Agradecemos James Waters, Gable Wadsworth e Bo Broadwater pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também a quatro revisores anônimos por fornecer observações úteis. Reconhecemos o apoio financeiro do Georgia Institute of Technology, o Prémio Carreira Burroughs Wellcome Fund na Interface Científica, ea pesquisa estudante concessão de rede de NSF Physics dos sistemas vivos.

1. Preparação dsDNA Amostra <ol><li> Projete DNAs globalmente curvas repetindo uma seqüência de 10-mer. Por exemplo, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;é um ADN curvo 186 pb, em que X é uma base aleatória adicional e a sequência que flanqueia a sequência de 10-mer de repetição são sequências de adaptador. NOTA:. Neste exemplo, dois 10-mers com preferências opostas à formação nucleosome com base em um estudo de larga escala ocupação nucleosome por Kaplan et al 15 foram escolhidos. Uma vez que a repetição helicoidal de ADNcd é perto de 10 pb, qualquer desvio líquido do eixo helicoidal do 10-mer se acumulam para produzir uma forma como um arco circular (Figura 3A). Uma vez que o período helicoidal está mais perto de 10,5 pb, uma base adicional é inserido depois de cada duas repetições para manter a estrutura curva planar como possível. Essas seqüências mais curtas do que 200 pb pode ser encomendado a partir companies que o serviço de síntese de genes oferta. É conveniente para flanquear essas seqüências com seqüências de adaptadores comuns para as etapas subseqüentes. O procedimento é esquematizado na Figura 3B. </li><li> Realizar PCR com iniciador de síntese 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) e iniciador 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Iniciador 2 é marcado com o Cy3 dador FRET na extremidade 5 &#39;. Uma receita típica de PCR e ciclismo protocolo, são apresentados nas Tabelas 1 e 2. </li><li> Realizar PCR com Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Iniciador 3 é marcado com o aceitador FRET Cy5 através da espinha dorsal e a biotina-ligante na extremidade 5 &#39;. Receita PCR e ciclismo protocolo são como acima. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR utilizando um kit de limpeza de PCR. </li><li> Misture o produto Cy3 marcado e o produto marcado com Cy5 em um tampão para a troca de fio (100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM) em concentrações finais de 0,4 e# 181; M e 0,1 M, respectivamente. NOTA: O excesso Cy3 ADN aumenta a concentração do duplex que transporta tanto Cy3 e Cy5 como resultado da troca de fio. </li><li> Taxas de fios por incubação a 98,5 ° C por 2 min, arrefecimento gradual para 5 ° C com uma taxa de rampa de 0,1 ° C / seg, e incubar em 5 &#160; ° C durante 2 horas. </li></ol> 2. Eletroforese em Gel para detectar dsDNA Curvatura <ol><li> Despeje a gel de poliacrilamida a 16,17 por mistura de acrilamida e soluções de bis-acrilamida numa proporção de 29.2:0.8, 5% (w / v) em 1X Tris / borato / EDTA (TBE), tampão a pH 8,0. Nota: 10 ml de solução de gel contém: 1,217 ml de 40% de acrilamida, 0,667 ml de 2% de bis-acrilamida, 1 ml de TBE 10X, 100 L de persulfato de amónio (APS) 10%, 10 l de TEMED, e o resto é dH2O Solidificação completa do gel leva cerca de 30 min. </li><li> Carregar o gel de poliacrilamida com amostras de DNA e a escada de DNA em 1X tampão de carga (5% de glicerol, 0,03% (w / v) bl bromofenolue) e correr o gel a 5-8 V / cm a 4 ° C durante 45 minutos ou até a frente do corante aproxima-se da extremidade do gel. </li><li> Mancha do gel utilizando tampão 1X TBE contendo brometo de 0,5 g / ml de etídio durante 30 min. Identificar as bandas de DNA sob iluminação UV. Comparar as posições da banda com o marcador de tamanho (escada de 100 pb de ADN) para calcular os tamanhos aparentes das moléculas de DNA. NOTA: Curved DNAs geralmente se movem mais lentamente do que DNAs retas. </li></ol> 3. Caudal Preparação das células <ol><li> Fure 6-7 pares de furos ao longo de dois lados opostos de uma lâmina de vidro (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) usando uma furadeira e brocas de diamante. Após a perfuração, esfregue o slide em água corrente para remover o pó de vidro visível. NOTA: Os furos servem como entradas e saídas de perfusão. Durante a perfuração, o arrefecimento da lâmina com água é importante para evitar a fissuração. </li><li> Colocar as lâminas na posição vertical em uma jarra de vidro e encha-o com água. Sonicar por 15 min e transferi-los para