Nous remercions James Waters, Gable Wadsworth et Bo Broadwater pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également quatre évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Nous reconnaissons l&#39;appui financier du Georgia Institute of Technology, le prix du Burroughs Wellcome Fund carrière à l&#39;interface scientifique, et la subvention du réseau de recherche de l&#39;étudiant de la NSF Physique des systèmes vivants.

1. Préparation ADN double brin de l&#39;échantillon <ol><li> Concevoir ADN courbes globalement en répétant une séquence de 10-mer. Par exemple 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC, - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;de l&#39;ADN est une courbe de 186 bp, où X est une base aléatoire supplémentaire et la séquence flanquant la séquence 10-mère sont des séquences de répétition adaptateur. REMARQUE:. Dans cet exemple, deux 10-mères ayant des préférences opposées à la formation nucléosome basé sur une grande échelle étude d&#39;occupation nucléosome par Kaplan et al 15 ont été choisis. Depuis la répétition hélicoïdale de l&#39;ADN bicaténaire est proche de 10 pb, toute déviation nette de l&#39;axe hélicoïdal de la 10-mer s&#39;accumule pour produire une forme d&#39;arc de cercle (figure 3A). Etant donné que la période hélicoïdale est plus proche de 10,5 pb, une base supplémentaire est inséré après tous les deux répétitions de conserver la structure recourbée comme plane que possible. Ces séquences plus courtes de 200 pb peuvent être commandés auprès de companies qui offre gène service de synthèse. Il est commode pour flanquer ces séquences avec des séquences d&#39;adaptation communes pour les étapes ultérieures. Le mode opératoire est schématisé sur la figure 3B. </li><li> Effectuer PCR avec l&#39;amorce 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) et l&#39;amorce 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 2 est marqué avec le Cy3 donneur FRET à l&#39;extrémité 5 &#39;. Une recette typique de la PCR et le protocole de cyclage sont présentés dans les tableaux 1 et 2. </li><li> Faire la PCR Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) et l&#39;amorce 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 3 est marqué avec l&#39;accepteur Cy5 FRET à travers la colonne vertébrale et la biotine-segment de liaison à l&#39;extrémité 5 &#39;. Recette PCR et le protocole de cyclisme sont comme ci-dessus. </li><li> Purifier les produits de la PCR en utilisant un kit de nettoyage de PCR. </li><li> Mélanger le produit marqué au Cy3 et Cy5 le produit marqué dans un tampon pour l&#39;échange de brin (100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) à des concentrations finales de 0,4 et# 181; M et 0,1 uM, respectivement. NOTE: Le Cy3-ADN en excès augmente la concentration du duplex portant à la fois Cy3 et Cy5 en tant que résultat de l&#39;échange de brin. </li><li> brins de change par incubation à 98,5 ° C pendant 2 min, refroidissement progressif à 5 ° C avec un taux de 0,1 ° C / s de la rampe, et en incubant à 5 &#160; ° C pendant 2 heures. </li></ol> 2. Gel d&#39;électrophorèse pour détecter ADN double brin courbure <ol><li> Verser le gel de polyacrylamide en mélangeant 16,17 acrylamide et de solutions de bis-acrylamide à un rapport 29.2:0.8, 5% (p / v) dans 1 x Tris / Borate / EDTA (TBE) tampon à pH 8,0. Note: 10 ml de solution de gel contient: 1.217 ml 40% d&#39;acrylamide, 0,667 ml 2% de bis-acrylamide, 1 ml TBE 10X, 100 L persulfate d&#39;ammonium (APS) 10%, 10 L TEMED, et le reste est dH 2 O. Solidification complète du gel prend environ 30 min. </li><li> Charger le gel de polyacrylamide avec des échantillons d&#39;ADN et de l&#39;échelle d&#39;ADN dans un tampon de charge 1X (5% de glycerol, 0,03% (p / v) de bromophénol blue) et exécuter le gel à 5-8 V / cm à 4 ° C pendant 45 min ou jusqu&#39;à ce que le front de colorant se rapproche de l&#39;extrémité du gel. </li><li> Colorer le gel en utilisant un tampon TBE 1X contenant 0,5 g / ml de bromure d&#39;éthidium pendant 30 min. Identifier les bandes d&#39;ADN sous illumination UV. Comparer les positions des bandes avec le marqueur de taille (100 bp DNA ladder) pour calculer les tailles apparentes des molécules d&#39;ADN. NOTE: Curved ADN se déplacent généralement plus lent que les ADN droites. </li></ol> 3. Préparation de débit cellulaire <ol><li> Percer 6-7 paires de trous le long de deux bords opposés d&#39;une lame de verre (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) à l&#39;aide d&#39;une perceuse à colonne et des trépans de forage diamantés. Après le perçage, frotter la lame dans l&#39;eau qui coule pour enlever la poudre de verre visible. REMARQUE: Les trous servent entrées et sorties perfusion. Pendant le forage, la lame de refroidissement à l&#39;eau est importante pour empêcher la fissuration. </li><li> Placer les lames en position verticale dans un bocal de verre et de le remplir avec de