Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. إعداد coverslips الزجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم 12 ملم coverslips الزجاج قطر التي نقع عليها في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة على الأقل مع الإثارة في بعض الأحيان لضمان التعرض الكلي لجميع coverslips إلى الإيثانول. صب coverslips الزجاج والايثانول في طبق خلية ثقافة عقيمة (إما 6 سم أو 10 سم القطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من معقمة غرامة 5B ملقط، والتقاط ووضع كل ساترة الزجاج الفردية في بئر من 24 لوحة العنقودية بشكل جيد. الحرص على ضمان لل coverslips لا تلامس جوانب البئر وما يقرب من في منتصف البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحة المغطاة الامم المتحدة 24 عنقودية بشكل جيد مع coverslips الزجاج لتجف في مجلس الوزراء التدفق. وهذا يستغرق حوالي 10 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الفترة، وإعداد مزيج الطلاء عن طريق تمييع 10 ملغ / مل فبرونيكتين الإنسان في المتوازن محلول الملح هانك (HBSS) إلى 0.1 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون لل coverslips الجافة، ماصة 100 ميكرولتر من محلول طلاء على كل الزجاج المشتركverslip ذلك الحل لا يغطي سوى الزجاج دون تجمع نحو الخارج من البئر. وضع لوحة غطت 24 عنقودية جيدا في حاضنة الثقافة خلية لمدة ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الاستعمال، وإزالة حل طلاء. يمكن نقل الحل طلاء نفسه إلى أنبوب معقم واستخدام ما يصل الى ثلاث مرات مع عدم فقدان مرئية من الفعالية. </li></ol> 2. إعداد البطانية أحادي الطبقة خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة الإنسانية الشريان البطانية (EC) في المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من وسائل الإعلام والثقافة، وشطف EC أحادي الطبقة مع 10 مل HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة HBSS وإضافة 2 مل 0.5٪ التربسين، 0.2٪ محلول EDTA. في احتضان RT لمدة 5 دقائق تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما EC يمكن إقصاؤه من خلال الصنبور إلى جانب القارورة، إضافة 5 مل من فول الصويا مثبط التربسين ومع ماصة بخ سطح القارورة لزيادة إزاحة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في أنبوبفي 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من طاف و resuspend بيليه EC في 5 مل من وسائل الإعلام. عد الخلايا مع haemocytometer وضبط تركيز الخلية إلى 50000 EC لكل مل من EC سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 مل من تعليق خلية في كل بئر من 24 لوحة جيدا تحتوي على coverslips الزجاج المطلي. احتضان خلايا O / N في ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا جاهزة للاستخدام في التجارب عندما يتم تشكيل أحادي الطبقة متموجة، في غضون 3 أيام. </li></ol> 3. إعداد وحيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل HL-60 الخلايا التي يتم تربيتها في RPMI تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، والثقافة التعليق في أنبوب 15ML. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل وسائل الإعلام وضبط تركيز الخلية مع وسائل الإعلام إلى 2 مليون خلية / مل. إذا كان المطلوب وضع العلامات مضان من HL-60، resuspend الخلايا في RPMI دون المصل والعلاقات العامةoceed كما هو موضح في قسم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من HL-60 تعليق خلية في كل بئر من لوحة 24 عنقودية كذلك تحتوي EC أحادي الطبقة واحتضان لوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة محددة من الزمن اختار ما بين 1 و 3 ساعة. ويلاحظ فارق كبير بين 1 ساعة و 3 ساعة الوقت نقطة، حيث بلغ التشبع ملزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير للخلية غسل / حصاد: ملء أنبوب 120 مل مع 100 مل من HBSS. الاستغناء 1 مل من الفورمالين في كل بئر من 24 لوحة جديدة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، واستخدام زوج من الملقط حادة والتقاط ساترة الزجاج من البئر وعقد ساترة رأسي والداب حافة ساترة على قطعة من النسيج على مقاعد البدلاء لمدة 3 ثانية، مع الحرص على عدم لمس السطح المغطاة خلية من ساترة مع الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ساترة بحزم مع زوج من ملقط، دونك ساترة ويخرجون من HBSS خمس مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد دونك الخامسفي HBSS، الداب حافة ساترة على الأنسجة لمدة 3 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الإجراءات التغميس واللمس هو موضح في 3.6 و 3.7، مما يجعل ما مجموعه ثلاث مجموعات من 5 يغمس تليها لمسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ساترة إلى تحتوي أيضا 10٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا في RT. ساترة جاهزة للتعداد، للتخزين طويل الأجل أو أن تخضع لإجراءات أخرى هو موضح أدناه. </li></ol> 4. وسمها HL-60 الخلايا مع المقتفي الخليوي (اختياري) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد ونقل كمية مناسبة من HL-60 الخلايا (على سبيل المثال، 10 مليون دولار) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الطرد المركزي HL-60 الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلية resuspend في تعقب خلية في RPMI وسائل الإعلام دون المصل في تركيز 1 مليون خلية / مل. احتضان الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. بيليه الخلية resuspend في وسائل الإعلام إلى التركيز من 2000000 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من المسمى تعقب خلية HL-60 إلى تحتوي كل منها على جانب الخلايا البطانية التي تزرع على الزجاج ساترة. تواصل في 3.3. </li></ol> 5. تعداد الخلايا البطانية لاصق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل coverslips على شرائح المجهر مع دابي مكافحة وصمة عار لتحديد الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب مع الهدف 4X أو 10X، والحصول على صور العديد من المجالات (على سبيل المثال، 5 الحقول) والاعتماد على أعلى عدد من وحيدات التي تجمع على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع (يجب أن يكون هذا عادة 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مرتين هذا العدد كما عتبة حيدات على خلية البطانية أن أن يعرف بأنه كتلة. إذا لزم الأمر، معيارا مختلفا يمكن استخدامها لتحديد كتلة تبعا لطبيعة التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الكتل وعدد من الخلايا البطانية في هذا المجال. تقسيم الأولى قبل الأخير للحصول على نسبة الخلايا البطانية لاصقة. أحرز هدفاالعديد من المجالات للحصول على انحراف متوسط ​​و المستوى من التهم الموجهة إليه. </li></ol> 6. Counterstaining مع الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في 10٪ من الفورمالين لمدة 15 دقيقة في RT، تخضع لل coverslips إلى المناعي باستخدام الإجراء العادي 10 و الأجسام المضادة في الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية. </li></ol> 7. Counterstaining للالمرتبط اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز آخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في الفورمالين لمدة 15 دقيقة، وصمة عار للنشاط بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة كما هو موضح في التعليمات التي تصاحب عدة تلطيخ. إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تم استخدام فحص الوحيدات التصاق المذكورة أعلاه بنجاح في