Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Herstellung von Deckgläsern <ol><li> Sterilisieren, 12 mm Durchmesser Runddeckgläser durch Einweichen in 70% Ethanol für mindestens 10 Minuten unter gelegentlichem Rühren auf Gesamtengagement aller Deckgläser an den Ethanol zu gewährleisten. Gießen Sie Deckgläser und Ethanol in einen sterilen Zellkulturschale (entweder 6 cm oder 10 cm Durchmesser). </li><li> Mit einem Paar von sterilen feinen Pinzette 5B, abholen und legen jedes einzelne Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Clusterplatte. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser sind nicht die Seiten der gut zu berühren und sind etwa in der Mitte des Brunnens. </li><li> Verlassen Sie die un-überdachte 24 Clusterplatte mit Deckgläsern in der Flussschrank trocknen. Dieser Vorgang dauert ca. 10 min </li><li> Während dieser Zeit bereiten die Beschichtungsmischung durch Verdünnen von 10 mg / ml humanem Fibronectin in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit 0,1 mg / ml. </li><li> Wenn die Deckgläser trocken sind, Pipette 100 ul Beschichtungslösung auf jedes Glas Coverslip so dass die Lösung nur den Glas ohne Bündelung auf der Außenseite der Wanne. Legen Sie die überdachte 24 Clusterplatte in einem Zellkulturbrutschrank für mindestens eine Stunde. </li><li> Kurz vor der Verwendung das Beschichtungslösung. Die gleiche Beschichtungslösung kann in ein steriles Röhrchen überführt und bis zu dreimal ohne sichtbaren Verlust der Wirksamkeit verwendet werden. </li></ol> 2. Herstellung von endothelialen Zellschicht <ol><li> Kultur menschlicher Koronararterien-Endothelzellen (EC) in Medium bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid. </li><li> Absaugen Kulturmedien und spülen EC-Monoschicht mit 10 ml HBSS </li><li> Absaugen HBSS und 2 ml 0,5% Trypsin, 0,2% EDTA-Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für ca. 5 min. </li><li> Bei EC kann durch einen Wasserhahn an der Seite des Kolbens verdrängt werden 5 ml Sojabohnen-Trypsininhibitor und mit Pipette spritzen die Oberfläche der Kolben weiter zu verdrängen die Zellen. </li><li> Transfer Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr und das Rohrbei 200 · g für 5 min. </li><li> Absaugen des Überstandes und Resuspendieren der EC Pellet in 5 ml Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zellkonzentration zu 50.000 EC pro ml EC Medien. </li><li> Verzichtet werden 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der 24 Well-Platte mit beschichteten Deckgläser. Zellen O / N in Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid. </li><li> Die Zellen sind bereit für den Einsatz in Experimenten, wenn ein konfluenter Monolayer gebildet wird, innerhalb von 3 Tagen. </li></ol> 3. Herstellung von Monozyten <ol><li> Übertragen HL-60-Zellen, die in RPMI kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum, als Suspensionskultur in eine 15 ml Röhre. Zentrifugieren der Zellen bei 200 g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 5 ml Medium und stellen Sie die Zellkonzentration mit Medien zu 2 Millionen Zellen / ml. Wenn die Fluoreszenzmarkierung der HL-60 erwünscht ist, Resuspendieren der Zellen in RPMI ohne Serum und proceed, wie in Kapitel 4 beschrieben. </li><li> 0,5 ml von HL-60-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Clusterplatte, die EC-Monoschicht und Inkubieren der Platte in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid für eine gewählte feste Zeitperiode zwischen 1 und 3 hr. Kaum einen Unterschied zwischen 1 Stunde und 3 Stunden Zeitpunkt, an dem Bindungssättigung erreicht wird beobachtet. </li><li> Bereiten Sie sich auf Zellwasch / Ernte: Füllen Sie einen 120-ml-Tube mit 100 ml HBSS. Dispense 1 ml Formalin in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen frisch. </li><li> Nach der Inkubationszeit, verwenden Sie ein Paar scharfe Pinzette und holen sich das Deckglas aus dem Brunnen und halten Sie die Deck vertikalen und tupfen Sie den Rand