We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Preparazione di vetrini di vetro <ol><li> Sterilizzare 12 millimetri di diametro tondo vetrini, mettetelo a bagno in etanolo al 70% per almeno 10 minuti con agitazione occasionale per garantire l&#39;esposizione totale di tutti i vetrini per l&#39;etanolo. Versare coprioggetto di vetro e l&#39;etanolo in un piatto di coltura cellulare sterile (o sei centimetri o 10 cm di diametro). </li><li> Con un paio di sterili fini 5B pinze, prendere e posizionare ogni singolo vetrino di vetro in un pozzo di una piastra ben cluster di 24. Fate attenzione che i coprioggetti non tocchino le pareti del pozzo e sono circa a metà del pozzo. </li><li> Lasciare la piastra ben grappolo non-coperto 24 con vetrini ad asciugare al gabinetto di flusso. Questo richiede circa 10 min </li><li> Durante questo periodo, preparare la miscela di rivestimento diluendo 10 mg / ml di fibronectina umana in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 0,1 mg / ml. </li><li> Quando i coprioggetti sono asciutti, pipettare 100 ml di soluzione di rivestimento su ciascun co vetroverslip così la soluzione copre solo il vetro senza riunendo intorno alla parte esterna del pozzo. Posizionare la piastra a 24 pozzetti di cluster coperto in un incubatore di coltura cellulare per almeno un&#39;ora. </li><li> Appena prima dell&#39;uso, rimuovere la soluzione di rivestimento. La stessa soluzione di rivestimento può essere trasferito in una provetta sterile e utilizzato fino a tre volte senza perdita visibile di efficacia. </li></ol> 2. Preparazione di endoteliali monostrato cellulare <ol><li> Cellule di coltura umane coronarico endoteliali (EC) in mezzo a 37 ° C e 5% di anidride carbonica. </li><li> Aspirare off terreni di coltura e risciacquare monostrato CE con 10 ml di HBSS </li><li> Aspirare off HBSS e aggiungere 2 ml di 0,5% tripsina, soluzione di EDTA 0,2%. Incubare a temperatura ambiente per circa 5 minuti. </li><li> Quando CE da poter essere rimosse da un rubinetto per il lato del pallone, aggiungere 5 ml di inibitore della tripsina di soia e con pipetta spruzzare la superficie del pallone per rimuovere ulteriormente le cellule. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare la provettaa 200 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet CE in 5 ml di media. Contare le cellule con un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare a 50.000 CE per ml di supporti CE. </li><li> Dispensare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra ben 24 contenente vetrini rivestiti. Incubare le cellule O / N in colture cellulari incubatore a 37 ° C più il 5% di anidride carbonica. </li><li> Le cellule sono pronte per l&#39;uso negli esperimenti quando un monostrato confluente si forma, entro 3 giorni. </li></ol> 3. Preparazione dei monociti <ol><li> Trasferire cellule HL-60 che sono coltivate in RPMI integrato con siero di vitello fetale al 10%, come coltura in sospensione, in un tubo 15 ml. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 ml media e regolare la concentrazione cellulare con supporti a 2 milioni di cellule / ml. Se si desidera etichettatura fluorescenza del HL-60, risospendere le cellule in RPMI senza siero e proceed come descritto nella sezione 4. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di HL-60 sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti cluster contenente monostrato CE ed incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% di biossido di carbonio per un periodo fisso di tempo scelto tra 1 e 3 h. Poca differenza è osservata tra 1 ora e 3 ore time-point, in cui la saturazione di legame è raggiunto. </li><li> Preparati per cella lavaggio / raccolta: Riempite un tubo da 120 ml con 100 ml di HBSS. Dispensare 1 ml di formalina in ciascun pozzetto di una piastra ben 24 fresco. </li><li> Dopo il periodo di incubazione, utilizzare un paio di pinze taglienti e prendere il vetrino di vetro dal pozzo e tenere premuto il vetrino verticale e tamponare il bordo del vetrino