التجارب تهدف إلى دراسة التأثيرات البيولوجية للإشعاع المؤين على الطبقات الوحيدة البطانية 10. على الرغم من أن هذا ليس هو الأسلوب الوحيد المتاح لتقييم الإلتصاق من أحادي الطبقة البطانية، وهو الأسلوب الوحيد الذي يسمح الكمي لنسبة أو نسبة الخلايا البطانية في أحادي الطبقة التي هي لاصقة. هذا تمييز مهم كتغيير الكمي عالميا في التصاق حيدات، كما تم قياسها عن طريق وسائل أخرى يمكن أن تعزى إما إلى الارتفاع العام في الإلتصاق جميع خلايا أحادي الطبقة البطانية أو إلى زيادة الإلتصاق من السكان الفرعي من الخلايا البطانية ضمن أحادي الطبقة، كما هو موضح في المثال أعلاه. ويتمثل قيمة وجود هذه المعلومات من خلال حقيقة أن القدرة لقياس نسبة الخلايا البطانية التي عرضت تعزيز الإلتصاق بعد التشعيع أدى إلى إيناسوكانت النتيجة قادر أن هذا التأثير لا يعود إلى طفرة جينية من الجين على نحو خاص والنسبة المئوية للخلايا التي كانت لاصقة جدا فوق (أكثر من 1000 مرة) ما هو متوقع من طفرة عشوائية من الجينات التي كتبها X-الإشعاع عند هذه الجرعة . العامل الذي يسمح استنساخ جيدة من النتائج هو نظام الغسيل. كما ينطوي على إجراء الغسيل غمر ساترة الزجاج في غسل العازلة تليها اللمس على الأنسجة، ويتم تجنب التقلبات في الاضطرابات العازلة التي تنشأ حتما من الطريقة القديمة المتمثلة في pipetting لمن غسل العازلة في بئر. في الواقع كان مراقبة التقلبات المفرطة بين مكررات تم الحصول عليها باستخدام أسلوب pipetting لأن أجبرتنا على وضع إجراءات الغسل أن إزالة عنصر التباين من خطوة الغسيل. باعتراف الجميع، والقيود المفروضة على هذا الاختبار تكمن في الحاجة إلى إجراء العد اليدوي لمجموعات الوحيدات، والتي لا نبعد التمديد يسمح لها أن تتكيف لتحليل إنتاجية عالية. ثانيا، قرار بشأن كيفية تشكل العديد من وحيدات مجموعة أن تحدد شبه تعسفي ويمكن ضبط مستوى عال جدا ويؤدي إلى استبعاد بعض الكتل حقيقية. ويمكن أيضا لعدم وجود قوة القص في هذه الطريقة أن ينظر إليه باعتباره القيد في التجارب التي يسببها الإلتصاق معززة بشكل صارخ من الخلايا البطانية (على سبيل المثال، + TNFα). في حالات أخرى ومع ذلك، فإن عدم وجود قوة القص هي ميزة لأنها تتيح للكشف عن زيادة أقل مبالغ فيه من الإلتصاق. زيادة متواضعة في الوحيدات الإلتصاق يمكن أن تكون ذات أهمية خاصة وذات الصلة. في الجسم الحي، لن (في وقت تجريبي نموذجي) من المتوقع أن نعلق بأعداد كبيرة إلى الخلايا البطانية مع زيادة متواضعة في الإلتصاق، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قوة القص وحيدات. في الوقت ومع ذلك، بعض وحيدات على الارجح، وهذا هو الأرجح لتمثيل البيئة من التهاب مزمن. كما،غياب قوة القص يمكن أن يكون ميزة، حيث أنه يوفر الفرصة لزيادة طفيفة في الإلتصاق الخلايا البطانية ان يعلن في الأطر الزمنية التجريبية التي عادة ما تكون قصيرة، وربما عابرة جدا للسماح زيادة متواضعة في الإلتصاق التي يتعين مراعاتها تحت إجهاد القص. القدرة على إخضاع الخلايا بعد هذا الاختبار إلى تحليلات أخرى مثل فحص الشيخوخة والمناعي تلطيخ يزيد من فائدة هذه الطريقة لأنها تتيح للجمعية الإلتصاق من الخلايا البطانية محددة لخاصة البروتينات الخلوية أو الدول الخلوية كما هو موضح أعلاه، وهي الميزة التي غير متوفر مع فحوصات التصاق القديمة. وقد استخدم هذا الأسلوب مع الخلايا التاجية الإنسان خلد est2 البطانية ونتائج مماثلة تم الحصول عليها أيضا مع الخلايا التاجية الإنسان الأساسية البطانية 10، مما يدل على أنه ليس خاصا فقط خط خلية معينة. أيضا، واللغطption هذه الطريقة من معايرة الإلتصاق من الخلايا البطانية لا يحول دون تعريض الخلايا نفسها لفحص التصاق القياسية التي تقيس مضان من immunocytes المسمى. معا، ويوضح هذا التقرير أن هذه الطريقة هي متعددة وشامل ويوفر المزيد من المعلومات من التصاق الفحص القياسية.

