We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

유리 Coverslips는 1. 준비 <ol><li> 에탄올을 모두 커버 슬립의 총 노출을 보장하기 위해 때때로 교반하면서 적어도 10 분 동안 70 % 에탄올에 담가들을 커버 글라스 원형 12mm 직경 소독. 무균 세포 배양 접시에 커버 글라스와 에탄올을 붓고 (중 6cm 또는 10cm 직경). </li><li> 멸균 미세 5B 집게 한 쌍의 픽업과 24 잘 클러스터 판의 우물에 각각의 유리 커버 슬립을 배치합니다. 커버 슬립이 잘의 측면을 감동과 잘의 중간에 약입니다되지 않도록주의하십시오. </li><li> 흐름 캐비닛에 건조 커버 글라스와 유엔 덮인 24 아니라 클러스터 판을 둡니다. 이 약 10 분 소요 </li><li> 이 기간 동안 0.1 ㎎ / ㎖에 행크 평형 염 용액 (HBSS)에 10 ㎎ / ㎖ 인간 피브로넥틴 희석하여 도포 혼합물을 준비한다. </li><li> 커버 슬립은 건조되면, 각 공동 유리 상 코팅 용액 100 μL 피펫그래서 verslip 솔루션은 물론 외부의 주위에 풀링없이 만 유리를 포함한다. 시간 이상 세포 배양 인큐베이터에 덮여 24 잘 클러스터 판을 놓습니다. </li><li> 사용 직전, 코팅 용액을 제거한다. 동일한 코팅 용액은 멸균 튜브에 옮기고 효능의 눈에 보이는 손실이 세 번까지 사용할 수있다. </li></ol> 내피 세포 단일 층의 2 준비 <ol><li> 37 ° C에서 중간 및 5 % 이산화탄소에서 배양 인간 동맥 내피 세포 (EC). </li><li> 문화 미디어를 대기음 10 ml의 HBSS와 EC 단일 층을 씻어 </li><li> HBSS 대기음 및 추가 2 ml의 0.5 % 트립신, 0.2 % EDTA 솔루션입니다. 약 5 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> EC는 플라스크의 측면에 탭에 의해 탈락 할 수있는 경우, 대두 트립신 억제제의 5 mL를 추가하고 피펫으로 상기 셀을 제거하기 위해, 플라스크의 표면 물총. </li><li> 15 ML 튜브와 원심 분리기 튜브에 세포를 전송5 분 200 XG에. </li><li> 뜨는 대기음 미디어 5ml에 EC 펠렛을 재현 탁. 혈구와 세포를 세어 EC 미디어 ml의 당 50,000 EC에 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 피복 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 분배. 37 ° C 플러스 5 % 이산화탄소에서 세포 배양 인큐베이터에서 세포 O / N을 부화. </li><li> 합류 단층를 3 일 내에 형성되는 경우 세포는 실험에 사용하기위한 준비가되어있다. </li></ol> 단핵구 3. 준비 <ol><li> RPMI에서 배양 전송 HL-60 세포를 15 ml 튜브에 현탁 배양으로, 10 % 우태 혈청으로 보충. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 5 ml의 배지에 재현 탁하고 세포 상등액을 제거하고 2 백만 세포 / ml로 미디어 세포 농도를 조절한다. HL-60의 형광 라벨을 원하는 경우, 혈청없이 RPMI PR에 세포를 재현 탁4 절에 설명 된대로 oceed. </li><li> 1과 3 사이의 시간의 선택 일정 기간 EC 단층을 함유 24 웰 클러스터 플레이트의 각 웰에 HL-60 세포 현탁액 0.5ml를 추가하고 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 부화 시간. 약간의 차이가 바인딩 포화가 달성 1 시간과 3 시간의 시간 점 사이에 관찰된다. </li><li> 세포 세척 / 수확 준비 : HBSS 100 ml의 120 ML 튜브를 입력합니다. 