su un pezzo di tessuto in panchina per 3 secondi, facendo attenzione a non toccare la superficie cellulare-coperta del vetrino con il tessuto. </li><li> Tenendo il vetrino saldamente con un paio di pinze, dunk il vetrino dentro e fuori le HBSS cinque volte. </li><li> Dopo il quinto dunkin HBSS, tamponare il bordo del vetrino sul tessuto per 3 sec. </li><li> Ripetere le procedure nelle schiacciate e tamponando descritte in 3.6 e 3.7, per un totale di tre serie di 5 schiacciate seguiti da una piccola quantità. </li><li> Trasferire il vetrino in un pozzo contenente il 10% di formalina per fissare le cellule a RT. Il vetrino è pronto per il conteggio, per la conservazione a lungo termine o da sottoporre ad altre procedure descritte di seguito. </li></ol> 4. Etichettatura di HL-60 celle con Tracker cellulare (facoltativo) <ol><li> Contare e trasferire quantità appropriata di cellule HL-60 (ad esempio, 10 milioni) in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifuga cellule HL-60 a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante. </li><li> Pellet cellulare Risospendere in Tracker cellulare in RPMI media senza siero ad una concentrazione di 1 milione di cellule / ml. Incubare le cellule in coltura cellulare incubatore per 1 ora. </li><li> Cellule centrifugare a 200 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Pellet cellulare Risospendere in media per una concentrazione di 2 milioni di cells / ml. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di cellule Tracker marcati HL-60 in ciascun pozzetto contenente cellule endoteliali coltivate su vetrino di vetro. Continuare a 3.3. </li></ol> 5. enumerazione delle cellule endoteliali Adhesive <ol><li> Mount coprioggetto su vetrini da microscopio con DAPI contro-macchia per identificare le cellule individuali. </li><li> Utilizzando un microscopio rovesciato con un obiettivo 4X o 10X, acquisire immagini di diversi settori (ad esempio, 5 campi) e contare il maggior numero di monociti che si aggregano sulle cellule endoteliali non-irradiati (Questo dovrebbe essere tipicamente 3-5). </li><li> Impostare numero doppio come soglia di monociti su cellule endoteliali a quello definito come cluster. Se necessario, un criterio diverso può essere utilizzata per definire un cluster a seconda della natura dell&#39;esperimento. </li><li> Contare il numero di cluster e il numero di cellule endoteliali nel campo. Dividere il primo da quest&#39;ultimo per ottenere la percentuale di cellule endoteliali adesive. Puntonumerosi campi per ottenere un media e deviazione standard dei conti. </li></ol> 6. Controcolorazione con Anticorpi <ol><li> Dopo il test di adesione e le cellule sul vetrino sono stati fissati in formalina al 10% per 15 minuti a temperatura ambiente, sottoporre i coprioggetti per immunofluorescenza con procedura standard 10 e anticorpi di scelta. </li><li> Aggiungere e rimuovere le varie soluzioni molto delicatamente per evitare di spostare i monociti che sono collegati alle cellule endoteliali. </li></ol> 7. Controcolorazione per senescenza associata beta-galattosidasi Activity <ol><li> Dopo il test di adesione e le cellule sul vetrino sono stati fissati in formalina per 15 minuti, macchia per attività beta-galattosidasi senescenza associata, come descritto nelle istruzioni che accompagnano il kit di colorazione. Aggiungere e rimuovere le varie soluzioni molto delicatamente per evitare di spostare i monociti che sono collegati alle cellule endoteliali. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il dosaggio monociti sopra descritta è stata utilizzata con successo in esperimenti volti a studiare gli effetti biologici delle radiazioni ionizzanti su monostrati endoteliali 10. Anche se questo non è l&#39;unico metodo disponibile per valutare l&#39;adesività di un monostrato endoteliale, è l&#39;unico metodo che consente la quantificazione della proporzione o percentuale di cellule endoteliali in un monostrato che è adesivo. Questa è una distinzione importante come cambiamento quantitativo globale nell&#39;adesione dei monociti, come misurato mediante altri metodi può essere attribuito sia a un aumento generale adesività di tutte le cellule del monostrato endoteliale o all&#39;aumento adesività di un sub-popolazione di cellule endoteliali all&#39;interno del monostrato, come mostrato nell&#39;esempio precedente. Il valore di avere queste informazioni è esemplificato dal fatto che la capacità di quantificare la percentuale di cellule endoteliali che mostravano una maggiore adesività dopo irradiazione portato ai inesconclusione capace che questo effetto non è dovuta a mutazione genetica di un particolare gene come la percentuale di cellule che erano adesivo erano notevolmente sopra (oltre 1.000 volte di più) quella che ci si aspetterebbe da mutazione casuale di un gene da X-radiazione a tale dose . Il fattore che consente una buona riproducibilità dei risultati è il regime di lavaggio. Poiché la procedura di lavaggio prevede l&#39;immersione del vetrino di vetro nel tampone di lavaggio seguito da tamponando su un tessuto, la variabilità nella turbolenza tampone che deriva inevitabilmente dal vecchio metodo di pipettamento del tampone di lavaggio in un pozzo è evitata. Infatti è stato l&#39;osservazione di una eccessiva variabilità tra le repliche ottenuti con il metodo di pipettaggio che ci costretto ad ideare un procedimento di lavaggio che ha rimosso l&#39;elemento di variabilità della fase di lavaggio. Certo, i limiti di questo saggio si trovano nella necessità di effettuare conteggio manuale dei grappoli monociti, che fanno not permettono di essere adattato per analisi ad alta produttività. In secondo luogo, la decisione su quanti monociti costituiscono un cluster deve essere determinato semi-arbitrariamente e il livello può essere troppo elevata e provocare l&#39;esclusione di alcuni cluster veri. La mancanza di forza di taglio in questo metodo può anche essere visto come una limitazione in esperimenti in cui grossolanamente maggiore adesività delle cellule endoteliali è indotta (ad esempio, + TNFa). In altre situazioni, tuttavia, la mancanza di forza di taglio è un vantaggio in quanto permette di rilevare meno esagerato aumento della adesività. Modesto aumento dei monociti adesività può essere particolarmente importante e rilevante. In vivo, monociti non sarebbero (in un tipico tempo sperimentale) può aspettare per fissare in gran numero alle cellule endoteliali con modesto aumento della adesività, in gran parte dovuto al taglio forza. Nel tempo, tuttavia, alcuni monociti probabilmente sarebbe, e questo è più probabile per rappresentare l&#39;ambiente di infiammazione cronica. Come tale,l&#39;assenza di forza di taglio può essere un vantaggio in quanto offre l&#39;opportunità per i piccoli aumenti di adesività delle cellule endoteliali per essere rivelato in tempi sperimentali, che sono in genere di breve e forse troppo fugace per consentire modesto aumento della adesività da osservare sotto sforzo di taglio. La possibilità di sottoporre le cellule dopo questo saggio ad altre analisi come senescenza dosaggio e immunofluorescenza aumenta l&#39;utilità di questo metodo in quanto consente l&#39;associazione di adesività di specifiche cellule endoteliali a particolari proteine ​​cellulari o stati cellulari come dimostrato sopra, una caratteristica che non è disponibile con i saggi di adesione più anziani. Questo metodo è stato utilizzato con celle coronariche umane immortalizzate est2 endoteliali e risultati simili sono stati ottenuti anche con cellule primarie umane endoteliali coronariche 10, dimostrando che non è specifico per un solo particolare linea cellulare. Inoltre, il rumoreption di questo metodo di saggiare adesività delle cellule endoteliali non preclude sottoporre le stesse cellule per saggio di adesione standard che misura la fluorescenza di immunociti etichettati. Insieme, questo rapporto dimostra che questo metodo è versatile, inclusiva e fornisce molte più informazioni di quanto il test di adesione standard.