l&#39;eau. Soniquer pendant 15 minutes et de les transférer dans un autre pot de verre dedicated pour le nettoyage à l&#39;acétone. Remplissez-le avec de l&#39;acétone et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Rincer les lames avec de l&#39;éthanol à l&#39;aide d&#39;un flacon pulvérisateur, puis avec de l&#39;eau. Placez-les dans un bocal en polypropylène, le remplir avec 5 M d&#39;hydroxyde de potassium, et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Enfin, soniquer les diapositives dans l&#39;eau pendant 15 min. Nettoyer les lamelles (n ° 1, 24 x 40 mm) en utilisant le même protocole. NOTE: diapositives et des lamelles nettoyés peuvent être stockés dans dH 2 O pour une utilisation à long terme. </li><li> Mélanger 1 mg de biotine-PEG-silane (MW 3400) avec 80 mg de la norme MPEG-silane (MW 2000) dans 340 L de 0,1 solution de bicarbonate de sodium M. Bien mélanger et centrifuger le mélange brièvement pour se débarrasser de bulles. REMARQUE: La fonctionnalisation de la surface avec du polyéthylène glycol (PEG) permet de réduire la liaison non spécifique de l&#39;ADN à la surface. </li><li> Mettre 80 L de la solution de PEG à chaque lame et une lamelle couvre-objet abaisser doucement dessus. Attendez 45 min. Séparer la lamelle de la diapositive avec des pincettes, les rincer abondamment avec de l&#39;dH 2 O et laisser tourlet sèche à l&#39;air libre. </li><li> Placez minces bandes de ruban adhésif double face sur la diapositive à former des canaux. Aligner une lamelle dessus et appuyez fermement sur la lamelle contre la glissière pour former des canaux étanches aux liquides. Utilisez cinq minutes époxy pour sceller les bords des canaux. </li></ol> 4. Préparation de Trolox Solution <ol><li> Mettez ~ 30 mg Trolox et 10 ml dH 2 O dans un ballon et utiliser une barre aimant d&#39;agitation pour agiter la solution à l&#39;air libre pendant 18 heures. </li><li> Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,2 um et ajuster le pH à 7 par addition de ~ 6 pi de 1 M de base Tris (pH 11). Remarque: le Trolox est un réactif anti-clignotement qui est couramment utilisé dans une seule molécule études 18. L&#39;action de antidécoloration de Trolox vient de son dérivé oxydé qui est présent dans la solution Trolox partiellement dégradé 19. À dissolution rapide Trolox dans le méthanol ou solution Tris pH élevé doit être évitée en raison de l&#39;oxydation inefficace. </li></ol> 5. Single-molImagerie ecule <ol><li> Injecter 15 ul de solution de neutravidine (0,5 mg / ml) dans le canal et attendre pendant 2 minutes avant de rincer avec 100 ul de tampon T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,0). </li><li> Injecter 50 ul d&#39;échantillon d&#39;ADN (50 à 100 pM) dans le canal. Attendez 5 minutes et rincer l&#39;ADN non lié à une distance de 100 L de tampon T50. NOTE: les molécules d&#39;ADN vont se lier spécifiquement à la surface à travers l&#39;interaction neutravidine-biotine. </li><li> Remplir les puits avec le tampon de formation d&#39;image qui contient un système de piégeage de l&#39;oxygène 20 (100 mM PCD, PCA 5 mM, 1 mM de Trolox, et NaCl 500 mM). </li><li> Réglez le EMCCD en mode de transfert de trame pour écouter 2 x 2 images regroupées par casiers (256 x 256) à l&#39;ordinateur à 25 images par seconde. </li><li> Mettre de l&#39;huile d&#39;immersion sur l&#39;objectif du microscope, et fixer la cellule d&#39;écoulement sur la platine du microscope en utilisant des clips spécimens. Gros la mise au point en regardant le motif de réflexion de laser sur le mur. Ajustez la mise au point avec l&#39;affichage en direct de la fluorescence imans sur le moniteur. </li><li> Commencer l&#39;acquisition de données avec le laser 532 nm sur. Vérifiez l&#39;affichage en direct et la mise au point si nécessaire. Arrêter l&#39;acquisition des données lorsque la plupart des molécules ont Photo-blanchissement. NOTE: Dans cette installation, un programme de laboratoire écrit C pour contrôler le microscope et afficher des images en direct sur l&#39;écran quand ils sont enregistrés sur le disque dur est utilisé. </li></ol> 6. Traitement de l&#39;image et l&#39;analyse des données REMARQUE: Une série de temps de 256 x 256 images sont traitées par un code MATLAB pour générer une seule molécule traces de temps de Cy3 et Cy5 intensités. Pour jumeler pixels entre le canal et le canal donneur accepteur de l&#39;image split-vue, 6-7 paires de Cy3 et Cy5 taches, chaque paire de la même molécule uniformément dispersés dans le champ de vision, sont récoltés manuellement, et une transformation affine est calculée en utilisant les coordonnées de ces points en tant que points d&#39;ancrage. <ol><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, regarder à travers tous les temps seule molécule traces tchapeau montrent de multiples transitions entre les signaux faibles et élevées de FRET. Identifier les États boucle et non bouclé. REMARQUE: Le signal de