outra jarra de vidro dedicated para limpeza acetona. Encha-o com acetona e sonicado por 15 min. Lavar as lâminas com etanol usando um borrifador e depois com água. Coloque-os em um frasco de polipropileno, preenchê-lo com 5 M de hidróxido de potássio e sonicado por 15 min. Finalmente, sonicate as lâminas em água por 15 min. Limpar as lamelas (# 1, 24 x 40 mm), utilizando o mesmo protocolo. NOTA: lâminas e lamínulas limpos podem ser armazenados em dH 2 O para uso a longo prazo. </li><li> Mistura-se 1 mg de biotina-PEG-silano (MW 3400), com 80 mg de mPEG-silano (MW 2000) em 340 L de solução de bicarbonato de sódio 0,1 M. Misture bem e centrifugar a mistura rapidamente para se livrar das bolhas. NOTA: A funcionalização da superfície de polietileno glicol (PEG) ajuda a reduzir a ligação não específica de ADN na superfície. </li><li> Coloque 80 L da solução de PEG em cada slide e delicadamente abaixar uma lamela sobre ele. Aguarde 45 min. Separe a lamela do slide com uma pinça, lave-os com uma quantidade abundante de dH 2 O e deixe them secar ao ar livre. </li><li> Coloque tiras finas de fita dupla-pau em todo o slide para formar canais. Alinhe uma lamela sobre ele e pressione firmemente o lamela contra o slide para formar canais estanques. O uso de 5 minutos de epóxi para vedar as extremidades dos canais. </li></ol> 4. Preparação de Solução de Trolox <ol><li> Coloque ~ 30 mg de Trolox e 10 ml de dH2O num balão e usar uma barra magnética de agitação para agitar a solução ao ar livre durante 18 horas. </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 um e ajustar o pH a 7 por adição de ~ 6 ul de base Tris 1 M. (pH 11). Nota: Trolox é um reagente anti-piscar, que é comumente usado em uma única molécula estuda 18. A acção antifading de Trolox vem de um seu derivado oxidado, que está presente na solução de Trolox parcialmente degradado 19. Dissolver rapidamente Trolox em metanol ou uma solução de pH elevado Tris devem ser evitadas por causa da oxidação ineficaz. </li></ol> 5. Single-molImagem ecule <ol><li> Injectar 15 mL de solução de NeutrAvidin (0,5 mg / ml) para dentro do canal e esperar durante 2 min antes da lavagem com 100 mL de tampão de T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,0). </li><li> Injectar 50 mL de amostra de DNA (50-100 pM) para dentro do canal. Aguarde 5 minutos e enxaguar o DNA não ligado afastado com 100 L de tampão T50. NOTA: as moléculas de ADN irá ligar-se especificamente à superfície através da interacção biotina-NeutrAvidin. </li><li> Encher o canal com o tampão de imagem que contém um sistema de eliminação de oxigénio 20 (PCD 100 mM, APC 5, Trolox 1 mM, e NaCl 500 mM). </li><li> Defina o EMCCD no modo de transferência de quadros para transmitir 2 x 2 imagens Guardado (256 x 256) para o computador a 25 quadros por segundo. </li><li> Coloque o óleo de imersão sobre a objetiva do microscópio, e fixar a célula de fluxo no palco microscópio usando clipes de amostras. Grosseiro-ajustar o foco, olhando para o padrão de reflexão do laser na parede. Fine-ajustar o foco usando a exibição ao vivo de fluorescência imidades no monitor. </li><li> Comece a aquisição de dados com o laser de 532 nm, em. Verifique a visualização ao vivo e ajustar o foco, se necessário. Pare de aquisição de dados quando a maioria das moléculas têm Foto-descoloração. NOTA: Nesta instalação, um programa escrito em laboratório C para controlar o microscópio e exibir imagens ao vivo no monitor como eles são salvos no disco rígido é usado. </li></ol> 6. Processamento de Imagem e Análise de Dados NOTA: A série temporal de 256 x 256 imagens são processadas por um código MATLAB para gerar traços de Cy3 e Cy5 intensidades tempo de moléculas individuais. Para emparelhar pixels entre o canal doador eo canal receptor da imagem split-view, 6-7 pares de Cy3 e Cy5 pontos, cada par de uma mesma molécula uniformemente dispersas em todo o campo de visão, são colhidos manualmente, e uma transformação afim é calculada usando as coordenadas desses pontos como pontos de ancoragem. <ol><li> Usando um script MATLAB, olhar através de todos os tempos uma única molécula traça tchapéu mostra várias transições entre os sinais de baixa e alta traste. Identificar os estados em loop e unlooped. NOTA: O sinal de FRET é definida como a intensidade de Cy5 (Ia) dividido pela soma de Cy3 e Cy5 intensidades (I-a + I d). Estado loop tem alto valor FRET enquanto estado unlooped tem baixo valor FRET. O histograma