Isolamento de células contendo retinóides pulmonares por classificação de células

O protocolo descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar células contendo retinóides de populações de células pulmonares altamente heterogêneas, fazendo uso de autofluorescência retinóide específica e empregando classificação de células ativadas por fluorescência.

Os retinóides (vitamina A e seus metabólitos) são um componente lipídico essencial do microambiente alveolar, e o metabolismo retinóide específico do tipo de célula é necessário para manter a saúde funcional dos pulmões em desenvolvimento e adultos. As células pulmonares utilizam vias específicas, permitindo a captação eficiente de retinóides circulantes do sangue como retinol (ROH), seguida pela conversão intracelular gradual de ROH na espécie retinóide transcricionalmente ativa, ácido all-trans-retinóico (ATRA). A sinalização mediada por ATRA (ou mediada por retinóides) é crucial para regular a alveolarização pulmonar, a produção de surfactante, a angiogênese, a permeabilidade e a imunidade. É importante ressaltar que células pulmonares específicas, incluindo fibroblastos, podem acumular retinóides na forma de ésteres de retinil (RE), que podem ser armazenados ou mobilizados como ROH para transferência para as células vizinhas quando necessário. As células contendo retinóides pulmonares podem ser isoladas e coletadas da suspensão unicelular de pulmões digeridos fazendo uso de autofluorescência retinóide (a emissão a 455 nm após excitação a 350 nm) e empregando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). A marcação in vivo adicional específica de células pulmonares com proteína fluorescente vermelha permite isolar e coletar populações específicas de células pulmonares contendo retinóides. As células coletadas podem ser analisadas diretamente ou cultivadas para análises adicionais da morfologia celular, expressão gênica e capacidade de resposta a manipulações farmacológicas. Essa técnica de isolamento e aplicação é importante para estudos em modelos animais de saúde pulmonar e lesão pulmonar para obter uma visão mais profunda dos aspectos celulares do metabolismo retinóide nos pulmões e das comunicações celulares mediadas por lipídios.

Os retinóides (vitamina A e seus metabólitos) são um componente lipídico essencial do microambiente alveolar, e o metabolismo e a sinalização de retinóides específicos do tipo de célula são necessários para manter a saúde funcional do pulmão em desenvolvimento e adulto 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. As células pulmonares utilizam vias específicas, permitindo a captação eficiente de retinóides circulantes derivados da dieta do sangue como retinol (ROH)15,16,17,18,19, seguida pela conversão intracelular gradual de ROH na espécie retinóide transcricionalmente ativa, ácido all-trans-retinoic (ATRA)²⁰. A sinalização mediada por ATRA (ou mediada por retinóides) é obtida por meio da interação de ATRA com seus três receptores de hormônio nuclear cognatos distintos, receptores de ácido retinóico (RARα, RARβ e RARγ^21,22) e é crucial para regular a alveolarização pulmonar 23,24,25,26,27,28,29, produção de surfactante^30,31,32,33,34,35, angiogênese³⁶, permeabilidade³⁷ e imunidade 38,39,40. É importante ressaltar que células pulmonares específicas, especialmente fibroblastos pulmonares, podem acumular retinóides na forma de ésteres de retinil (ER), que podem ser armazenados ou mobilizados como ROH para transferência para as células vizinhas quando necessário¹.

A complexidade do metabolismo e da sinalização dos retinóides, bem como a complexidade celular do pulmão, tornam desafiadores os estudos destinados a explorar o metabolismo dos retinóides no pulmão in vivo . Delineamos um protocolo simples e robusto para isolar células contendo retinóides (Figura 1) de populações de células pulmonares altamente heterogêneas, fazendo uso de autofluorescência retinóide específica (a emissão a 455 nm após excitação a 350 nm) e empregando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). O protocolo não requer marcação celular adicional, exceto para coloração de viabilidade se o objetivo do estudo for isolar e caracterizar células pulmonares vivas primárias com base em sua capacidade de armazenar retinóides. Isso reduz significativamente o tempo de preparação para a classificação de células, elimina a necessidade de coloração adicional e permite isolar altos rendimentos de células primárias viáveis. No entanto, se o objetivo do estudo for isolar e caracterizar populações específicas de células pulmonares (fibroblastos, células endoteliais, epiteliais ou imunes), a classificação celular adicional pode ser realizada após a marcação das células contendo retinóides classificadas com anticorpos específicos da célula.