FRET est définie comme l&#39;intensité Cy5 (I a) divisé par la somme des intensités Cy3 et Cy5 (I a + I d). État boucle a une valeur élevée de FRET en état non bouclé a une valeur faible de FRET. L&#39;histogramme de signaux FRET partir d&#39;une seule molécule est bimodale distribué en raison du bouclage et débouclage réversible. </li><li> Trouver le seuil qui sépare les deux distributions en déterminant l&#39;intersection entre les deux courbes de Gauss de rangement. </li><li> Calculer l&#39;efficacité de FRET comme <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> et assigner les États en boucle avec des valeurs élevées de FRET et les Etats non tricotées avec de faibles valeurs de FRET. </li><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, analyser le nombre cumulatif de molécules (N (t)) qui en boucle (ouatteint l&#39;état haut FRET) à différents laps de temps depuis le début de l&#39;acquisition de données. NOTE: Depuis une molécule ADN double brin peut commencer à n&#39;importe quel conformation de l&#39;état non bouclé au début de l&#39;acquisition de données, le taux d&#39;accroissement de la population en boucle reflète le taux moyen boucle moyenne sur conformations initiales. Extraire la boucle de vitesse k boucle en ajustant N (t) avec une fonction exponentielle: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Si l&#39;augmentation biphasique, il peut être muni d&#39;une double fonction exponentielle: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> Dans ce cas, k boucle est obtenu à partir: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTE: En théorie, la probabilité de survie que d&#39;un polymère n&#39;a pas bouclé au temps t n&#39;est pas une fonction exponentielle simple ou double 12. FITT exponentielleING est utilisé comme un moyen pratique d&#39;extraire le temps de doublement moyen. </li></ol> 7. Détermination du facteur J NOTE: Le facteur J représente la façon concentrée une extrémité d&#39;un ADN double brin est de l&#39;ordre de l&#39;autre extrémité. Elle peut être déterminée par interpolation de la concentration d&#39;un segment d&#39;extrémité de l&#39;ADN qui produirait la même vitesse de réaction avec l&#39;autre segment d&#39;extrémité comme mesuré le taux de bouclage. Expérimentalement, un segment d&#39;extrémité est immobilisée sur la surface, et l&#39;autre segment d&#39;extrémité est introduit à une certaine concentration c. Si le taux de recuit mesurée entre les deux extrémités est recuit k, alors le facteur de J 21 est donnée par <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . La constante de vitesse de recuit (recuit k = k recuit / C) est indépendant de la concentration de la sonde. <ol><li> Débit 20 pi de 30-50 pM biotine-Cy5 oligo (Primer 3) into un canal neutravidine revêtu. Rincer le canal avec 100 pi de T50 à laver oligos non liés. </li><li> Préparer le tampon de formation d&#39;image tel que décrit dans la partie 5 avec l&#39;addition d&#39;oligo Cy3 (amorce 2) à une concentration finale de 50 nM. Couler ce tampon d&#39;imagerie dans le canal. </li><li> Tout en gardant le laser 532 nm, tournez brièvement le laser 640 nm à identifier les emplacements des oligos Cy5 liés à la surface. Éteignez le laser 640 nm et commencer à surveiller le signal de FRET. REMARQUE: Lors de l&#39;hybridation d&#39;un oligo Cy3 à un Cy5 oligo lié à la surface, Cy5 fluorescence se posera de FRET. </li><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, analyser le nombre de molécules qui commencent dans l&#39;état non lié (faible intensité de Cy5), mais se transforment plus tard en l&#39;état (haute intensité de Cy5) recuit en fonction du temps à partir des traces d&#39;intensité Cy5. </li><li> Tracer ce nombre de molécules en fonction du temps recuits. Monter cette courbe avec une fonction exponentielle simple ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Pour obtenir le taux de recuit (k recuit). </li><li> Répéter cette expérimentation à différentes concentrations Cy3 oligo (60, 100, et 180 nM) pour confirmer la linéarité entre le taux d&#39;hybridation et la concentration des réactifs. Extraire la constante de vitesse de recuit de second ordre (k recuit ) À partir de la pente. </li><li> Calculer le facteur de J de <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Où k est le taux boucle en boucle mesurée dans les mêmes conditions de tampon. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Un test simple molécule unique basé sur le FRET a été utilisé pour étudier la cinétique de bouclage des ADN de différentes formes intrinsèques. ADN courbes peuvent être préparés par la répétition d&#39;une séquence 10-mère en phase avec la période d&#39;hélice de 10,5 pb, et leurs courbures peuvent être estimées en utilisant PAGE. Ces dsDNAs sont conçus avec des extrémités cohésives pour permettre la stabilisation de la boucle transitoire. Nous avons extrait le taux de bouclage de l&#39;augmentat...