dos sinais de FRET uma única molécula é bimodalmente distribuídas por causa de looping reversível e unlooping. </li><li> Encontre o limiar que separa as duas distribuições, determinando a intersecção entre as duas curvas de Gauss embutidos. </li><li> Calcule a eficiência FRET como <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> e atribuir os estados em loop com altos valores de FRET e os estados unlooped com baixos valores de traste. </li><li> Usando um script MATLAB, analisar o número acumulado de moléculas (N (t)) que dava (ouatingiu o elevado estado FRET) em diferentes lapsos de tempo desde o início da aquisição de dados. Observação: Uma vez que uma molécula de dsDNA pode começar em qualquer conformação do estado unlooped no início da aquisição de dados, a taxa de aumento na população anelada reflete a taxa de looping média média mais conformações iniciais. Extraia o looping ciclo taxa k ajustando N (t) com uma função exponencial: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Se aumenta bifasicamente, ele pode ser equipado com uma função exponencial dupla: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> Neste caso, k é obtido a partir de ciclo: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTA: Teoricamente, a probabilidade de sobrevivência que um polímero não tem loop no tempo t não é um simples ou dupla função exponencial 12. Fitt Exponencialing é usado como um meio prático para extrair o tempo médio de looping. </li></ol> 7. Determinação do Fator J NOTA: O factor J representa como concentrado numa extremidade de um ADNcd é em torno da outra extremidade. Ele pode ser determinado por interpolação a concentração de um segmento de extremidade do DNA que produzir a mesma taxa de reacção com o outro segmento de extremidade como a taxa de looping medido. Experimentalmente, um segmento de extremidade é imobilizado sobre a superfície, e o outro segmento de extremidade é introduzido numa determinada concentração c. Se a taxa de recozimento medido entre as duas extremidades é k emparelhar, então o factor de J 21 é dada pela <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . A constante de velocidade de recozimento (k = k recozimento de emparelhamento / C) é independente da concentração da sonda. <ol><li> Fluxo 20 l de 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) into um canal NeutrAvidin-revestido. Lavar o canal com 100 T50 mL para lavar oligos não ligados. </li><li> Preparar o tampão de formação de imagens conforme descrito na parte 5 com a adição de Cy3 oligo (iniciador 2) a uma concentração final de 50 nM. Fluxo este buffer de imagem para o canal. </li><li> Mantendo o laser de 532 nm, gire rapidamente o laser de 640 nm para identificar os locais de oligos Cy5 ligado à superfície. Desligue o laser de 640 nm e começar a monitorar o sinal de FRET. NOTA: Após a hibridização de um oligo Cy3 a um Cy5 oligo-bound superfície, Cy5 fluorescência surgirão FRET. </li><li> Usando um script MATLAB, analisar o número de moléculas que se iniciam no estado livre (baixa intensidade Cy5), mas mais tarde se transformar em Estado (alta intensidade de Cy5) recozido em função do tempo a partir de vestígios de intensidade Cy5. </li><li> Traçar este número de moléculas em função do tempo recozidos. Coloque esta curva com uma única função exponencial ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Para obter a taxa de recozimento (k recozimento). </li><li> Repetir esta experiência a diferentes concentrações de Cy3 oligo (60, 100, e 180 nm) para confirmar a linearidade entre a velocidade de recozimento e a concentração de reagente. Extrai-se a constante de velocidade de segunda ordem de recozimento (k recozimento ) A partir da inclinação. </li><li> Calcular o factor de J <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Onde k é a taxa de ciclo de looping medido nas mesmas condições de tampão. </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Um ensaio de uma única molécula simples baseado em FRET foi utilizado para estudar a cinética de looping de ADN de diferentes formas intrínsecas. DNAs curvos podem ser preparados por uma sequência de repetição de 10-mer em fase com o período helicoidal de 10,5 pb, e suas curvaturas pode ser estimada utilizando PAGE. Estes dsDNAs são projetados com extremidades pegajosas para permitir a estabilização laço transitória. Foram extraídos a taxa de looping do aumento exponencial do número de moléculas em loop ...