새로운 24 웰 플레이트의 각 웰에 포르말린 1 mL로 분배. </li><li> 를 만지지 않도록주의하면서 잠복기 후, 날카로운 집게의 쌍을 사용하고 우물에서 유리 커버 슬립을 선택하고 수직 커버 슬립을 누르고 3 초 동안 벤치에 조직의 조각에 커버 슬립의 가장자리를 가볍게 두 드리 조직과 커버 슬립의 세포 덮인 표면. </li><li> 포셉 한 쌍 단단히 커버 슬립을 잡고 및 HBSS 다섯 번에서 커버 슬립 덩크. </li><li> 다섯 번째 덩크 후HBSS에서 3 초 동안 조직에 커버 슬립의 가장자리를 두드려. </li><li> DAB 다음 5 덩크 세 세트의 총을, 3.6 및 3.7에 설명 된 덩크와 뿌리며 마치 절차를 반복합니다. </li><li> 실온에서 세포를 해결하기 위해 잘 포함 10 % 포르말린에 커버 슬립을 전송합니다. 커버 슬립은 열거에 대한 준비가 장기 저장 또는 아래에 설명 된 다른 절차를 실시한다. </li></ol> 세포 추적기와 HL-60 세포의 4. 라벨 (선택 사항) <ol><li> 개수 및 15 mL의 원심 분리 튜브로 HL-60 세포 (예를 들어, 1000 만) 적당량 옮긴다. 원심 분리기 HL-60 5 분 200 XG에 세포. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1 백만 세포 / ml의 농도에서 혈청없이 RPMI 배지에서 세포 추적기에 재현 탁 된 세포 펠렛. 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 품어. </li><li> 200 XG에 원심 분리기 세포 5 분 동안 상층 액을 버린다. 2,000,000 (C)의 농도로 배지에서 재현 탁 된 세포 펠렛ELL 학생 / ㎖. </li><li> 유리 커버 슬립에 성장 각 웰에 들어있는 내피 세포에 세포 추적기 표지 HL-60의 0.5 ML을 추가합니다. 3.3에서 계속합니다. </li></ol> 접착제 내피 세포의 5 열거 <ol><li> 현미경 개별 세포를 식별하기 위해 DAPI 반대 얼룩 슬라이드에 마운트 된 커버. </li><li> 4 배 또는 10 배 목적으로 거꾸로 현미경을 사용하여, 여러 분야 (예를 들어, 5 필드)의 이미지를 획득하고 유엔 조사 내피 세포에 집계 단핵구의 가장 높은 수를 (이것은 일반적으로 3-5이어야 함) 계산합니다. </li><li> 내피 세포에 단핵구의 임계 값으로 두 번이 번호를 설정 그 클러스터로 정의한다. 필요한 경우, 다른 기준은 실험의 성질에 따라 클러스터를 정의하는데 사용될 수있다. </li><li> 클러스터의 개수 및 필드 내피 세포의 개수를 카운트. 접착제 내피 세포의 비율을 얻기 위해, 후자가 전자를 나눈다. 점수다수의 필드 카운트의 평균 및 표준 편차를 얻었다. </li></ol> 항체 6.으로 대조 <ol><li> 커버 슬립에 부착 분석법 및 세포를 RT에서 15 분 동안 10 % 포르말린으로 고정 된 후에, 표준 절차 (10) 및 원하는 항체를 사용한 면역 형광에 커버 슬립 대상. </li><li> 추가 및 내피 세포에 부착 된 단핵 세포를 빠지 피하기 위해 매우 조심스럽게 다양한 솔루션을 제거합니다. </li></ol> 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제의 활동 7.으로 대조 <ol><li> 커버 슬립에 부착 분석 및 세포 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 활성을 15 분, 얼룩을 위해 포르말린에 고정 된 후 염색 키트와 함께 제공되는 사용 설명서의 설명에 따라. 추가 및 내피 세포에 부착 된 단핵 세포를 빠지 피하기 위해 매우 조심스럽게 다양한 솔루션을 제거합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

