Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Preparação de lamelas de vidro <ol><li> Esterilizar 12 mm de diâmetro redondo lamelas de vidro por imersão em etanol a 70% durante pelo menos 10 minutos com agitação ocasional para garantir a exposição total de todas as lamelas para o etanol. Despeje lamelas de vidro e etanol em uma cultura de células estéril prato (ou 6 centímetros ou 10 cm de diâmetro). </li><li> Com um par de fórceps estéreis finas 5B, pegar e colocar cada lamela de vidro indivíduo em um poço de uma placa de aglomerado 24. Ter o cuidado de assegurar que as lamelas não tocam as paredes do poço e está aproximadamente no meio do poço. </li><li> Deixe a placa de aglomerado coberto de un 24 com lamelas de vidro para secar no gabinete do fluxo. Isso leva cerca de 10 min </li><li> Durante este período, a preparação da mistura de revestimento por diluição de 10 mg / ml de f ibronectina humana em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) a 0,1 mg / ml. </li><li> Quando as lamelas estão secos, pipetas 100 ml de solução de revestimento sobre cada co vidroverslip então a solução abrange apenas o vidro sem agrupamento em torno do lado de fora do poço. Colocar a placa de 24 poços aglomerado coberto numa incubadora de cultura de células durante pelo menos uma hora. </li><li> Imediatamente antes da utilização, remover a solução de revestimento. A mesma solução de revestimento pode ser transferido para um tubo esterilizado e usado até três vezes sem perda visível de eficácia. </li></ol> 2. Preparação da monocamada de células endoteliais <ol><li> Culturas de células endoteliais de artérias coronárias humanas (CE) em meio a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono. </li><li> Aspirar off meios de cultura e lavar monocamada CE com 10 ml HBSS </li><li> Aspirar off HBSS e adicionar 2 ml de 0,5% de tripsina, a solução de EDTA 0,2%. Incubar à temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min. </li><li> Quando CE pode ser deslocada por uma torneira para a parede lateral do balão, adicionar 5 ml de inibidor de tripsina de soja e com pipeta esguichar a superfície do frasco para desalojar as células mais. </li><li> Transferência de células para um tubo de 15 ml e centrifugar o tuboa 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de CE de meios de comunicação. Contar as células com um hemocitómetro e ajustar a concentração de células a 50.000 CE por ml de meio de CE. </li><li> Pipetar 1 mL da suspensão de células em cada poço da placa de 24 poços contendo lamelas de vidro revestidas. Incubar as células S / N na incubadora de cultura de células a 37 ° C, mais 5% de dióxido de carbono. </li><li> As células estão prontas para utilização em experiências em que uma monocamada confluente é formado, no prazo de 3 dias. </li></ol> 3. Preparação de monócitos <ol><li> Transferir células HL-60 que são cultivadas em RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, como cultura em suspensão, para um tubo de 15 ml. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio e ajustar a concentração de células com meios para 2 milhões de células / ml. Se marcação por fluorescência do HL-60 for desejada, ressuspender as células em meio RPMI sem soro e proceed conforme descrito na seção 4. </li><li> Adicionar 0,5 ml de células HL-60 suspensão de células em cada poço da placa de 24 poços contendo monocamadas de cluster CE e incubar a placa numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono durante um período fixo de tempo escolhido entre 1 e 3 h. Pouca diferença é observada entre 1 hora e 3 horas de tempo de ponto, onde a saturação de ligação é atingido. </li><li> Prepare-se para celular lavar / colheita: Encha um tubo de 120 ml com 100 ml de HBSS. Pipetar 1 mL de formalina em cada poço de uma nova placa de 24 poços. </li><li> Após o período de incubação, use um par de fórceps cortantes e pegar a lamela de vidro do bem e mantenha a lamela vertical e bata levemente na borda da lamela em um pedaço de tecido no banco durante 3 segundos, tomando cuidado para não tocar na coberto de superfície celular da lamela com o tecido. </li><li> Segurando a lamela firmemente com um par de fórceps, enterrar a lamela dentro e fora dos HBSS cinco vezes. </li><li> Após o quinto enterradaem HBSS, alisar a borda da lamela sobre o tecido durante 3 seg. </li><li> Repita os procedimentos descritos dunking e enxugando em 3,6 e 3,7, perfazendo um total de três grupos de cinco enterradas seguido por uma pincelada. </li><li> Transferir a lamela num poço contendo formalina a 10% para fixar as células à temperatura ambiente. A lamela está pronto para enumeração, para armazenamento a longo prazo ou pode ser submetido a outros processos descritos a seguir. </li></ol> 4. Rotulagem de células HL-60 com Rastreador de celular (opcional) <ol><li> Contagem e transferir a quantidade apropriada de células HL-60 (por exemplo, 10 