Infiltrazione di cellule immunitarie quali monociti attraverso lo strato di cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni è un passo importante nel processo di infiammazione 1. In questo modo il homing delle cellule immunitarie (immunociti) a un sito di lesione. In altri casi e luoghi come l&#39;arteria coronarica e carotidea, infiltrazione di monociti attraverso lo strato endoteliale può portare alla residenza indesiderabile lungo termine di queste cellule nella parete dell&#39;arteria, potrebbe condurre alla formazione di placche 2. In tutti i casi di immunocyte infiltrazione, la prima fase prevede l&#39;attivazione delle cellule endoteliali in una regione localizzata del vaso sanguigno. Le cellule endoteliali sono attivati ​​da citochine pro-infiammatorie come TNF-α e IL-6 per aumentare l&#39;espressione di proteine ​​di superficie cellulare come VCAM, ICAM ed E-selectina che facilitano il reclutamento e il fissaggio dei immunociti sulla superficie delle cellule endoteliali 3- 6. 7. Le limitazioni di questo metodo in termini di precisione condotto all&#39;uso di linfociti radio-marcato o monociti, seguita dalla quantificazione del materiale radioattivo corrispondente al linfociti o monociti adesione 4. Questo metodo è stato poi sostituito con un metodo basato sulla fluorescenza, per cui immunociti di interesse sono state marcate con fluorescenza colorante e sottoposti alla stessa procedura come sopra, con la differenza che invece di fluorescenza della radioattività viene misurata 8. Attualmente questo metodo è emerso come il più conveniente ed è venduta in kit da diversi fornitori commerciali. Mentre questo test può misurare i livelli relativi di adesività tra controlli e campioni sperimentali, non rivela se un cambiamento della fluorescenza è causa di un cambiamento uniforme adesività sull&#39;intera epopolazione cellulare ndothelial o se la modifica è dovuta a una differenza di adesività di un sub-popolazione di cellule. E &#39;evidente, inoltre, che il rigore di lavaggio esercita un profondo effetto sul risultato, e, soprattutto, l&#39;uniformità di risciacquo monociti non legate tra diverse monostrati di cellule endoteliali inciderà notevolmente sulla vicinanza dei risultati di repliche e la riproducibilità dei risultati tra i campioni . Più di recente, diversi sistemi che pompano monociti in media attraverso un monostrato di cellule endoteliali sono stati usati per affrontare questo problema 9. Inoltre, questi sistemi di flusso anche ricapitolano l&#39;effetto della forza di taglio sulle cellule endoteliali. Mentre i vantaggi di tali sistemi sono chiare e molto attraente, è anche importante rendersi conto che mentre adesività cellule endoteliali può essere notevolmente aumentata, come nel caso in infiammazione acuta, da fattori come TNFa, alcuni altri attivatori, come le radiazioni ionizzanti 10 suscitare cambia tcappello non sono prontamente rilevate in tempi sperimentali in vitro da questi sistemi molto rigorosi. Mentre tali modifiche minime di adesività delle cellule endoteliali sono facilmente perso o revocati in vitro, non è necessariamente benigna in vivo, in cui tali piccoli cambiamenti in un tempo di vita, che è caratteristico di infiammazione cronica, possono esercitare risultati molto significativi. Quindi un metodo robusto, ma sensibile e specifico per rilevare e misurare è necessaria l&#39;adesività delle cellule endoteliali. Qui riportiamo un metodo per misurare l&#39;adesività delle cellule endoteliali direttamente. Questo metodo non si basa sulla misura della fluorescenza come indicatore indiretto di surrogata adesività cellule endoteliali. Esso rivela se i cambiamenti in adesività sono dovuti al cambiamento uniforme in tutte le cellule o confinato in una sotto-popolazione. Inoltre, esso permette co-colorazione di cellule endoteliali con marcatori come senescenza associata beta-galattosidasi, vitalità cellulare marker, Calcien AM e anticorpi contro superficie delle cellule e proteine ​​intracellulari, permettendo l&#39;associazione di singole cellule endoteliali adesivi per certi stati cellulari o espressione di proteine ​​specifiche.