Compreender as propriedades mecânicas do dsDNA é de fundamental importância em ciências básicas e aplicações de engenharia. A estrutura do dsDNA é mais complicado do que uma escada helicoidal reto porque os ângulos de rolo, de inclinação e torção entre pares de bases sucessivas pode variar de acordo com seqüência. Flutuações térmicas podem causar dsDNA se submeter a diversos modos de flutuações conformacionais tais como flexão, torção e alongamento. Transições, como fusão e dobras também pode ocorrer em condições extremas. Entre esses movimentos, dsDNA flexão tem o impacto biológico mais perceptível 1. dsDNA flexão está associada com a repressão ou a activação de genes, trazendo dois locais distantes próximos uns dos outros. Também desempenha um papel importante no empacotamento do ADN no interior do núcleo da célula ou uma cápside viral. Dobrando deformação de dsDNA pode ser visualizado experimentalmente por microscopia de alta resolução (AFM 2 e TEM 3), e o thermodynamics cinética e podem ser estudados por meio de ensaios de loop, que ligam quimicamente sítios justapostas do dsDNA. Um tal ensaio é dependente da ligase de ciclização 4. Neste ensaio, as moléculas de dsDNA com (coesas) extremidades &#39;sticky&#39; são circularizado ou dimerizada por DNA ligase. Ao comparar as taxas de círculo e a formação de dímero, pode-se obter uma concentração molar eficaz de uma das extremidades do DNA na vizinhança da outra extremidade, que é conhecido como o factor de J. Este factor de J é dimensionalmente equivalente à densidade de probabilidade de encontrar uma extremidade do ADN a uma curta distância a partir da outra extremidade, e, portanto, reflecte a flexibilidade do ADN. Medindo o factor J como uma função do comprimento do DNA revela várias características sobre a mecânica de ADN, incluindo o comprimento de 4,5 persistência. A cadeia sem-fim-como modelo (WLC) tem sido amplamente considerado como o modelo de polímero canônico para a mecânica dsDNA com base em seu sucesso na explicaçãoIning as curvas de força-de extensão obtidos no ADN puxando as experiências 6 e predizer correctamente os factores J dsDNAs de mais do que 200 pb 7. No entanto, utilizando o ensaio de ciclização em moléculas de dsDNA tão curtos como 100 pb, Cloutier e Widom medidos os factores J ser várias ordens de magnitude maiores do que a previsão do modelo WLC 8. Um ano depois, Du et al. produzido factores J de acordo com o modelo WLC utilizando o ensaio de ciclização com concentrações mais baixas de ligase e atribuído o resultado anómalo a partir do grupo Widom a altas concentrações de ligase utilizada 9. Esta controvérsia exemplifica a influência inevitável de DNA-ligase em cinética de ciclização quando se utiliza o ensaio convencional 9. Além disso, a DNA ligase também pode afetar a estrutura do DNA e rigidez através inespecífica 10,11 vinculativo. Para eliminar as preocupações técnicas de ensaios looping dependentes de proteína, que recentemente demonstrou um protensaio looping ein-livre baseado em fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Neste método, as conformações laçados são detectados por FRET entre o doador e receptor ligado perto das extremidades coesivas de uma molécula de DNA. Um total de microscópio de fluorescência de reflexão interna de tipo de objectivo (TIRFM) é utilizado para registar trajectórias de looping reversível e eventos unlooping de moléculas de DNA únicas imobilizado à superfície, por um período de tempo prolongado. Este método apresenta a montagem baseado em PCR de moléculas de ADN para gerar moléculas de ADN livre de desadaptação, o que é uma melhoria essencial ao longo de um método semelhante por Vafabakhsh e Ha 13. O aspecto de molécula única deste protocolo permite a medição da distribuição, para além Ensemble médias enquanto que o aspecto de FRET permite medir a dinâmica de looping de ADN repetidamente a partir da mesma molécula, mesmo em condições que possam prejudicar a actividade de ligase. A configuração TIRFM é mostrado na Figura 1. Um costumeConcebido fase amostra é colocada sobre um corpo do microscópio Olympus IX61. 