des Deckglases auf einem Stück Gewebe auf der Bank für 3 Sekunden, dabei nicht zur Note Zelle bedeckten Oberfläche des Deckglases mit dem Gewebe. </li><li> Halten Sie das Deckglas fest mit einer Zange, tauchen sie das Deckglas in die und aus den HBSS fünfmal. </li><li> Nach dem fünften dunkin HBSS, dab die Kante des Deckglases auf dem Gewebe für 3 sec. </li><li> Wiederholen Sie die in 3.6 und 3.7 beschrieben Dunking und Abtupfen Verfahren, so dass insgesamt drei Sätze von 5 Dunks, gefolgt von einem DAB. </li><li> Übertragen der Deck in eine Vertiefung, die 10% Formalin, um die Zellen bei Raumtemperatur zu fixieren. Das Deckglas ist bereit für Aufzählung für langfristige Lagerung oder zu anderen nachfolgend beschriebenen Verfahren unterzogen werden. </li></ol> 4. Kennzeichnung von HL-60-Zellen mit Zell Tracker (optional) <ol><li> Zählen und übertragen entsprechende Menge an HL-60-Zellen (beispielsweise 10 Millionen) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge HL-60-Zellen bei 200 g für 5 min. Überstand entfernen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in Cell Tracker in RPMI-Medium ohne Serum in einer Konzentration von 1 Million Zellen / ml. Zellen in Zellkulturbrutschrank für 1 Stunde. </li><li> Centrifuge Zellen bei 200 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Zellpellet in Medium auf eine Konzentration von 2 Mio cEllen / ml. </li><li> 0,5 ml der Zell Tracker-markierten HL-60 in jede Vertiefung enthält Endothelzellen auf Deckglas aufgewachsen. Weiterhin bei 3,3. </li></ol> 5. Enumeration von Adhesive Endothelzellen <ol><li> Berg Deckgläser auf Objektträger mit DAPI Gegenfärbung, einzelne Zellen zu identifizieren. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop mit einer 4X oder 10X-Objektiv erwerben Bilder aus mehreren Feldern (zB 5-Felder) und zähle die höchste Anzahl von Monozyten, die auf nicht-bestrahlte Endothelzellen aggregieren (Dies sollte in der Regel 3-5 sein). </li><li> Stellen Sie zweimal diese Zahl als die Schwelle von Monozyten auf Endothelzellen zu werden, dass als Cluster definiert. Falls erforderlich, kann ein anderes Kriterium für die Definition eines Clusters je nach Art des Experiments verwendet werden. </li><li> Zählen die Anzahl der Cluster und die Anzahl der Endothelzellen in dem Feld. Unterteilen den ersteren durch den letzteren, um den Prozentsatz von Klebstoff endothelialen Zellen zu erhalten. Ergebniszahlreichen Bereichen, um einen Mittelwert und Standardabweichung der Grafen zu erhalten. </li></ol> 6. Gegenfärbung mit Antikörpern <ol><li> Nachdem der Adhäsionstest und Zellen auf dem Deckglas in 10% Formalin für 15 min bei RT fixiert worden ist, zu unterwerfen, die Deckgläser der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Standardverfahren 10 und Antikörper der Wahl. </li><li> Hinzufügen und die verschiedenen Lösungen zu entfernen sehr vorsichtig, um zu vermeiden, verdrängen Monozyten, die gebunden sind an Endothelzellen. </li></ol> 7. Gegenfärbung für Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase-Aktivität <ol><li> Nachdem der Adhäsionstest und Zellen auf dem Deckglas in Formalin für 15 min Färbung für Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase-Aktivität fest, wie in den Anweisungen, die Färbekit begleiten beschrieben. Hinzufügen und die verschiedenen Lösungen zu entfernen sehr vorsichtig, um zu vermeiden, verdrängen Monozyten, die gebunden sind an Endothelzellen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die oben beschriebene Monozytenadhäsion Assay wurde erfolgreich in Experimenten entwickelt, um die biologischen Wirkungen von ionisierender Strahlung auf endothelialen Monoschichten 10 Studie verwendet. Obwohl dies nicht die einzige Methode zur Verfügung, um die Haftfähigkeit einer endothelialen Monoschicht zu bewerten, ist es das einzige Verfahren, das die Quantifizierung der Anteil oder Prozentsatz der Endothelzellen in einer Monoschicht, die Klebemittel ermöglicht. Dies ist ein wichtiger