milhões) para um tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar células HL-60 a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em Rastreio celular em meio RPMI sem soro para uma concentração de 1 milhão de células / ml. Incubar as células em cultura de célula incubadora durante 1 h. </li><li> Centrifugar células a 200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em meio a uma concentração de 2 milhões de cells / ml. </li><li> Adicionar 0,5 ml de Rastreio celular marcado com HL-60 a cada poço contendo as células endoteliais cultivadas em lamelas de vidro. Continue em 3,3. </li></ol> 5. Contagem de Células Endoteliais adesiva <ol><li> Mount lamelas em lâminas de microscópio com DAPI contra-mancha para identificar células individuais. </li><li> Usando um microscópio invertido com um objetivo 4X ou 10X, adquirir imagens de diversas áreas (por exemplo, 5 campos) e contar o maior número de monócitos que agregam em células endoteliais un irradiado (Isso deve ser tipicamente 3-5). </li><li> Definir duas vezes esse número como o limiar de monócitos em uma célula endotelial ser que definido como um cluster. Se necessário, um critério diferente pode ser usado para definir um conjunto de acordo com a natureza da experimentação. </li><li> Contar o número de grupos e o número de células endoteliais no campo. Dividir a primeira pela segunda para obter a percentagem de células endoteliais adesivas. Pontonumerosos campos para obter uma média e desvio padrão das contagens. </li></ol> 6. contracoloração com Antibodies <ol><li> Após o ensaio de adesão de células e sobre a lamela ter sido fixada em formalina a 10% durante 15 min à TA, sujeitar as lamelas a imunofluorescência, utilizando um processo padrão de 10 e anticorpos de escolha. </li><li> Adicionar e remover as várias soluções muito cuidado para evitar a retirada monócitos que estão ligados às células endoteliais. </li></ol> 7. contracoloração para-associado Senescence Beta-galactosidase Atividade <ol><li> Após o ensaio de adesão de células e sobre a lamela ter sido fixada em formalina durante 15 minutos, a mancha para actividade beta-galactosidase associada a senescência, como descrito nas instruções que acompanham o kit de coloração. Adicionar e remover as várias soluções muito cuidado para evitar a retirada monócitos que estão ligados às células endoteliais. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de adesão de monócitos descrita acima foi utilizada com sucesso em experiências concebidas para estudar os efeitos biológicos da radiação ionizante sobre monocamadas endoteliais 10. Embora isto não é o único método disponível para avaliar a aderência de uma monocamada endotelial, é o único método que permite a quantificação da proporção ou a percentagem de células endoteliais no interior de uma monocamada que é adesiva. Esta é uma distinção importante como uma alteração quantitativa global na adesão de monócitos, conforme medido por outros métodos pode ser atribuído quer a um aumento geral na adesividade de todas as células da monocamada endotelial ou para o aumento da adesividade de uma sub-população de células endoteliais no interior da monocamada, tal como mostrado no exemplo acima. O valor de ter esta informação é exemplificada pelo facto de que a capacidade de quantificar a percentagem de células endoteliais que exibiram adesividade aumentada após a irradiação conduziu aos inescapaz conclusão de que este efeito não é devido a uma mutação genética de um gene particular como a percentagem de células que estavam adesiva eram muito acima (mais de 1000 vezes mais) do que seria de esperar de mutação aleatória de um gene por raios-X em que doses . O factor que permite uma boa reprodutibilidade dos resultados é o regime de lavagem. À medida que o processo de lavagem envolve a imersão da lamela de vidro para o tampão de lavagem seguido por esfregando sobre um tecido, a variabilidade no tampão de turbulência que resulta inevitavelmente a partir do método antigo de pipetagem da solução de lavagem dentro de um poço é evitada. Na verdade, foi a observação da variabilidade excessiva entre repetições obtidos usando o método de pipetagem que nos obrigou a elaborar um procedimento de lavagem que removeu o elemento variabilidade da etapa de lavagem. É certo que as limitações desta mentira ensaio na necessidade de proceder a contagem manual de clusters de monócitos, o que fazer not permitir que ele seja adaptado para análises de elevado rendimento. Em segundo lugar, a decisão sobre quantas monócitos constituem um cluster tem de ser determinado semi-arbitrariamente eo nível pode ser muito alto e resultar na exclusão de alguns grupos genuínos. A falta de força de cisalhamento neste método também pode ser visto como uma limitação em experiências nas quais é induzida grosseiramente aumentada adesividade de células endoteliais (por exemplo, TNFa +). Em outras