<html> تسلل الخلايا المناعية مثل وحيدات عبر طبقة الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية هو خطوة هامة في عملية الالتهاب 1. وهذا يسمح للصاروخ موجه من الخلايا المناعية (immunocytes) إلى موقع الإصابة. في حالات ومواقع أخرى مثل الشريان التاجي والشريان السباتي، يمكن التسلل من وحيدات من خلال طبقة بطانة يؤدي إلى إقامة غير مرغوبة على المدى الطويل من هذه الخلايا في جدار الشريان، مما قد يؤدي إلى تكوين لويحات 2. في جميع حالات تسلل خلية مناعية، فإن الخطوة الأولى تنطوي على تفعيل الخلايا البطانية في منطقة مترجم من الأوعية الدموية. يتم تنشيط الخلايا البطانية التي كتبها السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل TNF-α و IL-6 لزيادة التعبير عن بروتينات سطح الخلية مثل VCAM، ICAM وE-selectin التي تسهل التوظيف والحجز على immunocytes على سطح الخلايا البطانية 3- 6. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; في البداية، تم إجراء قياس التصاق الخلايا البطانية بها عد حيدات أن تلتزم البطانية أحادي الطبقة 7. وأدت القيود المفروضة على هذه الطريقة من حيث الدقة في استخدام الخلايا اللمفاوية المسمى الراديو أو الوحيدات، تليها الكمي للمواد المشعة والتي تتطابق مع الخلايا الليمفاوية أو وحيدات التصاق 4. هذه الطريقة حلت محلها في نهاية المطاف من خلال طريقة القائم على مضان، حيث وصفت immunocytes في المصالح مع مضان صبغ وتعرض لنفس الإجراء على النحو الوارد أعلاه مع والفرق بينهما أن مضان بدلا من النشاط الإشعاعي يتم قياس 8. في الوقت الحاضر هذا الأسلوب قد برز بوصفه الأكثر ملاءمة ويباع في شكل مجموعة من قبل العديد من الموردين التجارية. في حين أن هذا الفحص يمكن قياس المستويات النسبية للالإلتصاق بين الضوابط والعينات التجريبية، فإنه لا يكشف ما إذا كان هناك تغيير في مضان يرجع ذلك إلى تغيير موحد في الإلتصاق عبر البريد كاملالسكان الخلية ndothelial أو إذا كان التغيير هو بسبب وجود اختلاف في الإلتصاق بين السكان الفرعي من الخلايا. ومن الواضح أيضا أن التشدد في غسل تمارس تأثير عميق على النتيجة، والأهم من ذلك، فإن توحيد الشطف قبالة حيدات غير منضم بين مختلف الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تؤثر بشكل كبير على التقارب في نتائج مكررات واستنساخ النتائج بين العينات . وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام عدة أنظمة التي تضخ حيدات في وسائل الإعلام عبر أحادي الطبقة البطانية خلية لمعالجة هذه المشكلة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النظم تدفق أيضا ألخص تأثير قوة القص على الخلايا البطانية. في حين أن مزايا هذه الأنظمة واضحة وجذابة للغاية، ومن المهم أيضا أن ندرك أنه في حين أن الإلتصاق الخلايا البطانية يمكن زيادتها إلى حد كبير، كما هو الحال في التهاب حاد، بسبب عوامل مثل TNFα، وبعض المنشطات الأخرى، مثل الإشعاع المؤين 10 انتزاع يتغير رلم يتم الكشف عن قبعة بسهولة داخل الإطارات في المختبر الوقت التجريبية من قبل هذه الأنظمة الصارمة جدا. في حين تغييرات في اللحظة هذه من الإلتصاق الخلايا البطانية وغاب بسهولة أو رفضت في المختبر، فإنه ليس بالضرورة حميدة في الجسم الحي، حيث مثل هذه التغييرات الصغيرة في غضون فترة زمنية الحياة، الذي هو سمة من التهاب مزمن، يمكن أن تمارس نتائج كبيرة جدا. وبالتالي وسيلة قوية، ولكن حساسية، ومحددة لكشف وقياس هناك حاجة الإلتصاق الخلايا البطانية. هنا، ونحن التقرير وسيلة لقياس الإلتصاق من الخلايا البطانية مباشرة. هذه الطريقة لا تعتمد على قياس مضان كمؤشر مركب غير مباشر من الإلتصاق الخلايا البطانية. أنه يكشف ما إذا كانت التغييرات في الإلتصاق ومن المقرر أن التغيير موحد في جميع الخلايا أو تقتصر على سكان الفرعي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح شارك في تلطيخ الخلايا البطانية مع علامات مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز، بقاء الخلية مارسكير، Calcien AM والأجسام المضادة ضد سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا، مما يتيح للجمعية الخلايا البطانية لاصقة الفردية لبعض الدول خلية أو التعبير عن بروتينات معينة.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