A autofluorescência retinóide tem sido usada em estudos publicados para estabelecer as identidades de células contendo retinóides e/ou quantificar a abundância dessas células no fígado 41,42,43,44, pâncreas ^45,46, rins^41,47 e pulmão⁴¹. Além disso, vários grupos de pesquisa relataram o uso de fluorescência retinóide para isolar por FACS e estudar células contendo retinóides primários de tecidos vivos, incluindo fígado 44,48,49,50,51,52,53 e pulmão 1. No protocolo atual, mostramos como populações de células específicas podem ser marcadas in vivo antes de isolar células contendo retinóides usando tdTomato (proteína fluorescente vermelha). As características espectrais do tdTomato (a emissão a 581 nm após a excitação a 554 nm⁵⁴) e o brilho não interferem na autofluorescência do retinóide e, portanto, tornam conveniente obter a especificidade da célula durante a classificação. Dado o papel crítico do metabolismo e sinalização retinóides não comprometidos dentro do microambiente alveolar normal¹, a técnica descrita de isolamento de células pulmonares é uma ferramenta útil em estudos em modelos animais de saúde e doença pulmonar para obter uma visão mais profunda dos aspectos celulares do metabolismo retinóide nos pulmões e comunicações celulares mediadas por lipídios in vivo.

Todos os procedimentos e experimentos descritos envolvendo camundongos foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Rutgers University (IACUC ID: PROTO202200111) de acordo com os critérios descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório elaborado pela Academia Nacional de Ciências⁵⁵.

1. Considerações e preparativos para o experimento

1. Criação e manipulação de animais
   NOTA: Camundongos machos e fêmeas de três meses (10-12 semanas de idade) podem ser usados nos estudos. Lecitina: camundongos deficientes em retinol aciltransferase (camundongos deficientes em Lrat, Lrat^{-/- 56}) em um fundo genético C57BL/6J e irmãos de ninhada pareados por idade (tipo selvagem, camundongos Lrat^+/+) foram usados nos experimentos descritos. Camundongos que expressam o gene tdTomato em fibroblastos (camundongos F-tdT) foram gerados pelo cruzamento de camundongos que abrigavam uma fita repórter tdTomato (B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sor^{tm14 (CAG-tdTomato) Hze} / J, Jackson Lab cepa # 007914) com camundongos Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, cepa #029567 do laboratório Jackson).
   1. Empregue o modelo de camundongo que expressa Cre, uma das muitas opções disponíveis para rotular a população de células-alvo in vivo.
      NOTA: Dependendo da escolha da célula-alvo, expressão de Cre, eficiência da recombinação mediada por Cre e especificidade celular, os investigadores podem utilizar qualquer modelo confiável de camundongo que expresse Cre.
   2. Use a expressão do transgene tdTomato (após o tratamento com tamoxifeno, conforme descrito abaixo) para marcar os fibroblastos Col1a2⁺ , seguido por seu isolamento de suspensões de células únicas do pulmão digerido, conforme descrito abaixo.
2. Recombinação mediada por Cre e ativação de transgenes in vivo
   1. Induzir a expressão de Cre em camundongos F-tdT por meio de injeção intraperitoneal (IP) de 2 mg de tamoxifeno uma vez a cada 24 h por um total de 5 dias consecutivos.
   2. Higienize o local da injeção com etanol a 70% antes da injeção. Use os camundongos para experimentos 1 mês após a injeção final de tamoxifeno.
   3. Verificar a eficácia da Cre-recombinação antes das experiências de triagem. Confirme a recombinação efetiva de Cre e a expressão de tdTomato isolando a população de células-alvo de fibroblastos pulmonares dos camundongos F-tdT tratados com tamoxifeno usando esferas magnéticas anti-Pdgfrα e classificação de células ativadas por magnetismo (MACS).
3. Preparação de soluções de plástico e vidro
   NOTA: Técnicas assépticas devem ser seguidas para os procedimentos descritos abaixo. Os procedimentos que envolvem preparações de solução, digestão de tecidos e isolamento celular devem ser feitos sob a capa laminar. As soluções devem ser esterilizadas por filtração usando um filtro de 0,2 μm; As ferramentas cirúrgicas, bem como o material de laboratório, devem ser esterilizados em autoclavagem.
   1. Sob a capa laminar, prepare a solução salina balanceada de Hanks (HBSS), livre de cálcio e magnésio (HBSS sem Ca²⁺/Mg²⁺, contendo 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glucose) para a perfusão pulmonar (5 mL por camundongo). Esterilize a solução usando um filtro de 0,2 μm e encha a seringa com a solução.
   2. Sob a coifa laminar, prepare a solução salina balanceada de Hanks com cálcio e magnésio (HBSS com Ca²⁺/Mg²⁺, contendo 1,3 mM CaCl₂, 0,5 MgCl_2·6H₂O, 0,4 mM MgSO_4·7H₂O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glucose), contendo 0,3 mg / mL de colagenase tipo IV e 1 mg / mL de dispase para a perfusão pulmonar (10 mL por camundongo). Esterilize a solução usando um filtro de 0,2 μm e encha a seringa com a solução.
   3. Sob a capa laminar, prepare HBSS com Ca²⁺/Mg²⁺, contendo 0,3 mg/mL de colagenase tipo IV, 1 mg/mL de dispase e 5 mg/mL de DNase I para digestão pulmonar (10 mL por camundongo). Esterilize a solução usando um filtro de 0,2 μm e encha a seringa com a solução.
   4. Sob a capa laminar, encher uma placa de cultura de células (35 mm 10 mm, uma placa por pulmão colhido de um ratinho) com 2 ml de HBSS estéril com Ca²⁺/Mg²⁺. Coloque o(s) prato(s) contendo HBSS com Ca²⁺/Mg²⁺ no gelo.