Comprendre les propriétés mécaniques des ADN double brin est d&#39;une importance fondamentale dans les sciences fondamentales et les applications d&#39;ingénierie. La structure de l&#39;ADN bicaténaire est plus compliqué que d&#39;une échelle hélicoïdale droite parce angles roulis, d&#39;inclinaison et de torsion entre les paires de base successives peuvent varier en fonction de la séquence. Fluctuations thermiques peuvent provoquer des ADN double brin à subir divers modes de fluctuations conformationnelles telles que la flexion, de torsion et d&#39;étirement. Transitions comme la fonte et de déformation peuvent également se produire dans des conditions extrêmes. Parmi ces propositions, ADNds flexion a l&#39;impact le plus notable biologique 1. ADNdb flexion est associée à la répression ou l&#39;activation de gènes en amenant deux sites distants proches les uns des autres. Il joue également un rôle important dans l&#39;emballage de l&#39;ADN à l&#39;intérieur du noyau de la cellule ou une capside virale. Déformation en flexion de l&#39;ADN bicaténaire peut être visualisée expérimentalement par microscopie à haute résolution (AFM 2 et 3 TEM), et la ThermodynAmics et cinétique peuvent être étudiés par des analyses en boucle, qui relient des sites chimiquement juxtaposés de l&#39;ADN double brin. Un tel dosage est une ligase dépendante cyclisation 4. Dans ce dosage, les molécules ADN double brin avec des extrémités collantes &quot;cohésives&quot; () sont circularisées ou dimérisés par l&#39;ADN ligase. En comparant les taux de cercle et la formation de dimère, on peut obtenir une concentration molaire efficace d&#39;une extrémité de l&#39;ADN dans le voisinage de l&#39;autre extrémité, qui est connu comme le facteur de J. Ce facteur de J est dimensionnellement équivalente à la densité de probabilité de trouver une extrémité de l&#39;ADN à une courte distance de l&#39;autre extrémité, et reflète ainsi la flexibilité de l&#39;ADN. Mesurer le facteur de J en fonction de la longueur de l&#39;ADN révèle de nombreuses caractéristiques de la mécanique d&#39;ADN dont la longueur de persistance 4,5. La chaîne de ver (WLC) modèle a été largement considéré comme le modèle de polymère canonique pour la mécanique ADN double brin sur la base de son succès dans explicationining les courbes force-extension obtenus dans l&#39;ADN tirant expériences 6 et prédire correctement les facteurs de J dsDNAs plus de 200 pb 7. Cependant, en utilisant l&#39;essai de cyclisation de molécules d&#39;ADNdb aussi courtes que 100 bp, et Cloutier Widom mesuré les facteurs J pour être de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que la prédiction du modèle WLC 8. Un an plus tard, Du et al. produite facteurs J en accord avec le modèle WLC en utilisant le test de cyclisation avec des concentrations plus faibles de ligase et attribué le résultat anormal dans le groupe Widom à des concentrations élevées ligase utilisé 9. Cette controverse illustre l&#39;influence inévitable de l&#39;ADN ligase sur la cinétique de cyclisation en utilisant le test classique 9. En outre, l&#39;ADN ligase peut également affecter la structure de l&#39;ADN et de la rigidité à travers non spécifique 10,11 liaison. Pour éliminer les problèmes techniques de tests de bouclage protéine dépendante, nous avons récemment démontré une prottest de bouclage ein, à base de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Dans ce procédé, des conformations en boucle sont détectées par FRET entre le donneur et l&#39;accepteur attaché à proximité des extrémités cohésives d&#39;une molécule d&#39;ADN. Un total de microscope de fluorescence par réflexion interne du type à objectif (TIRFM) est utilisé pour enregistrer des trajectoires en boucle réversible et débouclage événements à partir de molécules d&#39;ADN simple surface immobilisé pendant une période de temps prolongée. Cette méthode comporte l&#39;assemblage de molécules d&#39;ADN à base de PCR pour générer des molécules d&#39;ADN libre mésappariement, ce qui est une amélioration cruciale sur une méthode similaire par Vafabakhsh Ha et 13. L&#39;aspect unique molécule de ce protocole permet la mesure des distributions en plus de Ensemble moyennes tandis que l&#39;aspect FRET permet de mesurer la dynamique de l&#39;ADN de boucle à plusieurs reprises de la même molécule, même dans des conditions qui peuvent nuire à l&#39;activité de ligase. La configuration de TIRFM est illustré à la figure 1. Une coutumeStade-éprouvette conçu est placé sur un corps de microscope Olympus IX61. 