상술 단핵구 접착 분석은 내피 단층 (10) 위에 전리 방사선의 생물학적 효과를 연구하기위한 실험에 성공적으로 사용되었다. 이것은 내피 단층의 접착 성을 평가하기 위해 사용할 수있는 유일한 방법은 아니지만 점착성 단일 층 내의 비율 또는 내피 세포의 비율의 정량을 허용하는 유일한 방법이다. 이 단핵 세포의 접착 글로벌 양적 변화로서 중요한 차이이며, 다른 방법에 의해 측정 한 내피 단층 또는 내피 세포의 서브 모집단의 증가 접착 모든 세포 접착 일반 상승를 기인 할 수있다 단일 층 내에서,로 위의 예에서와 같이. 이러한 정보를 갖는 값이 조사되었다 이네스 후 향상된 접착 능력을 나타내 내피 세포의 백분율을 정량화하는 사실에 의해 예시이 효과는 접착했다 세포의 비율과 같은 특정 유전자의 유전 적 변이로 인해 아니라고 할 결론은 선량 X-방사선에 의해 유전자의 무작위 돌연변이으로부터 예상되는 것을 (1000 회 이상)의 상술 크게했다 . 결과의 재현성을 가능 요소는 세척 제도이다. 세척 절차는 조직에 뿌리며 마치 다음 세척 완충액으로 유리 커버 슬립의 침적을 수반 같이, 필연적 웰로 세척 완충액의 피펫의 이전 방법에서 발생 버퍼 난류의 변동은 회피된다. 실제로 이는 세척 단계에서 변동 요소를 제거 세척 과정을 고안하라고 강요 피펫 팅 방법을 사용하여 수득 복제 사이의 과도한 변동이 관찰되었다. 틀림없이, 필요로하는이 분석 거짓말의 한계는 N 할 단핵구 클러스터의 수동 계산을 수행하기 위해OT는 높은 처리량 분석을 위해 적응 될 수 있도록. 둘째, 많은 단핵구는 클러스터를 구성하는 방법에 대한 결정은 세미 임의로 결정되어야하고 레벨이 너무 높게 설정 및 일부 정품 클러스터 제외 초래할 수있다. 이 방법에서의 전단력의 부족은 또한 혈관 내피 세포의 접착 성이 크게 개선 된 유도되는 실험 (예를 들면, + TNFα)의 한계로 볼 수있다. 이 접착 덜 과장된 보강의 검출을 허용하는 다른 상황에서는 그러나, 전단력의 부족 장점이다. 단핵 세포 접착에 겸손한 증가가 특히 중요하고 관련이있을 수 있습니다. 생체 내, 단핵 세포는 (일반적인 실험 시간에) 힘을 전단 크게 인해 접착에 겸손한 증가와 내피 세포에 큰 숫자에 첨부 할 것으로 예상되지 않는다. 시간 그러나, 일부 단핵구 아마 것, 이것은 만성 염증의 환경을 나타낼 가능성이 높습니다. 이와 같이,이 접착에 겸손 증가 전단 응력으로 관찰 할 수 있도록 일반적으로 짧은 가능성이 너무 덧 ​​있습니다 실험 시간 프레임에서 공개 될 내피 세포 접착에 작은 증가를위한 기회를 제공하기 때문에 전단력의 부재는 장점이 될 수 있습니다. 위의 증명으로 특정 세포 단백질이나 세포의 상태에 특정 내피 세포의 접착의 연결을 허용하는 등 노화 분석 및 면역 형광 염색 등의 분석이 분석 한 후 세포를 대상 수있는 능력은, 기능을이 방법의 유용성을 증가하는 이전 접착 분석을 사용할 수 없습니다. 이 방법은 est2 - 불멸화 인간 동맥 내피 세포와 비슷한 결과가 사용되고 또한 단지 특정 세포주 특정 아니라고 보여주는 차 인간 동맥 내피 세포 (10)를 얻었다. 또한, ADO내피 세포의 접착 성을 분석하는이 방법의 ption 레이블 면역 세포의 형광을 측정하는 표준 접착 분석에 동일한 세포를 실시 배제하지 않는 것으로 이해되어야한다. 함께,이 보고서는이 방법이 포함 다양한 표준 접착 분석보다 더 많은 정보를 제공하는 것을 보여줍니다.