532 nm e 640 nm lasers são introduzidos a partir do lado e são reflectidos por pequenos espelhos elípticas 14 para o objectivo de NA elevado para atingir o ângulo crítico de incidência na interface lamela de água. Notamos que mais difundido através TIR-objectivo usando espelhos dicroicos ou configurações TIR-base de prisma também pode ser utilizado para esta aplicação de FRET. A imagem de fluorescência formada pelo microscópio é dividido em dadores e aceitadores de imagens por um espelho dicróico. Eles são, então, re-trabalhada em duas metades de um EMCCD. Filtros de emissão adicionais passa-longa são usados ​​para reduzir o sinal de fundo. O controle de temperatura é essencial para a aquisição de dados cinéticos reprodutíveis. Por controlo da temperatura, o objectivo é separada da peça de nariz do corpo do microscópio para minimizar a transferência de calor e de água a partir de uma temperatura controlada resfriador / aquecedor é feito circular através de uma gola de bronze que se encaixa firmementeem todo o interior metal embaixo do casaco objetivo. Esta configuração é capaz de alcançar o controlo robusto temperatura na superfície lamela entre 15 e 50 ° C (Figura 2). Neste trabalho, a temperatura da amostra foi mantida a 24 ° C. O protocolo a seguir apresenta o procedimento passo-a-passo para a construção de DNA, a estimativa de forma DNA, molécula única experiência, e J determinação do fator.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40% solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vertical PAGE System</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;mu;m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>triplet state quencher</td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Premium plain glass microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature control</td></tr><tr><td>Objective Cooling Collar</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>temperature control</td></tr><tr><td>KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector</td><td>Coherent</td><td>1139604</td><td>Cy5 excitation</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &amp;amp; 543.5 nm lasers, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>combining dichroic</td></tr><tr><td>Brightline Fluorescence Filter 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 emission filter</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 emission filter</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diameter 45&amp;deg; Rod Lens Aluminum Coated&amp;nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miniature mirror</td></tr><tr><td>1/4&quot; Travel Single-Axis Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>translation of miniature mirror</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>focusing lens</td></tr><tr><td>Adjustable Mechanical Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Dielectric Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>relay lens</td></tr><tr><td>Lens Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Filter Mount</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Cage Cube Platform</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lens, &amp;Oslash;1&quot;, f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>collimating lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>telescope lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>telescope lens</td></tr></tbody></table>