532 nm et 640 nm lasers sont introduits à partir du côté et sont réfléchies par les miroirs elliptiques minuscules 14 dans l&#39;objectif d&#39;atteindre une grande NA angle d&#39;incidence critique à l&#39;interface lamelle couvre-objet dans l&#39;eau. Nous notons que plus répandue TIR par-objectif en utilisant des miroirs dichroïques ou configurations de TIR sur la base de prisme peut également être utilisé pour cette application de FRET. L&#39;image de fluorescence formée par le microscope est divisée en images de donneur et d&#39;accepteur par un miroir dichroïque. Ils sont ensuite convertis à la sur les deux moitiés d&#39;un EMCCD. Filtres d&#39;émission passe-longue supplémentaires sont utilisés pour réduire le signal de fond. Contrôle de la température est essentielle pour acquérir des données cinétiques reproductibles. Pour le contrôle de la température, l&#39;objectif est séparée de la pièce de nez du corps de microscope pour minimiser le transfert de chaleur, et de l&#39;eau à partir d&#39;une température contrôlée refroidisseur / réchauffeur est mis en circulation par l&#39;intermédiaire d&#39;un collier en laiton qui s&#39;adapte étroitement deautour du métal intérieur sous la veste objectif. Cette configuration est en mesure de réaliser robuste contrôle de la température à la surface de la lamelle couvre entre 15 et 50 ° C (Figure 2). Dans ce travail, la température de l&#39;échantillon a été maintenue à 24 ° C. Le protocole ci-dessous présente la procédure étape par étape pour la construction d&#39;ADN, de l&#39;estimation de la forme de l&#39;ADN, molécule expérience unique, et la détermination du facteur J.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40% solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vertical PAGE System</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;mu;m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>triplet state quencher</td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Premium plain glass microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature control</td></tr><tr><td>Objective Cooling Collar</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>temperature control</td></tr><tr><td>KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector</td><td>Coherent</td><td>1139604</td><td>Cy5 excitation</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &amp;amp; 543.5 nm lasers, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>combining dichroic</td></tr><tr><td>Brightline Fluorescence Filter 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 emission filter</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 emission filter</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diameter 45&amp;deg; Rod Lens Aluminum Coated&amp;nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miniature mirror</td></tr><tr><td>1/4&quot; Travel Single-Axis Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>translation of miniature mirror</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>focusing lens</td></tr><tr><td>Adjustable Mechanical Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Dielectric Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>relay lens</td></tr><tr><td>Lens Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Filter Mount</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Cage Cube Platform</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lens, &amp;Oslash;1&quot;, f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>collimating lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>telescope lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>telescope lens</td></tr></tbody></table>