이러한 혈관 내피 세포 라인 층 전체 단핵구와 같은 면역 세포 침윤은 염증 하나의 과정에서 중요한 단계이다. 이 부상의 사이트에 면역 세포 (면역 세포)의 원점 복귀를 할 수 있습니다. 이러한 관상 동맥 및 경동맥 다른 인스턴스와 지역에서는 내피 층을 통해 단핵 세포의 침윤은 잠재적 플라크 (2)의 형성으로 이어지는 동맥의 벽에 이들 세포의 바람직하지 않은 장기 체류가 발생할 수있다. 면역 세포 침윤의 모든 경우에서, 첫 번째 단계는 혈관의 국부적 인 영역에서의 내피 세포의 활성화를 수반한다. 내피 세포 등의 내피 세포 표면 3- 상 면역 세포의 모집 및 부착을 용이 예컨대 VCAM, ICAM 및 E 셀렉틴과 같은 세포 표면 단백질의 발현을 증가시키기 TNF-α 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨에 의해 활성화된다 6. 7 내피 부착 단핵구를 계산함으로써 수행 하였다. 정밀도의 관점에서 이러한 방법의 한계는 림프구 또는 단핵구 밀착성 4에 대응 방사성 물질의 정량 하였다 무선 표지 된 림프구 또는 단핵구의 사용되었다. 이 방법은 결국 8 측정된다 관심 면역 세포가 차분 대신 방사능의 형광되고있는 상기와 같은 방법으로 형광 염료로 표지 하였다하고있다 형광 계 방법에 의해 대체되었다. 현재이 방법은 가장 편리한로 떠오르고있다 몇몇 상업 공급 업체 키트 형태로 판매되고있다. 이 분석은 제어 및 실험 샘플 사이의 밀착성의 상대적인 수준을 측정 할 수 있지만, 형광의 변화가 전체에 걸쳐 예를 접착 일정한 변화로 인한 것인지 공개하지 않는다ndothelial 세포군 또는 변화로 인해 세포의 하위 집단 내 밀착성의 차이 인 경우. 그것은 세정 엄격함이 결과에 큰 효과를 발휘하고, 더욱 중요한 것은, 다른 내피 세포 단층 사이의 결합되지 않은 단핵구를 헹굼 균일 샘플 사이 결과 복제 결과의 근접성 및 재현성에 큰 영향을 줄 수 있음도 분명하다 . 최근에, 내피 세포 단층에 걸쳐 미디어에 단핵구 펌프 몇몇 시스템에서는이 문제를 해결하기 위해 구를 사용 하였다. 또한, 이러한 플로우 시스템은 또한 내피 세포상의 전단력의 영향 요점을 되풀이. 이러한 시스템의 장점은 명확하고 매우 매력적이지만 급성 염증의 경우와 같이, 그러한 같은 전리 방사선 등 TNFα, 다른 활성제와 같은 요인들에 의해, 내피 세포 접착 성이 크게 증대 될 수있는 동시에 실현하는 것도 중요 10 야기가 T는 변경모자는 쉽게이 매우 엄격한 시스템에 의해 체외 실험 시간 프레임 내에서 검색되지 않습니다. 내피 세포 접착 이러한 미세한 변화를 쉽게 놓친 또는 시험 관내에서 기각 반면, 만성 염증의 특성 인 수명, 내 같은 작은 변화가 매우 심각한 결과를 발휘할 수있는 생체 내에서 반드시 양성 아니다. 따라서 강력한, 아직 민감하고 구체적인 방법 감지하고 내피 세포 접착이 필요한 측정합니다. 여기서는 직접 내피 세포의 접착 성을 측정하는 방법을보고한다. 이 방법은 내피 세포 접착의 대리 지표로서 간접 형광 측정에 의존하지 않는다. 그것은 접착의 변화가 모든 셀에 걸쳐 균일 한 변화로 인해 또는 하위 집단에 국한 여부를 알 수있다. 또한, 이러한 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제, 세포 생존력 마르 마커 내피 세포의 공동 - 염색을 허용KER, Calcien 오전 및 특정 세포 상태 또는 특정 단백질의 발현 개별 접착제 내피 세포의 연결을 허용하는 세포 표면 및 세포 내 단백질에 대한 항체.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