studying dna looping by single-molecule fret

Dobrando de ADN de cadeia dupla (dsDNA) está associado com muitos processos biológicos importantes, tais como o reconhecimento de DNA-proteína e embalagem de ADN em nucleossomas. A termodinâmica da dobragem ADNcd foi estudado por um método chamado de ciclização que se baseia na ADN-ligase para se juntar covalentemente extremidades pegajosas curtas de um ADNcd. No entanto, a eficiência ligadura pode ser afetada por vários fatores que não estão relacionados com dsDNA looping, como a estrutura do DNA em torno das extremidades pegajosas unidas e ligase também pode afetar a taxa de looping aparente através de mecanismos como a ligação não específica. Aqui, vamos mostrar como medir dsDNA cinética looping sem ligase por detectar a formação transitória laço DNA por FRET (Fluorescence Resonance Energy Transferência). moléculas de dsDNA são construídos utilizando um protocolo baseado em PCR simples, com um par de FRET e um ligante de biotina. A densidade de probabilidade looping conhecido como o factor de J é extraído a partir da taxa de looping e a taxa de hibridação entre duas desconexãoted extremidades pegajosas. Ao testar dois dsDNAs com diferentes curvaturas intrínsecas, mostra-se que o factor de J é sensível à forma intrínseca do dsDNA.

As moléculas de ADN utilizadas para o estudo de looping consistem de uma região dúplex de sequência variável, e o comprimento e saliências em cadeia simples que sejam complementares uma da outra. As saliências, que são 7 bases de comprimento, pode emparelhar com o outro para capturar o estado anelada. Cada saliência contém ou Cy3 ou Cy5 que está ligado na espinha dorsal do DNA através da química amidite. O Cy5 saliência está também relacionada com biotina-TEG (15 átomos-Tetra-Etileno Glicol espaçador) ...

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J.

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.3K visualizações.  Georgia Institute of Technology.  Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J. 

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Bioquímica

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

R-Loop Analysis by Dot-Blot

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the by-products of transcription; but recent findings of fewer R-loops in diseased cells made it clear that R-loops have functional roles in a variety of human cells. Next, it is critical to understand the roles of R-loops and how cells balance their abundance. A challenge in the field is the quantitation of R-loops since much of the work relies on the S9.6 monoclonal antibody whose specificity for RNA-DNA hybrids has been questioned. Here, we use dot-blots with the S9.6 antibody to quantify R-loops and show the sensitivity and specificity of this assay with RNase H, RNase T1, and RNase III that cleave RNA-DNA hybrids, single-stranded RNA, and double-stranded RNA, respectively. This method is highly reproducible, uses general laboratory equipment and reagents, and provides results within two days. This assay can be used in research and clinical settings to quantify R-loops and assess the effect of mutations in genes such as senataxin on R-loop abundance.

This protocol details a simple method that quantifies R-loop, a three-stranded nucleic acid structure that comprises of an RNA-DNA hybrid and a displaced DNA strand.

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the ...

Genética

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstituição de nucleossomos in situ para estudos de molécula única

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Reconstituição eficiente de nucleossomos para técnicas de molécula única

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

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Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

R-Loop Analysis by Dot-Blot

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Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

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