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Uno dei processi cardinali di infiammazione è l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie dal lume del vaso sanguigno al tessuto circostante. Questo si verifica quando le cellule endoteliali, che rivestono i vasi sanguigni, diventano adesivo circolanti cellule immunitarie come monociti. In vitro degli questo adesività è finora fatto quantificando il numero totale di monociti che aderiscono ad uno strato endoteliale sia come conteggio diretto o attraverso la misura indiretta della fluorescenza di monociti aderenti. Mentre tali misurazioni indicano l&#39;adesività media della popolazione di cellule endoteliali, sono confusi da una serie di fattori, come il numero di cellule, e non rivelano la proporzione di cellule endoteliali che sono effettivamente adesivo. Qui si descrive e dimostrare un metodo che consente l&#39;enumerazione delle cellule adesive all&#39;interno di una popolazione testata di monostrato endoteliale. Le cellule endoteliali sono coltivate su vetrini e seguendo desideratotrattamento sono sfidati con monociti (che può essere fluorescente). Dopo l&#39;incubazione, una procedura di risciacquo, che coinvolge vari cicli di immersione e scarico, le cellule vengono fissate. Cellule endoteliali adesivi, che sono circondate da monociti sono facilmente identificabili e enumerati, dando un indice di adesione che rivela la percentuale effettiva di cellule endoteliali all&#39;interno della popolazione che sono adesivi.

Questo metodo permette la rilevazione di singole cellule endoteliali adesive all&#39;interno di una popolazione. Per esempio, mentre un monostrato di cellule endoteliali non-irradiati mantenuto alcuni sporadici HL-60 monociti seguenti incubazione e lavaggio, monostrato endoteliale a 7 giorni dopo la 10Gy irradiazione prima dell&#39;incubazione con monociti sono stati legati da monociti a grappoli intorno cellule endoteliali singole ( Figura 1). Anche se questo fenomeno è facilmente osservabile al microscopio a contrasto di fase, microscopia a fluorescenza rivela un&#39;immagine ancora più nitida dei cluster monociti. Dopo aver eseguito il test aderenza descritto, è possibile procedere alla colorazione delle cellule per membrana citoplasmatica o nucleare (Figura 2) proteine ​​utilizzando anticorpi appropriati con metodi immunofluorescenza standard. Inoltre, saggio basato enzimi come senescenza associata beta-galattosidasi (Figura 3) può anche essere performed. Poiché ogni cluster monociti corrisponde ad una cellula endoteliale individuale, enumerazione dei clusters rivelerà il numero effettivo di cellule endoteliali adesive all&#39;interno del monostrato (figura 4), ​​e quindi la percentuale di cellule endoteliali adesive all&#39;interno della popolazione (Tabella 1, Figura 6) . Questo è l&#39;unico metodo per data che consente tale quantificazione di adesività delle cellule endoteliali. È interessante notare che le cellule endoteliali utilizzate negli esperimenti qui sono il contatto inibito e non aumentano di numero dopo il raggiungimento di confluenza. Questo elimina la complessità potenziali causati da un aumento del numero di cellule endoteliali a successivi momenti. Se lo si desidera, monociti collegati a monostrati endoteliali da poter essere rimosse dalla soluzione di tripsina-EDTA 0,2% 0,5% (invece di fissazione in 3.9) e loro fluorescenza misurati usando un lettore di piastre, come accade nei metodi contemporanee (Figura 5). </p&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figura 1. Adesione dei monociti in monostrato di cellule endoteliali. In cellule endoteliali non-irradiati, monociti aderito come le singole cellule in maniera sporadica e casuale (pannelli di sinistra) e in cluster su singole cellule endoteliali dei 7 giorni dopo la 10 Gy irradiati monostrato (pannelli di destra). Pannelli inferiori sono immagini di fluorescenza dei pannelli superiori, a conferma che i piccoli e luminosi celle sferiche visibili sotto contrasto di fase sono infatti monociti che sono stati pre-etichettati con Cell-Tracker Verde. Alcuni dei cluster monociti sono indicati con frecce bianche. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 10X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figura 2. La colorazione di cellule endoteliali per il dosaggio delle proteine ​​post-adesione. Dopo aver eseguito il test aderenza descritto, le cellule sui vetrini sono stati sottoposti a immunofluorescenza per la rilevazione di (A) proteina di membrana (CD44), b) proteina citoplasmatica (tubulina) oppure c) proteina nucleare (γ-H2AX). Pannelli di sinistra (A) e (B) (visto con obiettivo 20X) mostrano monociti pre-etichettati con Cell Tracker verde e l&#39;immagine simile ai pannelli di destra rivelano CD44 e microtubuli (rosso) e nuclei DAPI-macchiati (blu). Frecce bianche in (C) punto irradiati nuclei delle cellule endoteliali che sono state colorate con anticorpi contro γ-H2AX. Nuclei monociti, che si sono macchiati di un brillante blu da DAPI sono facilmente distinguibili dai nuclei di forma ovale delle cellule endoteliali. Le immagini sono state scattate con obiettivo 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figura 3. senescenza-associata beta-galattosidasi colorazione di cellule endoteliali. Dopo saggi di adesione, le cellule su vetrini sono stati sottoposti a colorazione per senescenza-associata beta-galattosidasi che provoca lisosomi di cellule senescenti al blu, come è evidente in cellule endoteliali che viene selettivamente vincolato da numerosi monociti, che sono facilmente identificabili causa delle loro piccole dimensioni e la forma sferica. Immagine visto attraverso obiettivo 20X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. enumerazione dei cluster monociti sulle cellule endoteliali individuali. Dopo saggi di adesione, le immagini delle cellule sono stati presi da diverse posizioni e cluster monociti identificati e cerchiata (in verde). Un cluster è stata definita come un agglomerato di 10 o più monociti su una cellula endoteliale. Il numero di cluster di monociti e il numero di 12 giorni cellule endoteliali post-irradiati (tratteggiata in rosso) nell&#39;immagine sono stati contati e la percentuale di cellule endoteliali aderenti calcolati come indicato nella tabella 1. Immagine presa attraverso obiettivo 10X. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figura 5. Quantificazione della fluorescenza monociti aderenti. Dopo Adhe<html> test sione, celle su vetrini sono stati trypsinised e la fluorescenza dei monociti pre-etichettato con CellTracker Verde è stata misurata, utilizzando un lettore di piastre in fluorescenza, come un indicatore indiretto l&#39;adesività del monostrato endoteliale. I risultati di tali misurazioni a giorni stabiliti post-irradiazione sono state ottenute e, intrecciata sul grafico di cui sopra. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentazione dei punteggi del test di adesione Tabella 1. adesivi cellule endoteliali in cinque luoghi diversi su tre vetrini di vetro sono stati segnati come descritto nella figura 4 e risultati tabulati sopra dimostrando che 12 giorni dopo 10 Gy di irradiazione, dall&#39;8 al 10 per cento del combustibile irraggiato cellule endoteliali divennero adesivo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Percentuale di adesivo cellule endoteliali </td></tr><tr><td></td><td> Disco 1 </td><td> Disco 2 </td><td> Disco 3 </td></tr><tr><td> Campo 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Campo 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Campo 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Campo 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Campo 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Media </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Adesione punteggi del test. Cellule endoteliali adesivi in cinque luoghi diversi su tre vetrini di vetro sono stati segnati come descritto in FIGURA 4 ed i risultati riportati in tabella dimostrano che 12 giorni dopo 10 Gy, da 8 a 10 per cento di cellule endoteliali irradiati divenne adesivo.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Views.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Ricerca

Bioingegneria

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Immunologia e infezioni

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali

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