (PLLA) / poli acido lattico-co-glicolico (PLGA), è stato impiantato intorno all&#39;arteria femorale e vena (AV) le navi di un topo nudo e separato dal tessuto circostante, assicurando vascolarizzazione solo dai vasi AV. Una settimana dopo l&#39;impianto, l&#39;innesto è stato vitale, denso e ben vascolarizzato. Questo tessuto vascolarizzato spessore con vasi AV, è stato poi trasferito come lembo peduncolato un difetto a tutto spessore addominale nel mouse stesso. Una settimana dopo il trasferimento, il lembo era praticabile, vascolarizzato e ben integrato con il tessuto circostante, tenendo forza sufficiente a sostenere visceri addominali. Così, la spessa, lembo di tessuto vascolarizzato ingegneria, recanti un peduncolo autologo, presenta un nuovo metodo per la riparazione di difetti della parete addominale a tutto spessore.

<table><tbody><tr><td>small fine straight scissors</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>spring scissors</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>straight forceps with fine tip</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>serrated forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Small vessel cauterizer&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>5686</td><td></td></tr><tr><td>Sedaxylan</td><td>Euravet</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>Clorketam 1000</td><td>Vetoquinol</td><td>4A0726B</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>4-0 silk sutures</td><td>Assut sutures</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>6-0 polypropylene sutures</td><td>Assut sutures</td><td>9351F</td><td></td></tr><tr><td>8-0 silk sutures</td><td>Assut sutures</td><td>684568</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe (6 mm needle)</td><td>BD</td><td>324911</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 high-resolution ultrasound system</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 non-linear transducer</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromarker non-targeted contrast agent</td><td>VisualSonics inc.</td><td>VS-11694</td><td></td></tr><tr><td>tail vein catheter</td><td>VisualSonics inc.</td><td>VS-11912</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 software</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran</td><td>Sigma</td><td>FD500S</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>antigen unmasking solution</td><td>Vector laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-peroxidase</td><td>Jackson&amp;nbsp;</td><td>016-030-084</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&#039;s hamatoxylin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS-16</td><td></td></tr><tr><td>aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit</td><td>Life technologies, Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>00-2007</td><td></td></tr><tr><td>Vectamount</td><td>Vector laboratories</td><td>H-5501</td><td></td></tr></tbody></table>

engineered vascularized muscle flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

Vascolarizzazione del trapianto e la perfusione in vivo Gli innesti sono stati impiantati una o due settimane prima del loro trasferimento come lembi assiali. A uno e due settimane dopo l&#39;impianto, l&#39;osservazione al lordo della zona dell&#39;innesto rivelato innesti di tessuto vitali e vascolarizzate. Questi innesti dimostrato di essere altamente vascolarizzati, come determinato mediante immunocolorazione CD31 positivo (Figura 1A) e altamente perfuso, come e...

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Engineered Vascularized Muscle Flap

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.2K Views.  Kaplan Medical Center. To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps. 

Video: Engineered Vascularized Muscle Flap

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Ricerca

Bioingegneria

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Model of Free Tissue Transfer: The Rat Epigastric Free Flap

Free tissue transfer has been increasingly used in clinical practice since the 1970s, allowing reconstruction of complex and otherwise untreatable defects resulting from tumor extirpation, trauma, infections, malformations or burns. Free flaps are particularly useful for reconstructing highly complex anatomical regions, like those of the head and neck, the hand, the foot and the perineum. Moreover, basic and translational research in the area of free tissue transfer is of great clinical potential. Notwithstanding, surgical trainees and researchers are frequently deterred from using microsurgical models of tissue transfer, due to lack of information regarding the technical aspects involved in the operative procedures. The aim of this paper is to present the steps required to transfer a fasciocutaneous epigastric free flap to the neck in the rat.
This flap is based on the superficial epigastric artery and vein, which originates from and drain into the femoral artery and vein, respectively. On average the caliber of the superficial epigastric vein is 0.6 to 0.8 mm, contrasting with the 0.3 to 0.5 mm of the superficial epigastric artery. Histologically, the flap is a composite block of tissues, containing skin (epidermis and dermis), a layer of fat tissue (panniculus adiposus), a layer of striated muscle (panniculus carnosus), and a layer of loose areolar tissue.
Succinctly, the epigastric flap is raised on its pedicle vessels that are then anastomosed to the external jugular vein and to the carotid artery on the ventral surface of the rat's neck. According to our experience, this model guarantees the complete survival of approximately 70 to 80% of epigastric flaps transferred to the neck region. The flap can be evaluated whenever needed by visual inspection. Hence, the authors believe this is a good experimental model for microsurgical research and training.

This paper describes the steps required to raise a fasciocutaneous epigastric free flap and transfer it to the neck in the rat.

Un modello di trasferimento del tessuto libero: The Rat Epigastrica libero Flap

Free tissue transfer has been increasingly used in clinical practice since the 1970s, allowing reconstruction of complex and otherwise untreatable defects ...

Medicina

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, failed by the first steps of the reconstructive ladder. Despite promising aesthetic and functional outcomes, the main limiting factor remains the need for a drastically applied lifelong immunosuppression and its well-known medical risks, preventing broader indications. Therefore, lifting the immune barrier in VCA is essential to tip the ethical scale and improve patients&#39; quality of life using the most advanced surgical techniques. De novo creation of a patient-specific graft is the upcoming breakthrough in reconstructive transplantation. Using tissue engineering techniques, VCAs can be freed of donor cells and customized for the recipient through perfusion-decellularization-recellularization. To develop these new technologies, a large-scale animal VCA model is necessary. Hence, swine fascio-cutaneous flaps, composed of skin, fat, fascia, and vessels, represent an ideal model for preliminary studies in VCA. Nevertheless, most VCA models described in the literature include muscle and bone. This work reports&#160;a reliable and reproducible technique for saphenous fascio-cutaneous flap harvest in swine, a practical tool for various research fields, especially vascularized composite tissue engineering.

The present protocol describes the porcine fascio-cutaneous flap model and its potential use in vascularized composite tissue research.

Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

Porcino come un modulo di formazione per ricostruzione microvascolare del collo e testa

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modificato Eterotopic Hindarto Osteomyocutaneo flap modello nel ratto per traslazionale vascolarizzazione composito Allotransplantazione ricerca

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

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