2. Perfusão pulmonar, digestão e coleta de suspensão unicelular

1. Anestesiar o camundongo administrando um coquetel de anestesia contendo 10 mg/mL de cetamina e 2 mg/mL de xilazina na dose de 0,01 mL/g de peso corporal por meio de injeção IP.
2. Certifique-se de que o mouse esteja em um estado profundo de inconsciência, avaliando a resposta ao beliscão do dedo do pé. Remova o cabelo solto e a sujeira/detritos visíveis do local da cirurgia, prenda e limpe o local da cirurgia com álcool 70% para desinfecção.
3. Usando ferramentas cirúrgicas estéreis, abra as cavidades abdominal e torácica. Corte as costelas e o diafragma para expor os pulmões e o coração.
   NOTA: Isso garantirá uma morte instantânea, pois a toracotomia causará uma cessação da respiração enquanto o camundongo estiver anestesiado; Se realizada corretamente, esta parte do procedimento levará até 3 minutos desde o início do procedimento até a toracotomia, seguida pela morte do animal.
4. Corte a veia cava inferior e aplique uma almofada absorvente para absorver o sangue liberado.
5. Perfunda os pulmões in situ através do ventrículo direito do coração usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 25 G X 1" preenchida com 5 mL de HBSS estéril sem Ca²⁺/Mg²⁺. Se a perfusão for bem-sucedida, o tecido pulmonar ficará branco.
6. Perfundir os pulmões in situ usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 25 G X 1" preenchida com 10 mL de HBSS estéril com Ca²⁺/Mg²⁺, contendo colagenase tipo IV (0,3 mg/mL) e dispase (1 mg/mL).
7. Remova os pulmões e transfira-os para uma placa de cultura de células (35 mm X 10 mm) com 2 mL de HBSS estéril com Ca²⁺/Mg²⁺.
8. Sob o capuz laminar, enxágue os pulmões e pique-os em pedaços pequenos usando uma lâmina cirúrgica estéril (# 20, se encaixa na alça # 4). Transfira o pulmão picado para um tubo de 15 mL adicionando os primeiros 5 mL de HBSS com Ca²⁺/Mg²⁺ contendo 0,3 mg/mL de colagenase tipo IV, 1 mg/mL de dispase e 5 mg/mL de DNase I ao tecido picado e transferindo-o usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Colete e transfira os resíduos de tecido picados restantes lavando a placa de cultura de células com os 5 mL restantes de HBSS com Ca²⁺/Mg²⁺ contendo 0,3 mg/mL de colagenase tipo IV, 1 mg/mL de dispase e 5 mg/mL de DNase I.
9. Incubar o tecido pulmonar picado em HBSS com Ca²⁺/Mg²⁺ contendo 0,3 mg/mL de colagenase tipo IV, 1 mg/mL de dispase e 5 mg/mL de DNase I em um agitador rotativo mantido a 37 °C por 45 min. Em cada um dos três intervalos de 15 minutos, sob a capa laminar, passe o tecido picado 10 vezes por uma pipeta sorológica de 10 mL para melhor dissociar as células.
10. Passe a suspensão celular resultante por um filtro de 100 μm para coletar células individuais em um tubo de 50 mL contendo 20 mL de solução de imagem de células vivas frias (solução salina fisiológica contendo 20 mM HEPES, pH 7,4) contendo menos de 5% de soro fetal bovino (FBS). Coletar as células por centrifugação a 500 g por 10 min a 4 °C.
11. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e deixe o tubo por 5 min em temperatura ambiente (RT) para eliminar os eritrócitos. Adicione 20 mL de solução de imagem de células vivas frias contendo menos de 5% de FBS. Coletar as células por centrifugação a 500 g por 10 min a 4 °C.
12. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 20 mL de solução fria de imagem de células vivas contendo menos de 5% de FBS. Passe a suspensão celular resultante por um filtro de 40 μm para coletar células individuais em um tubo de 50 mL contendo 20 mL de solução de imagem de células vivas frias contendo menos de 5% de FBS. Coletar as células por centrifugação a 500 g por 10 min a 4 °C.
13. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de solução de imagem de células vivas frias contendo menos de 5% de FBS. Conte as células e ajuste a concentração celular para ~ 5-10 x 10⁶ células / mL.