염증의 기본적인 프로세스 중 하나는 주변 조직에 혈관의 내강에서 면역 세포 침윤이다. 혈관 라인 내피 세포, 예컨대 단핵 세포로 면역 세포 순환에 접착 될 때 발생한다.이 밀착성의 시험 관내 측정 이제 직접 카운트로 어느 내피 층에 부착 단구의 총 수를 정량함으로써 수행 될 때까지 또는 부착 된 단핵 세포의 형광의 간접적 인 측정에 의해. 이러한 측정은 내피 세포 집단의 평균 접착 성을 표시 할 수 있지만, 그것들은 예컨대 셀 번호 등과 같은 여러 요인들에 의해 혼동되고, 실제로 접착되어 내피 세포의 비율을 공개하지 않는다. 여기에 우리가 설명하고 내피 세포 단층의 테스트 인구 내에서 접착 세포의 열거를 할 수있는 방법을 보여줍니다. 내피 세포는 커버 글라스에 성장하고 원하는 다음처리 (즉,이 형광 표지 할 수있다) 단핵구와 도전. 침지 및 배수 여러 발사 관련된 인큐베이션, 세정 절차 후, 세포를 고정한다. 단핵 세포에 의해 둘러싸여있다 접착제 내피 세포는 용이하게 식별되고 접착제이다 모집단 내의 내피 세포의 실제 비율을 보여준다 부착 인덱스를 부여 열거된다.