واحدة من العمليات الأساسية للالتهاب غير تسلل الخلايا المناعية من التجويف من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة بها. يحدث هذا عندما الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية، تصبح لاصقة لتعميم الخلايا المناعية مثل وحيدات. وحتى تم ذلك في المختبر قياس هذا الإلتصاق الآن عن طريق قياس عدد من وحيدات التي تلتزم طبقة بطانة إما العد المباشر أو عن طريق قياس غير مباشر لمضان من حيدات ملتصقة. وفي حين أن هذه القياسات لا تشير إلى متوسط ​​الإلتصاق من السكان الخلايا البطانية، ومرتبك من قبل عدد من العوامل، مثل عدد الخلايا، وعدم الكشف عن نسبة الخلايا البطانية التي هي لاصقة في الواقع. نحن هنا وصف وشرح الطريقة التي تسمح للتعداد خلايا لاصقة داخل الكتلة السكانية اختبار أحادي الطبقة البطانية. تزرع الخلايا البطانية على coverslips الزجاج ويلي المرجوةوتحدى العلاج مع حيدات (التي قد يتم fluorescently المسمى). بعد الحضانة، وإجراء الشطف، التي تنطوي على جولات متعددة من الغمر والصرف الصحي، يتم إصلاح الخلايا. يتم تحديد بسهولة الخلايا البطانية لاصقة، والتي تحيط بها وحيدات وتعداد، وهو ما يعطي مؤشر التصاق أن يكشف عن النسبة الفعلية من الخلايا البطانية في أوساط السكان التي هي لاصقة.

هذا الأسلوب يسمح للكشف عن الخلايا البطانية لاصقة الفردية بين السكان. على سبيل المثال، في حين أحادي الطبقة من الخلايا البطانية-المشع الامم المتحدة احتفظت بضع متفرقة HL-60 حيدات التالية الحضانة والغسل، وأحادي الطبقة البطانية في 7 أيام بعد 10Gy التشعيع قبل الحضانة مع حيدات كان لا بد حيدات في مجموعات حول الخلايا البطانية الفردية ( الشكل 1). على الرغم من أن هذه الظاهرة يمكن ملاحظتها بسهولة في إطار المرحلة النقيض المجهر، المجهر مضان يكشف عن صورة أكثر وضوحا من مجموعات الوحيدات. بعد إجراء الفحص التصاق وصفها، فمن الممكن للشروع في تلطيخ الخلايا لغشاء، حشوية أو الطاقة النووية (الشكل 2) البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المناسبة مع أساليب المناعي القياسية. وعلاوة على ذلك، فحص القائم على انزيم مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز (الشكل 3) يمكن أيضا أن تكون المؤسسة العامةrformed. لأن كل كتلة الوحيدات يتوافق مع خلية البطانية الفردية، وتعداد مجموعات تكشف عن العدد الفعلي للخلايا البطانية لاصقة داخل أحادي الطبقة (الشكل 4)، وبالتالي فإن النسبة المئوية للخلايا البطانية لاصقة داخل السكان (الجدول 1، الشكل 6) . هذه هي الطريقة الوحيدة حتى الآن التي تسمح بمثل هذه الكمي من الإلتصاق الخلايا البطانية. من الجدير بالذكر أن الخلايا البطانية التي استخدمت في التجارب هنا، تحول دون الاتصال ولا تزيد في عدد بعد تحقيق التقاء. هذا يلغي التعقيد المحتمل الذي تشكله زيادة عدد الخلايا البطانية في نقطة زمنية لاحقة. إذا رغبت في ذلك، وحيدات تعلق على الطبقات الوحيدة البطانية يمكن طردت بنسبة 0.5٪ محلول التربسين 0.2٪ EDTA (بدلا من التثبيت في 3.9) ومضان على قياس باستخدام قارئ لوحة، كما هو الحال في الطرق المعاصرة (الشكل 5). </P&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> الشكل 1. التصاق حيدات على أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع، وحيدات التقيد شكل خلايا مستقلة بطريقة متفرقة وعشوائية (لوحات اليسار) وفي مجموعات على الخلايا البطانية الفردية لل7 أيام بعد 10 غراي المشع أحادي الطبقة (لوحات اليمين). لوحات الدنيا هي صور مضان من لوحات العليا، مؤكدا أن خلايا صغيرة ومشرقة كروية مرئية تحت النقيض من المرحلة هي في الواقع حيدات التي وصفت قبل مع الخلية المقتفي الأخضر. وأشار بعض الكتل الوحيدات التي كتبها السهام البيضاء. واتخذت صورة باستخدام الهدف 10X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html><img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> الشكل 