situações, no entanto, a ausência de força de corte é uma vantagem, uma vez que permite a detecção do aumento da adesividade menos exagerada. Aumento modesto em monócitos adesividade pode ser particularmente importante e relevante. In vivo, monócitos não seria (em um tempo experimental típico) ser esperado para anexar em grande número às células endoteliais com modesto aumento na adesividade, em grande parte devido à força de cisalhamento. Em vez no entanto, alguns monócitos provavelmente faria, e isso é mais provável para representar o ambiente de inflamação crónica. Como tal,a ausência de força de cisalhamento pode ser uma vantagem, pois proporciona a oportunidade para que pequenos aumentos na adesividade de células endoteliais a ser revelado em prazos experimentais que são tipicamente curto e, possivelmente, demasiado fugaz para permitir modesto aumento na adesividade a ser observado sob tensão de cisalhamento. A capacidade de sujeitar as células após este ensaio para outras análises, tais como ensaio de senescência e imunofluorescência aumenta a utilidade deste método uma vez que permite a associação de adesividade de células endoteliais específicos para proteínas celulares particulares ou estados celulares tal como demonstrado acima, uma característica que não se encontra disponível com os ensaios de adesão mais velhos. Este método tem sido utilizado com células endoteliais coronárias humanas imortalizadas EST2 e resultados semelhantes também foram obtidos com células endoteliais coronárias humanas primárias 10, demonstrando que não é específico para apenas uma linha de células particular. Além disso, o ADOPÇÃO deste método de ensaio de aderência de células endoteliais não se opõem sujeitando as mesmas células para o ensaio de adesão padrão que mede a fluorescência de imunócitos rotulados. Juntos, este relatório demonstra que este método é versátil, inclusiva e fornece muito mais informações do que o ensaio de adesão padrão.

A infiltração de células imunes tais como os monócitos através da camada de células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos é um passo importante no processo de inflamação 1. Isto permite que o homing de células imunitárias (imunócitos) para um local da lesão. Em outros casos, e locais, tais como a artéria coronária e artéria carótida, infiltração de monócitos através da camada endotelial pode conduzir à residência indesejável longo prazo destas células da parede da artéria, o que pode conduzir à formação de placas 2. Em todos os casos de imunocï¿½tica infiltração, o primeiro passo envolve a activação das células endoteliais numa região localizada do vaso sanguíneo. As células endoteliais são activados por citoquinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-6 para aumentar a expressão de proteínas da superfície celular, tais como VCAM, ICAM e E-selectina que facilitam o recrutamento e fixação dos imunócitos sobre a superfície da célula endotelial 3- 6. 7. As limitações deste método em termos de precisão levou à utilização de linfócitos marcados com rádio ou monócito, seguido por quantificação de material radioactivo, que corresponde aos linfócitos ou monócitos adesão 4. Este método foi eventualmente substituída por um método baseado em fluorescência, em que imunócitos de interesse foram marcadas com corante fluorescente e submetidos ao mesmo procedimento tal como acima, com a diferença de que em vez de fluorescência é medida de radioactividade 8. Presentemente este método tem emergido como a mais conveniente e é vendido na forma de kit por vários fornecedores comerciais. Embora este ensaio pode medir os níveis relativos de adesividade entre os controlos e amostras experimentais, não revela se uma alteração na fluorescência é devido a uma modificação uniforme ao longo de toda a adesividade endothelial população de células ou se a mudança se deve a uma diferença de adesividade dentro de uma sub-população de células. É também evidente que o rigor da lavagem exerce um efeito profundo sobre o resultado, e mais importante ainda, a uniformidade de enxaguar monócitos não ligadas entre diferentes monocamadas de células endoteliais será de grande impacto sobre a proximidade dos resultados de repetições e reprodutibilidade dos resultados entre as amostras . Mais recentemente, vários sistemas que bombeiam monócitos em meio através de uma monocamada de células endoteliais foram utilizadas para resolver este problema 9. Além disso, estes sistemas de fluxo também recapitular o efeito da força de corte sobre as células endoteliais. Enquanto as vantagens de tais sistemas são muito clara e atraente, também é importante perceber que, apesar de adesividade de células endoteliais pode ser grandemente aumentada, como é o caso na inflamação aguda, por factores, tais como o TNFa, alguns outros activadores, tais como radiação ionizante 10 elicit muda tchapéu não são prontamente detectado in vitro dentro de intervalos de tempo experimentais por estes sistemas muito rigorosas. Embora estas alterações de adesividade de células endoteliais minutos são facilmente perdido ou rejeitado na vitro, não é necessariamente benignos in vivo, em que essas pequenas mudanças dentro de um tempo de vida, o que é característico de inflamação crónica, pode exercer resultados muito significativos. Assim, um método robusto, mas sensível e específico para detectar e medir a aderência de células endoteliais é necessária. Aqui, nós relatamos um método para medir a aderência de células endoteliais diretamente. Este método não se baseia na medição de fluorescência como indicador substituto indirecta de adesividade de células endoteliais. Revela se as mudanças na adesividade são devido a alteração uniforme em todas as células ou confinados a uma sub-população. Além disso, ele permite a co-coloração de células endoteliais com marcadores, tais como beta-galactosidase associada a senescência, a viabilidade celular Marker, Calcien AM e anticorpos contra as proteínas da superfície celular e intracelulares, que permitem a associação de células endoteliais adesivos individuais para certos estados de células ou a expressão de proteínas específicas.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Um dos processos principais da inflamação é a infiltração de células imunitárias do lúmen do vaso sanguíneo para o tecido circundante. Isto ocorre quando as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos, tornam-se adesivas para células imunes circulantes, tais como monócitos. In vitro, a medição da adesividade tem até agora sido feito através da quantificação do número total de monócitos que aderem a uma camada endotelial, quer como uma contagem directa ou indirecta por medição da fluorescência de monócitos aderentes. Embora tais medições indicam a adesividade média da população de células endoteliais, que são confundidos por um número de factores, tais como o número de células, e não revelam a proporção de células endoteliais que são realmente adesiva. Aqui descrevemos e demonstrar um método que permite a enumeração de células adesivas dentro de uma população testada de monocamada endotelial. As células endoteliais são cultivadas em lamelas de vidro e seguindo o desejartratamento são desafiados com monócitos (que pode ser marcado de forma fluorescente). Após a incubação, um procedimento de enxaguamento, que envolve múltiplos ciclos de imersão e secagem, as células são fixadas. Células endoteliais adesivas, que são rodeadas pelos monócitos são prontamente identificados e enumerados, dando um índice de adesão que revela a percentagem real de células endoteliais dentro da população que são adesiva.

Este método permite a detecção de células endoteliais adesivos individuais dentro de uma população. Por exemplo, enquanto que uma monocamada de células endoteliais irradiadas com un retidas algumas esporádicos HL-60 de monócitos após a incubação e lavagem, monocamada endotelial aos 7 dias pós-irradiação 10Gy antes da incubação com os monócitos foram ligados por monócitos em agregados em torno de células endoteliais individuais ( Figura 1). Embora esse fenômeno pode ser facilmente observado sob microscopia de contraste de fase, microscopia de fluorescência revela uma imagem mais clara dos clusters de monócitos. Depois de realizar o ensaio de ades descrito, é possível proceder a coloração das células para a membrana, citoplasmática ou nuclear (Figura 2) as proteínas utilizando anticorpos apropriados com métodos de imunofluorescência standard. Além disso, o ensaio com base em enzima, tal como associada a senescência da beta-galactosidase (Figura 3) também pode ser PErformed. Uma vez que cada conjunto de monócitos corresponde a um indivíduo de células endoteliais, enumeração dos aglomerados vai revelar o número real de células endoteliais adesivas dentro da monocamada (Figura 4), ​​e, consequentemente, a percentagem de células endoteliais adesivas dentro da população (Tabela 1, Figura 6) . Este é o único método que permite que até à data, tais quantificação da aderência de células endoteliais. Vale ressaltar que as células endoteliais utilizados nos experimentos aqui são inibidas por contato e não aumentam em número depois de atingir confluência. Isto elimina a complexidade potenciais ocasionados por aumento do número de células endoteliais em pontos de tempo posteriores. Se desejado, os monócitos ligados a monocamadas endoteliais pode ser deslocada por uma solução de tripsina-EDTA a 0,2% a 0,5% (em vez de fixação em 3,9) e a sua fluorescência medida utilizando um leitor de placas, como é o caso nos métodos contemporâneos (Figura 5). </p&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figura 1. A adesão de monócitos na monocamada de células endoteliais. Em células endoteliais un irradiado, monócitos aderidos como células individuais de uma forma esporádica e aleatória (painéis da esquerda) e em cachos sobre as células endoteliais individuais dos 7 dias pós-10 Gy irradiados monocamada (painéis da direita). Painéis inferiores são imagens de fluorescência dos painéis de topo, confirmando que as pequenas e brilhantes células esféricas visíveis sob contraste de fase são, de facto monócitos que foram pré-marcadas com celular-Tracker Green. Alguns dos aglomerados de monócitos são indicados por setas brancas. As imagens foram tiradas com uma objetiva de 10X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figura 2. Coloração de células endoteliais para o ensaio de proteínas pós-adesão. Depois de realizar o ensaio de ades descrito, as células nas lamelas de vidro foram sujeitas a imunof luorescência para a detecção da (A), proteína de membrana (CD44), b) proteína citoplasmática (Tubulina) ou c) proteína nuclear (γ-H2AX). Painéis esquerdo de (A) e (B) (visto com objectiva de 20x) mostrar monócitos pré-marcado com celular Rastreio de verde e a imagem semelhante nos painéis direitos revelar CD44 e microtúbulos (vermelho) e DAPI núcleos corados (azul). Setas brancas em (C) Ponto de núcleos de células endoteliais irradiados que foram coradas com anticorpos contra γ-H2AX. Núcleos de monócitos, os quais são coradas por azul brilhante um DAPI são facilmente distinguidos dos núcleos de forma oval das células endoteliais. As imagens foram tomadas com objetivo 20X.<html> &quot;target =&quot; _ blank jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figura 3. A senescência associada-beta-galactosidase de coloração de células endoteliais. Após ensaio de adesão, as células em lamelas foram submetidas a coloração associada à senescência para a beta-galactosidase, que faz com que os lisossomas de células senescentes a ficar azul, como é evidente na célula endotelial que é selectivamente ligada por numerosos monócitos, que são facilmente identificados devido ao seu pequeno tamanho e forma esférica. Imagem vista através objetivo 20X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Enumeração de aglomerados de monócitos nas células endoteliais individuais. Após ensaio de adesão, as imagens das células foram tomadas a partir de várias posições diferentes e aglomerados de monócitos identificados e circulado (a verde). Um conjunto foi definida como um aglomerado de 10 ou mais monócitos em uma célula endotelial. O número de clusters de monócitos e número de 12 dias células endoteliais pós-irradiados (pontilhada em vermelho) na imagem foram contadas ea percentagem de células endoteliais aderentes calculados conforme demonstrado na Tabela 1. Imagem tomada através objetiva de 10X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figura 5. A quantificação da fluorescência de monócitos aderentes. Seguindo Adhe<html> sion ensaio, as células em lamelas de vidro foram tripsinizadas e a fluorescência de monócitos pré-marcado com CellTracker verde foi medida, utilizando um leitor de placas de fluorescência, como um indicador indirecto da adesividade da monocamada endotelial. Os resultados de tais medições em dias determinados pós-irradiação foram obtidos e tecendo no gráfico acima. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figura 6. Representação das contagens de ensaio de adesão de células endoteliais Tabela 1. O adesivo em cinco locais diferentes em três lamelas de vidro foram marcados, tal como descrito na Figura 4 e os resultados tabulados acima demonstram que 12 dias após a irradiação com 10 Gy, 8 a 10 por cento de irradiado células endoteliais tornou-se adesivo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Percentagem de adesivo células endoteliais </td></tr><tr><td></td><td> Disco 1 </td><td> Disco 2 </td><td> Disco 3 </td></tr><tr><td> O campo 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> O campo 2 </td><td> 10,44 </td><td> 7,27 </td><td> 7,21 </td></tr><tr><td> Campo 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> O campo 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7,09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Campo 5 </td><td> 10,55 </td><td> 9.4 </td><td> 11,61 </td></tr><tr><td> Média </td><td> 10,07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. escores de ensaio de aderência. Células endoteliais adesivas em cinco locais diferentes em três lamelas de vidro foram marcados como descrito no Figura 4 e os resultados tabulados acima demonstram que 12 dias após a irradiação com 10 Gy, 8 a 10 por cento de células endoteliais irradiados tornou-se adesivo.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K visualizações.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioengenharia

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Imunologia e Infecção

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

A quantificação da Adesividade celular endotelial

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