이 방법은 모집단 내의 개별 접착제 내피 세포의 검출을 허용한다. 예를 들어, 유엔 조사 내피 세포의 단층은 (이전에 개별 내피 세포 주위 클러스터에서 단핵 세포에 의해 구속 된 단핵 세포와 배양에 칠일 후 10Gy의 조사에서 배양 및 세척, 내피 세포 단층 다음과 같은 몇 산발적 HL-60 단핵구를 유지하면서 그림 1). 이 현상은 위상차 현미경 하에서 용이하게 관찰 할 수 있지만, 형광 현미경은 단핵구 클러스터에도 선명한 영상을 보여준다. 기재된 접착 분석을 수행 한 결과, 표준 면역 형광 방법에 적합한 항체를 사용하여 막, 세포질 또는 핵 (도 2)에 대해 단백질을 세포 염색을 진행하는 것이 가능하다. 또한, 같은 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제 (그림 3)와 같은 효소 기반의 분석은 또한 PE 될 수 있습니다rformed. 각 단핵구 클러스터 개별 내피 세포에 상당하기 때문에, 클러스터 열거 단층 내의 접착제 내피 세포의 실제 수를 공개한다 (도 4), 및 인구 내의 접착제 내피 세포 따라서 비율 (표 1,도 6) . 이 내피 세포 접착의 이러한 정량화 할 수 있습니다 지금까지 유일한 방법입니다. 그것은 여기에서 실험에 사용 내피 세포는 접촉 억제하고 합류 달성 후에 수가 증가하지 않는다는 것을 주목할 필요가있다. 이것은 나중에 포인트 증가 내피 세포 수로 인한 잠재적 인 복잡성을 제거합니다. 원한다면, 내피 단층 부착 단핵구 (3.9 대신 고정) 0.5 % 트립신 0.2 % EDTA 용액에 의해 탈락 할 수 있으며 현대 법의 경우 (도 5)와 같이 그 형광, 플레이트 판독기를 사용하여 측정. </P&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> 내피 세포의 단층에 단핵구의 그림 1. 접착. 미 조사 된 내피 세포는 단핵구는 산발적으로 랜덤 방식으로 개별 셀 (패널 왼쪽)와 같은 사후 10 Gy를 조사 7 일 개별 내피 세포에 클러스터에 부착 된 단일 층 (오른쪽 패널). 낮은 패널은 위상차에서 볼 수있는 작은 밝은 구형 세포가 실제로 세포 추적기 녹색 미리 라벨링 된 단핵 세포임을 확인 상단 패널의 형광 이미지입니다. 단핵구 클러스터의 일부는 흰색 화살표로 표시됩니다. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 촬영 하였다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> 단백질 후 접착 분석을위한 내피 세포의도 2 염색법은. 바와 접착 분석을 수행 한 후, 커버 글라스의 셀 (A) 막 단백질의 검출 (CD44)에 대한 면역을 실시하고, b) 세포질 단백질 (튜 불린) 또는 c) 핵 단백질 (γ-H2AX). (A)와 쇼 단핵구 세포 추적기 녹색과 오른쪽 패널에 비슷한 이미지 미리 라벨링 (20X의 목적으로 본) (B)의 왼쪽 패널은 CD44과 미세 소관 (적색) 및 DAPI 염색 핵 (파란색)를 알 수있다. γ-H2AX에 대한 항체로 염색 한 조사 내피 세포의 핵에 (C) 지점에 흰색 화살표. DAPI로 밝은 청색 염색 단핵구 핵 쉽게 내피 세포의 핵 타원형 구별된다. 이미지는 20 배 목표로 촬영했다.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> 내피 세포에서 알 수있는 바와 같이 내피 세포의 그림 3. 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 염색. 접착 분석 한 후, 커버 슬립에 세포, 노화 세포의 리소좀이 파란색으로 원인이 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 아제를 위해 염색을 실시 하였다 그 선택적으로 인해 작은 크기와 구형 쉽게 식별 다수의 단핵 세포에 의해 바인딩됩니다. 20X 목표를 통해 본 이미지입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; 개개의 내피 세포에 단핵구 클러스터도 4 열거. 접착 분석 한 결과, 세포의 이미지는 여러 다른 위치 식별 및 단핵구 클러스터에서 촬영하고, (녹색) 원. 클러스터는 내피 세포에 10 이상의 단핵구의 응집으로 정의 하였다. 이미지의 단핵 세포 클러스터와 십이일 후 조사 내피 세포의 수의 수 (빨간색 점선)를 계산하고, 계산 부착 내피 세포의 비율이 10 배 목표를 찍은 표 1. 그림과 같이. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> 그림 부착 단핵 세포의 형광 5. 정량화. 다음 adhE 유전자가 결실<html> 시온 분석은, 커버 글라스에 세포 trypsinised하고 단핵구의 형광 내피 단층의 밀착성의 간접 지표로서, 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정 하였다 CellTracker 녹색 미리 라벨링. 진술 일 후 조사에서 이러한 측정의 결과를 얻을 수 위의 그래프에 엮어했다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> 그림 4에서 설명하고 결과는 조사의 십이일 후 10 Gy를 조사, 8~10%을 보여주는 위의 표에 같이 세 가지 커버 글라스에 5 개의 서로 다른 위치에 1 접착제 내피 세포 득점 한 테이블에서 접착 시험 점수의 그림 6. 표현 내피 세포 접착되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; 접착제의 백분율 내피 세포 </td></tr><tr><td></td><td> 디스크 1 </td><td> 디스크 2 </td><td> 디스크 3 </td></tr><tr><td> 필드 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> 필드 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> 필드 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> 이 필드 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> 필드 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> 평균 </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> 표 1. 접착 분석을 기록했다. F에 기술 된 바와 같이 세 개의 커버 글라스에 5 개의 서로 다른 위치에 접착제 내피 세포는 득점했다igure 4 및 결과 십이일 10 Gy를 조사 후, 조사 된 내피 세포를 8-10 %가 접착 된 것을 보여주는 위에서 표로.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K 조회수.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

연구

생체공학

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

면역학 및 감염병학

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

내피 세포 접착 정량

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