Unterschied, als globale quantitative Änderung der Haftung der Monozyten kann durch andere Methoden gemessen, entweder auf eine allgemeine Erhöhung der Haftfähigkeit aller Zellen der endothelialen Monoschicht oder auf die Erhöhung Haftfähigkeit einer Teilpopulation von Endothelzellen zurückzuführen in der Monoschicht, wie im obigen Beispiel gezeigt. Der Wert der mit diesen Daten wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass die Fähigkeit der Anteil der Endothelzellen, die eine verbesserte Haftfähigkeit zeigte quantifizieren nach Bestrahlung führte zu den inesfähig Schlussfolgerung, dass dieser Effekt nicht auf genetische Mutation eines bestimmten Gens als der Prozentsatz von Zellen, die Klebstoff waren, waren wesentlich höher (mehr als 1000-mal mehr), was aus zufälligen Mutation eines Gens durch Röntgenstrahlung bei dieser Dosis zu erwarten wäre, . Der Faktor, der eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht, ist die Waschregime. Als Waschverfahren beinhaltet das Eintauchen des Glasdeckglases in Waschpuffer, gefolgt von Abtupfen auf einem Gewebe, wird die Variabilität in der Puffer Turbulenz, die zwangsläufig entsteht aus der alten Methode der Zugabe der Waschpuffer in ein Bohrloch vermieden. Tatsächlich war es die Beobachtung der übermäßigen Variabilität zwischen Wiederholungen mit der Pipettierverfahren die uns gezwungen, einen Waschvorgang, der die Variabilität Element aus dem Waschschritt entfernt ersinnen erhalten. Zugegeben, die Grenzen dieses Tests liegen in der Notwendigkeit zur Durchführung von manuellen Zählung der Monozyten-Cluster, die n tunot damit sie angepasst werden für die Hochdurchsatzanalysen. Zweitens hat die Entscheidung darüber, wie viele Monozyten bilden ein Cluster bis halb willkürlich festgelegt werden und der Pegel zu hoch eingestellt und führen zum Ausschluss von einigen echten Cluster werden. Der Mangel an Schubkraft in diesem Verfahren kann auch als eine Beschränkung in Experimenten, in denen grob verbesserte Haftfähigkeit von Endothelzellen induziert (zB + TNFa) betrachtet werden. In anderen Situationen ist jedoch die mangelnde Scherkraft ein Vorteil, da es den Nachweis von weniger triebene Steigerung des Haftvermögens ermöglicht. Moderaten Anstieg der Monozyten Haftfähigkeit besonders wichtig und relevant sein. In vivo würde Monozyten nicht (in einer typischen Versuchszeit) erwartet, in großer Zahl anzubringen, um Zellen mit moderaten Anstieg der Haftfähigkeit, vor allem aufgrund einer Scherkraft endotheliale werden. In der Zeit jedoch würden wahrscheinlich einen Monozyten, und dies ist eher die Umgebung der chronischen Entzündung dar. Als solche,die Abwesenheit von Scherkraft kann ein Vorteil sein, da es die Möglichkeit bietet geringen Anstieg des endothelialen Zellhaftfähigkeit in Versuchszeitrahmen, die typischerweise kurz und möglicherweise zu flüchtig, um zu ermöglichen bescheidene Erhöhung der Haftfähigkeit unter Scherbeanspruchung beobachtet werden offenbart werden. Die Fähigkeit, die Zellen nach diesem Test zu anderen Analysen wie Seneszenz Assays und Immunfluoreszenz-Färbung unterwerfen erhöht die Nützlichkeit dieses Verfahrens, wie es erlaubt die Assoziation von Haft spezifischer Endothelzellen an bestimmten zellulären Proteinen oder Zellzuständen, wie oben gezeigt, eine Funktion, die ist nicht verfügbar, mit den älteren Adhäsionsassays. Dieses Verfahren wurde mit est2 immortalisierte menschliche koronare Endothelzellen und ähnlichen Ergebnissen verwendet wurden auch mit primären menschlichen Koronar-Endothelzellen 10 erhalten, was zeigt, dass es nicht spezifisch für nur eine bestimmte Zelllinie. Auch die adoption dieses Verfahren zum Testen der Haftfähigkeit Endothelzellen nicht entgegenWerfen der gleichen Zellen auf die Standard Adhäsionsassay die Fluoreszenz von markiertem Immunzellen mißt. Gemeinsam dieser Bericht zeigt, dass diese Methode ist vielseitig, inclusive und bietet viel mehr Informationen als die Standard Adhäsionsassay.

Infiltration von Immunzellen, wie Monozyten durch die endotheliale Zellschicht, die Blutgefäße auskleiden, ist ein wichtiger Schritt im Entzündungsprozess 1. Dies ermöglicht die Referenzierung von Immunzellen (Immunzellen) zu einem Ort der Verletzung. In anderen Fällen und Orten wie der koronaren Arterie und Carotis Arterie kann die Infiltration von Monozyten durch Endothel um das unerwünschte langfristiger Aufenthalt dieser Zellen in die Wand der Arterie führen, was möglicherweise zur Bildung von Plaques 2 führt. In allen Fällen der Immunozyt Infiltration, beinhaltet der erste Schritt der Aktivierung der Endothelzellen in einem lokalisierten Bereich des Blutgefäßes. Endothelzellen werden durch proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-6, um die Expression von Zelloberflächenproteinen, wie VCAM, ICAM und E-Selectin, welche die Einstellung und Befestigung des Immunozyten auf die Endothelzelloberfläche 3- erleichtern erhöhen aktivierten 6. 7 endotheliale halten durchgeführt. Die Grenzen dieses Verfahrens in Bezug auf Genauigkeit führte zur Verwendung von radioaktiv markierten Lymphozyten oder Monozyten, gefolgt von Quantifizierung der radioaktiven Materials, das Lymphozyten oder Monozyten Adhäsion 4 entspricht. Dieses Verfahren wurde schließlich durch eine auf Fluoreszenz basierende Methode, wobei die Immunozyten von Interesse wurden mit Fluoreszenzfarbstoff, wie oben mit dem Unterschied, dass die Fluoreszenz anstelle von Radioaktivität markiert und mit demselben Verfahren gemessen, 8 ersetzt. Derzeit ist diese Methode als die bequemste entstanden und wird als Bausatz von mehreren kommerziellen Anbietern vertrieben. Während dieser Assay relativen Grade der Haft zwischen Kontrollen und Versuchsproben zu messen, ist es nicht erkennen, ob eine Veränderung der Fluoreszenz ist auf eine gleichmäßige Veränderung der Haftfähigkeit über die gesamte Endothelial Zellpopulation oder wenn die Änderung auf Grund einer Differenz des Haftvermögens innerhalb einer Subpopulation von Zellen. Es ist auch offensichtlich, dass die Stringenz der Wasch übt einen großen Einfluss auf das Ergebnis, und was noch wichtiger ist, wird die Gleichförmigkeit der Abspülen ungebundenen Monozyten zwischen verschiedenen Endothelzell-Monoschichten stark vom Grad der Übereinstimmung der Ergebnisse von Wiederholungsversuchen und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den Proben auswirken . In jüngerer Zeit mehrere Systeme, die Monozyten auf eine endotheliale Zellschicht Pumpe in Medien wurden verwendet, um dieses Problem anzugehen 9. Darüber hinaus sind diese Flusssysteme die Wirkung der Scherkraft auf den Endothelzellen rekapitulieren auch. Während die Vorteile dieser Systeme sind klar und sehr attraktiv ist, ist es auch wichtig zu erkennen, dass, während endothelialen Zellhaftfähigkeit kann stark erhöht werden, wie es bei akuten Entzündungen der Fall ist, die durch Faktoren wie TNF &amp; einigen anderen Aktivatoren, wie ionisierende Strahlung 10 entlocken ändert that nicht ohne weiteres in in vitro Versuchszeitrahmen von diesen sehr strengen Systemen erkannt. Während solche kurzfristigen Änderungen der endothelialen Zellhaftfähigkeit nicht leicht zu entdecken oder in vitro entlassen, ist es nicht in vivo, wenn diese kleinen Änderungen innerhalb eines Lebenszeit, die charakteristisch für die chronische Entzündung ist, kann auch Resultate ausüben notwendigerweise gutartig. Daher ist eine robuste und zugleich empfindliche und spezifische Verfahren zum Nachweis und zur Messung von Endothelzellen Klebrigkeit erforderlich ist. Hier berichten wir ein Verfahren zur Haftfähigkeit der Endothelzellen direkt zu messen. Dieses Verfahren hängt nicht von der Fluoreszenzmessung angewiesen als indirekter Indikator Surrogat endothelialer Zellhaftfähigkeit. Es offenbart, ob Änderungen in Haftfähigkeit durch einheitliche Änderung in allen Zellen oder zu einer Teilpopulation beschränkt sind. Ferner ermöglicht es co-Färbung von Endothelzellen mit Markern wie Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase, die Lebensfähigkeit der Zellen marker, Calcien AM und Antikörper gegen Zelloberfläche und intrazellulären Proteinen, so dass die Zuordnung der einzelnen Klebstoff Endothelzellen an bestimmte Zellzustände oder Expression spezifischer Proteine.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Einen der wesentlichen Prozesse der Entzündung ist die Infiltration von Immunzellen aus dem Lumen des Blutgefäßes zu dem umgebenden Gewebe. Dies geschieht, wenn Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, werden Klebstoff auf zirkulierenden Immunzellen, wie Monozyten. In vitro-Messung der Haftfestigkeit wurde bis jetzt durch die Quantifizierung der Zahl der Monozyten, die einer Endothelschicht haften entweder als direkte Zählung geschehen oder durch indirekte Messung der Fluoreszenz der anhaftenden Monozyten. Während solche Maße tun gibt die durchschnittliche Haftfestigkeit der endothelialen Zellpopulation, werden sie von einer Reihe von Faktoren, wie beispielsweise Zellzahl verwechselt werden, und der Anteil der Endothelzellen, die tatsächlich Klebstoff nicht verraten. Hier beschreiben wir und zeigen ein Verfahren, das die Zählung von Haftzellen innerhalb eines Versuchspopulation der endothelialen Monoschicht ermöglicht. Endothelzellen werden auf Deckgläsern gezüchtet und nach WunschBehandlung mit Monozyten in Frage gestellt (das fluoreszenzmarkierte werden kann). Nach der Inkubation einer Spülprozedur, die mehrere Runden des Eintauchens und Entleeren werden die Zellen fixiert. Klebstoff Endothelzellen, die durch Monozyten, umgeben sind, leicht identifiziert und aufgezählt, so dass eine Haftindex, den tatsächlichen Anteil der Endothelzellen in der Population, die Klebe, offenbart.

Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis von einzelnen Klebstoff Endothelzellen innerhalb einer Population. Während beispielsweise eine Monoschicht von nicht-bestrahlten Endothelzellen beibehalten einige sporadische HL-60-Monozyten nach Inkubation und Waschen, endothelialen Monoschicht nach 7 Tagen post-10Gy Bestrahlung vor der Inkubation mit Monozyten wurden durch Monozyten in Clustern um einzelne Endothelzellen gebunden ( Abbildung 1). Obwohl dieses Phänomen ist unter Phasenkontrastmikroskopie leicht beobachtbar, Fluoreszenzmikroskopie zeigt ein noch klareres Bild von den Monozyten-Clustern. Nach Durchführung des beschriebenen Adhäsionstest, ist es möglich, bis zu Färbung der Zellen für Membran cytoplasmatische oder Kern (Abbildung 2) von Proteinen unter Verwendung geeigneter Antikörper, die mit Standard-Immunfluoreszenz-Methoden vorgehen. Weiterhin kann enzymbasierten Assay wie Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase (Figur 3) auch sein performed. Da jeder Monozyten Cluster entspricht einem einzelnen Endothelzellen wird Aufzählung der Cluster die tatsächliche Anzahl der Klebe Endothelzellen in der Monoschicht zeigen (Figur 4) und somit der Klebstoffanteil Endothelzellen innerhalb der Population (Tabelle 1, Abbildung 6) . Dies ist die einzige Methode, um Datum, wie die Quantifizierung von endothelialen Zellhaftfähigkeit ermöglicht. Es ist bemerkenswert, dass die Endothelzellen in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten kontaktinhibiert und nicht in Reihe nach dem Erreichen Konfluenz erhöhen. Das beseitigt das Komplexität durch erhöhte endotheliale Zellzahl zu späteren Zeitpunkten gestellt. Falls gewünscht, kann Monozyten an Endothelzellen-Monoschichten angebracht um 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung, 0,2% (statt Fixierung 3.9) abgelöst werden und deren Fluoreszenz gemessen unter Verwendung eines Plattenlesegeräts, wie es in der zeitgenössischen Methoden der Fall ist (Abbildung 5). </p&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Abbildung 1. Adhäsion von Monozyten an Monoschicht von Endothelzellen. Auf nicht-bestrahlte Endothelzellen, Monozyten als Einzelzellen in einer sporadischen und zufällige Weise (linke Felder) und in Clustern auf einzelnen Endothelzellen der 7 Tage nach 10 Gy bestrahlten geklebt Monoschicht (rechte Bilder). Lower Panels sind Fluoreszenzbilder der oberen Platten, die bestätigt, dass die kleinen und hellen Kugelzellen unter Phasenkontrast sichtbar sind in der Tat Monozyten, die mit den Cell-Tracker-Grün vor, markiert waren. Einige der Monozyten Cluster sind durch weiße Pfeile angedeutet. Bilder