2. تلطيخ الخلايا البطانية للبروتينات بعد التصاق الفحص. بعد الانتهاء من فحص التصاق وصفها، وتعرض الخلايا على coverslips الزجاج لالمناعي للكشف عن (A) بروتين الغشاء (CD44)، ب) بروتين حشوية (تويولين) أو ج) البروتين النووي (γ-H2AX). لوحات اليسار من (A) و (B) (شهدت مع الهدف 20X) عرض حيدات وصفت مسبقا مع تعقب خلية الأخضر وصورة مماثلة على لوحات اليمين تكشف CD44 والأنابيب الدقيقة (أحمر) ونوى دابي الملون (الأزرق). السهام البيضاء في (C) نقطة لالمشع نوى الخلايا البطانية التي كانت ملطخة أجسام مضادة ضد γ-H2AX. وتتميز نواة الوحيدات التي هي ملطخة أكثر إشراقا الأزرق التي كتبها دابي بسهولة من بيضاوية الشكل نوى الخلايا البطانية. وقد أخذت صور مع الهدف 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> الرقم 3. المرتبطة اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز تلطيخ الخلايا البطانية بعد التصاق الفحص، وتعرض خلايا coverslips على لتلطيخ للالمرتبط الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز الذي يسبب الجسيمات الحالة خلايا هرمة لتحويل الأزرق، كما هو واضح في الخلية البطانية التي بشكل انتقائي ملزمة من قبل العديد من وحيدات، والتي يتم تحديدها بسهولة نظرا لصغر حجمها وشكلها كروي. الصورة المرئية من خلال الهدف 20X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; الرقم 4. تعداد مجموعات الوحيدات على الخلايا البطانية الفردية. بعد التصاق الفحص، واتخذت صورة من الخلايا من العديد من المواقف المختلفة ومجموعات الوحيدات التي تم تحديدها ودائري (باللون الأخضر). تم تعريف الكتلة باعتبارها التكتل من 10 أو أكثر من وحيدات الخلية على البطانية. احصي عدد الكتل الوحيدات وعدد 12 أيام الخلايا البطانية بعد المشع (منقط باللون الأحمر) في الصورة ونسبة الخلايا البطانية ملتصقة تحسب كما هو مبين في الجدول 1. الصورة مأخوذة من خلال الهدف 10X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> الرقم 5. الكمي لمضان من حيدات ملتصقة. بعد adhe<html> سيون الفحص، تم trypsinised الخلايا على coverslips الزجاج ومضان من حيدات صفت مسبقا مع CellTracker الخضراء وقد تم قياس، وذلك باستخدام قارئ لوحة مضان، كمؤشر غير مباشر من لزوجة أحادي الطبقة البطانية. وقد تم الحصول على نتائج هذه القياسات في الأيام جاء بعد التشعيع وضفروا على الرسم البياني أعلاه. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> الرقم 6. تمثيل عشرات التصاق مقايسة من الجدول 1. وسجل لاصق الخلايا البطانية في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في الشكل (4) والنتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، 8-10 في المئة من المشع أصبحت الخلايا البطانية لاصقة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; نسبة من مادة لاصقة الخلايا البطانية </td></tr><tr><td></td><td> القرص 1 </td><td> القرص 2 </td><td> القرص 3 </td></tr><tr><td> المجال 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> الميدان (2) </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> الحقل 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> الحقل 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> المجال 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> متوسط </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. التصاق عشرات الفحص. وسجل الخلايا البطانية لاصقة في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في Figure 4 ونتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، أصبحت 8 الى 10 في المئة من الخلايا البطانية المشع لاصقة.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Views.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Video: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioengineering

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video