3. Isolamento de células pulmonares contendo retinóides usando Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS)

1. Pegue uma alíquota da suspensão celular e deixe-a de lado para ser usada como um controle de passagem não corado. Adicionar o corante de viabilidade SYTOX Green à suspensão celular restante (diluição 1:1000, concentração final de 30 nM).
2. Passe as suspensões celulares através do filtro conectado ao tubo coletor de poliestireno de 5 mL (12 x 75 mm).
3. Prossiga com o isolamento de células FACS classificando células vivas contendo retinóides individuais com base em sua emissão a 455 nm. Execute a discriminação singlete sequencialmente usando um gráfico para dispersão direta (altura de dispersão direta/FSC-H versus área de dispersão direta/FSC-A). Exclua as células mortas por características de dispersão (dispersão lateral) e coloração com SYTOX Green.
4. Portar, classificar e coletar células únicas, vivas e contendo retinóides usando emissão a 455 nm após excitação a 350 nm.
   NOTA: Usando o procedimento descrito, cerca de 5,10⁵ células pulmonares contendo retinóides podem ser coletadas de um pulmão de camundongo.
5. Realize a análise de dados FACS usando o software de citometria de fluxo.

Isolamento de células contendo retinóides pulmonares
Pulmões de camundongos (de camundongos Lrat^+/+ e Lrat^-/-) foram digeridos enzimaticamente e suspensões unicelulares foram preparadas e submetidas a FACS de acordo com o procedimento descrito acima. A classificação de células e a aquisição de dados foram realizadas em um sistema Cytek Aurora™ Cell Sorter operado pelo softwa...

A capacidade de detecção de vitamina A em tecidos humanos e animais e sua visualização histológica por microscopia fluorescente foi relatada pela primeira vez já na década de 1940^59,60. O fenômeno da autofluorescência retinóide foi então aplicado com sucesso em estudos que visavam localizar altas concentrações de vitamina A em tecidos in vitro⁶¹ e caracterizar a morfogênese de tecido...

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi financiado por uma doação do National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (para I.S.), um prêmio de desenvolvimento de carreira (para I.S) do Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease financiado pelo National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, e fundos iniciais da Rutgers, Universidade Estadual de Nova Jersey (para I.S.). Os autores gostariam de agradecer à equipe do Recurso Compartilhado de Monitoramento Imunológico e Citometria de Fluxo do Rutgers Cancer Institute (apoiado, em parte, com financiamento do NCI-CCSG P30CA072770-5920) por suas contribuições ao trabalho apresentado neste manuscrito.