wurden unter Verwendung eines 10X-Objektiv genommen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Abbildung 2. Färbung der Endothelzellen für Proteine ​​post-Adhäsionsassay. Nach Durchführung des beschriebenen Adhäsionstest Zellen an den Deckgläsern wurden einer für den Nachweis von (A) Membranprotein (CD44) Immunfluoreszenz, b) cytoplasmatische Protein (Tubulin) oder c) Kernprotein (γ-H2AX). Linke Felder aus (A) und (B) (mit 20x-Objektiv gesehen) mit Handy Tracker Grün und dem ähnlichen Bild auf der rechten Panels zeigen Monozyten vormarkiert offenbaren CD44 und Mikrotubuli (rot) und DAPI-gefärbten Zellkernen (blau). Weiße Pfeile in (C) zeigen Sie bestrahlten Endothelzellen-Kerne, die mit Antikörpern gegen γ-H2AX färbt wurden. Monozyten-Kerne, die ein helleres Blau durch DAPI gefärbt sind, werden leicht von den oval geformten Kernen der Endothelzellen aus. Die Bilder wurden mit 20x-Objektiv genommen.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Abbildung 3. Seneszenz-assoziierte beta-Galaktosidase-Färbung von Endothelzellen. Nach Adhäsionsassay, Zellen auf Deckgläsern wurden Färbung für Seneszenz-assoziierte beta-Galactosidase, die Lysosomen von alternden Zellen zu blau verursacht unterzogen, wie sich in den Endothelzellen, dass wird selektiv durch zahlreiche Monozyten, die leicht identifiziert werden aufgrund ihrer geringen Grße und Kugelform gebunden. Bild durch 20X Ziel gesehen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Bestimmung von Monozyten Clustern einzelner Endothelzellen. Nach Adhäsionsassay, Bilder der Zellen wurden aus verschiedenen Positionen und Monozyten-Cluster identifiziert sind, und eingekreist (grün). Ein Cluster als eine Agglomeration von 10 oder mehr Monozyten auf einer Endothelzelle definiert. Die Anzahl der Monozyten-Cluster und Anzahl von 12 Tagen nach der bestrahlten Endothelzellen (Dotted in rot) im Bild wurden gezählt und der Prozentsatz der adhärenten Endothelzellen berechnet, wie in Tabelle 1. Bild durch 10X-Objektiv genommen gezeigt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Abbildung 5. Quantifizierung der Fluoreszenz von adhärenten Monozyten. Nach adhe<html> sion Assay Zellen auf Deckgläsern wurden mit Trypsin behandelt und die Fluoreszenz der Monozyten voretikettierten mit Celltracker Grün wurde gemessen, wobei ein Fluoreszenz-Plattenlesegeräts, als indirekter Indikator für die Haftfähigkeit der endothelialen Monoschicht. Die Ergebnisse aus diesen Messungen zu festgesetzten Tage nach der Bestrahlung wurden erhalten und flochten in der Grafik oben. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Abbildung 6. Darstellung der Adhäsionstest Scores aus Tabelle 1. Klebstoff Endothelzellen in fünf verschiedenen Stellen auf drei Glasdeckgläser wurden wie in Figur 4 beschrieben, und die obigen Ergebnisse zeigen, dass 12 Tage nach 10 Gy Bestrahlung, 8 bis 10 Prozent der bestrahlten tabellarisch erzielte Endothelzellen wurde Klebstoff. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Prozentsatz der Klebstoff Endothelzellen </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disc 3 </td></tr><tr><td> Feld 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Feld 2 </td><td> 10,44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Feld 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Feld 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Feld 5 </td><td> 10,55 </td><td> 9.4 </td><td> 11,61 </td></tr><tr><td> Durchschnitt </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Adhesion Assay Partituren. Adhesive Endothelzellen in fünf verschiedenen Standorten auf drei Deckgläser wurden wie in F beschrieben hatBBILDUNG 4 und die obigen Ergebnisse zeigen, dass 12 Tage nach 10 Gy Bestrahlung, 8 bis 10 Prozent der bestrahlten Endothelzellen wurde Klebstoff tabelliert.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Aufrufe.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Serie: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Forschung

Biotechnik

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Immunologie und Infektion

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit

Zusammenfassung

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