studying dna looping by single-molecule fret

La flexion de l&#39;ADN double brin (ADNdb) est associée à de nombreux processus biologiques importants tels que la reconnaissance protéine-ADN et ADN emballage dans des nucléosomes. Thermodynamique de l&#39;ADN double brin de flexion a été étudiée par une méthode dite de cyclisation qui repose sur l&#39;ADN ligase pour joindre de manière covalente des extrémités cohésives courtes d&#39;un ADN double brin. Cependant, l&#39;efficacité de la ligature peut être affectée par de nombreux facteurs qui ne sont pas liés à ADN double brin boucle comme la structure de l&#39;ADN entourant les extrémités collantes jointes, et ligase peut également affecter le taux de boucle apparente à travers des mécanismes tels que la liaison non spécifique. Ici, nous montrons comment mesurer dsADN cinétique de boucle sans ligase en détectant transitoire formation de boucle d&#39;ADN par FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). les molécules d&#39;ADNdb sont construites en utilisant un protocole simple basé sur la PCR avec une paire de FRET et une séquence de liaison à la biotine. La densité de probabilité de boucle connue comme le facteur J est extrait à partir de la vitesse en boucle et le taux d&#39;hybridation entre deux déconnexionextrémités cohésives TED. En testant deux dsDNAs avec des courbures différentes intrinsèques, on montre que le facteur de J est sensible à la forme intrinsèque de l&#39;ADN double brin.

molécules d&#39;ADN utilisées pour l&#39;étude de bouclage sont constitués d&#39;une région duplex de longueur et séquence variable et des surplombs simple brin qui sont complémentaires les unes aux autres. Les saillies, qui sont à base de temps 7, peuvent s&#39;hybrider à l&#39;autre pour capter l&#39;état de boucle. Chaque surplomb contient soit Cy3 ou Cy5 qui est lié à l&#39;ossature de l&#39;ADN grâce à la chimie amidite. Le Cy5-faux est également lié à la biotine-TEG (15 atome Tetra-éthylène glyc...

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d&#39;ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.3K vues.  Georgia Institute of Technology.  Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d'ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J. 

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Recherche

Biochimie

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Une seule molécule Simple, robuste et haut débit débit étirement test mise en place pour étudier le Transport de molécules le long de l’ADN

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bio-ingénierie

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

Les deux règles d'ADN étudieront le mécanisme de la translocation de Ribosome avec la résolution d'un seul nucléotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

R-Loop Analysis by Dot-Blot

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the by-products of transcription; but recent findings of fewer R-loops in diseased cells made it clear that R-loops have functional roles in a variety of human cells. Next, it is critical to understand the roles of R-loops and how cells balance their abundance. A challenge in the field is the quantitation of R-loops since much of the work relies on the S9.6 monoclonal antibody whose specificity for RNA-DNA hybrids has been questioned. Here, we use dot-blots with the S9.6 antibody to quantify R-loops and show the sensitivity and specificity of this assay with RNase H, RNase T1, and RNase III that cleave RNA-DNA hybrids, single-stranded RNA, and double-stranded RNA, respectively. This method is highly reproducible, uses general laboratory equipment and reagents, and provides results within two days. This assay can be used in research and clinical settings to quantify R-loops and assess the effect of mutations in genes such as senataxin on R-loop abundance.

This protocol details a simple method that quantifies R-loop, a three-stranded nucleic acid structure that comprises of an RNA-DNA hybrid and a displaced DNA strand.

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the ...

Génétique

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Pinces optiques pour étudier les interactions ARN-protéine dans la régulation de la traduction

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstitution in situ de nucléosomes pour l’étude d’une molécule unique

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Reconstitution efficace des nucléosomes pour les techniques à molécule unique

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

Étude de l'ADN Looping par une seule molécule FRET

Résumé

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FRET de haute précision au niveau d'une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire