Isolierung von Lungen-Retinoid-haltigen Zellen durch Zellsortierung

Das im Folgenden beschriebene Protokoll ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen aus hochgradig heterogenen Lungenzellpopulationen unter Verwendung spezifischer Retinoid-Autofluoreszenz und unter Anwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung.

Retinoide (Vitamin A und seine Metaboliten) sind ein essentieller Lipidbestandteil der alveolären Mikroumgebung, und ein zelltypspezifischer Retinoidstoffwechsel ist erforderlich, um die funktionelle Gesundheit der sich entwickelnden und erwachsenen Lunge zu erhalten. Lungenzellen nutzen spezifische Signalwege, die eine effiziente Aufnahme von zirkulierenden Retinoiden aus dem Blut als Retinol (ROH) ermöglichen, gefolgt von einer intrazellulären schrittweisen Umwandlung von ROH in die transkriptionell aktive Retinoidspezies, die all-trans-Retinsäure (ATRA). Die ATRA-vermittelte (oder Retinoid-vermittelte) Signalgebung ist entscheidend für die Regulierung der Lungenalveolarisierung, der Surfactant-Produktion, der Angiogenese, der Permeabilität und der Immunität. Wichtig ist, dass bestimmte Lungenzellen, einschließlich Fibroblasten, Retinoide in Form von Retinylestern (RE) akkumulieren können, die als ROH gelagert oder weiter mobilisiert werden können, um sie bei Bedarf auf die Nachbarzellen zu übertragen. Lungenretinoid-haltige Zellen können isoliert und aus der Einzelzellsuspension verdauter Lungen entnommen werden, indem Retinoid-Autofluoreszenz (die Emission bei 455 nm bei Anregung bei 350 nm) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet wird. Die zusätzliche zellspezifische in vivo Markierung von Lungenzellen mit rot fluoreszierendem Protein ermöglicht die Isolierung und Sammlung spezifischer Retinoid-haltiger Lungenzellpopulationen. Die gesammelten Zellen können direkt analysiert oder kultiviert werden, um weitere Analysen der Zellmorphologie, der Genexpression und der Reaktionsfähigkeit auf pharmakologische Manipulationen durchzuführen. Diese Technik der Isolierung und Anwendung ist wichtig für Tiermodellstudien zur Lungengesundheit und Lungenschädigung, um einen tieferen Einblick in die zellulären Aspekte des Retinoidstoffwechsels in der Lunge und der lipidvermittelten zellulären Kommunikation zu erhalten.

Retinoide (Vitamin A und seine Metaboliten) sind ein essentieller Lipidbestandteil der alveolären Mikroumgebung, und ein zelltypspezifischer Retinoidstoffwechsel und -signalweg sind erforderlich, um die funktionelle Gesundheit der sich entwickelnden und erwachsenen Lunge zu erhalten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. Lungenzellen nutzen spezifische Signalwege, die eine effiziente Aufnahme von zirkulierenden Retinoiden aus der Nahrung aus dem Blut als Retinol (ROH)15,16,17,18,19 ermöglichen, gefolgt von einer intrazellulären schrittweisen Umwandlung von ROH in die transkriptionell aktive Retinoidspezies, die all-trans-Retinsäure (ATRA)²⁰. Die ATRA-vermittelte (oder Retinoid-vermittelte) Signalübertragung wird durch die Interaktion von ATRA mit seinen drei unterschiedlichen verwandten nuklearen Hormonrezeptoren, den Retinsäurerezeptoren (RARα, RARβ und RARγ^21,22), erreicht und ist entscheidend für die Regulierung der Lungenalveolarisierung 23,24,25,26,27,28,29, der Tensidproduktion^30,31,32,33,34,35, Angiogenese³⁶, Permeabilität³⁷ und Immunität 38,39,40. Wichtig ist, dass bestimmte Lungenzellen, insbesondere Lungenfibroblasten, Retinoide in Form von Retinylestern (RE) akkumulieren können, die als ROH gelagert oder weiter mobilisiert werden können, um sie bei Bedarf auf die Nachbarzellen zu übertragen¹.

Die Komplexität des Retinoidstoffwechsels und der Signalübertragung sowie die zelluläre Komplexität der Lunge machen Studien zur Erforschung des Retinoidstoffwechsels in der Lunge in vivo zu einer Herausforderung. Wir haben ein einfaches und robustes Protokoll für die Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen (Abbildung 1) aus sehr heterogenen Lungenzellpopulationen unter Verwendung spezifischer Retinoid-Autofluoreszenz (die Emission bei 455 nm bei Anregung bei 350 nm) und durch den Einsatz von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) skizziert. Das Protokoll erfordert keine zusätzliche Zellmarkierung, mit Ausnahme der Viabilitätsfärbung, wenn das Ziel der Studie darin besteht, primäre lebende Lungenzellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, Retinoide zu speichern, zu isolieren und zu charakterisieren. Dies reduziert die Vorbereitungszeit für die Zellsortierung erheblich, macht zusätzliches Färben überflüssig und ermöglicht die Isolierung hoher Ausbeuten lebensfähiger Primärzellen. Besteht das Ziel der Studie jedoch darin, spezifische Lungenzellpopulationen (Fibroblasten, Endothel-, Epithel- oder Immunzellen) zu isolieren und zu charakterisieren, kann nach der Markierung der sortierten Retinoid-haltigen Zellen mit zellspezifischen Antikörpern eine zusätzliche Zellsortierung durchgeführt werden.

Die Retinoid-Autofluoreszenz wurde in veröffentlichten Studien verwendet, um die Identität von Retinoid-haltigen Zellen zu ermitteln und/oder die Häufigkeit dieser Zellen in der Leber 41,42,43,44, der Bauchspeicheldrüse^45,46, den Nieren ^41,47 und der Lunge zu quantifizieren⁴¹. Darüber hinaus berichteten mehrere Forschungsgruppen über die Verwendung von Retinoid-Fluoreszenz zur Isolierung durch FACS und zur Untersuchung primärer Retinoid-haltiger Zellen aus lebenden Geweben, einschließlich Leber 44,48,49,50,51,52,53 und Lunge 1. Im aktuellen Protokoll zeigen wir, wie spezifische Zellpopulationen in vivo markiert werden können, bevor Retinoid-haltige Zellen mit tdTomato (rot fluoreszierendes Protein) isoliert werden. Die spektralen Eigenschaften von tdTomato (die Emission bei 581 nm bei Anregung bei 554 nm⁵⁴) und die Helligkeit beeinträchtigen die Retinoid-Autofluoreszenz nicht und machen es daher bequem, die Zellspezifität während der Sortierung zu erreichen. Angesichts der entscheidenden Rolle des unbeeinträchtigten Retinoidstoffwechsels und der Signalübertragung innerhalb der normalen alveolären Mikroumgebung¹ ist die beschriebene Technik der Lungenzellisolierung ein nützliches Werkzeug in Tiermodellstudien zur Lungengesundheit und -erkrankung, um einen tieferen Einblick in die zellulären Aspekte des Retinoidstoffwechsels in der Lunge und der lipidvermittelten zellulären Kommunikation in vivo zu gewinnen.

Alle beschriebenen Verfahren und Versuche mit Mäusen wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Rutgers University (IACUC ID: PROTO202200111) gemäß den Kriterien des von der National Academy of Sciences erstellten Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren⁵⁵ durchgeführt.

1. Überlegungen und Vorbereitungen für den Versuch

1. Tierhaltung und Manipulationen
   HINWEIS: In den Studien können drei Monate alte (10-12 Wochen alte) männliche und weibliche Mäuse verwendet werden. In den beschriebenen Experimenten wurden Lecithin:Retinol-Acyltransferase-defiziente Mäuse (Lrat-defizient, Lrat^-/- Mäuse⁵⁶) auf einem C57BL/6J-genetischen Hintergrund und altersangepasste Wurfgeschwister (Wildtyp, Lrat^+/+ Mäuse) verwendet. Mäuse, die das tdTomato-Gen in Fibroblasten exprimieren (F-tdT-Mäuse), wurden durch Kreuzung von Mäusen erzeugt, die eine tdTomato-Reporterkassette beherbergten (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, Jackson Lab Stamm #007914) mit Col1a2-CreER-Mäusen (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, Jackson Lab Stamm #029567).
   1. Verwenden Sie das Cre-exprimierende Mausmodell, eine der vielen verfügbaren Optionen, um die Zielzellpopulation in vivo zu markieren.
      HINWEIS: Abhängig von der Wahl der Zielzelle, der Cre-Expression, der Effizienz der Cre-vermittelten Rekombination und der Zellspezifität können die Forscher jedes zuverlässige Cre-exprimierende Mausmodell verwenden.
   2. Verwenden Sie die Expression des tdTomato-Transgens (nach Tamoxifen-Behandlung wie unten beschrieben), um Col1a2⁺ -Fibroblasten zu markieren, gefolgt von ihrer Isolierung aus Einzelzellsuspensionen der verdauten Lunge, wie unten beschrieben.
2. Cre-vermittelte Rekombination und Transgenaktivierung in vivo
   1. Induzieren Sie die Cre-Expression bei F-tdT-Mäusen durch intraperitoneale (IP) Injektion von 2 mg Tamoxifen einmal alle 24 Stunden an insgesamt 5 aufeinanderfolgenden Tagen.
   2. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle vor der Injektion mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie die Mäuse 1 Monat nach der letzten Tamoxifen-Injektion für Experimente.
   3. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Cre-Rekombination vor den Sortierversuchen. Bestätigung der effektiven Cre-Rekombination und tdTomato-Expression durch Isolierung der Zielzellpopulation von Lungenfibroblasten aus den mit Tamoxifen behandelten F-tdT-Mäusen unter Verwendung von anti-Pdgfrα-Magnetbeads und magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MACS).
3. Aufbereitung von Lösungen, Kunststoff- und Glaswaren
   HINWEIS: Für die unten beschriebenen Verfahren sollten aseptische Techniken befolgt werden. Die Eingriffe, die Lösungsvorbereitungen, Gewebeverdauung und Zellisolierung umfassen, sollten unter der laminaren Haube durchgeführt werden. Die Lösungen sollten durch Filtration mit einem 0,2-μm-Filter sterilisiert werden; Sowohl chirurgische Instrumente als auch Laborgeräte sollten durch Autoklavieren sterilisiert werden.
   1. Bereiten Sie unter der laminaren Haube Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS), kalzium- und magnesiumfrei (HBSS ohne Ca²⁺/Mg²⁺, enthalten 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glucose) für die Lungenperfusion vor (5 mL pro Maus). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter und füllen Sie die Spritze mit der Lösung.
   2. Bereiten Sie unter der laminaren Haube die ausgewogene Salzlösung von Hanks mit Calcium- und Magnesium (HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺, enthält 1,3 mM CaCl₂, 0,5 MgCl_2·6H₂O, 0,4 mM MgSO_4·7H₂O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glucose), enthalten 0,3 mg/ml Typ-IV-Kollagenase und 1 mg/ml Dispase für die Lungenperfusion (10 mL pro Maus). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter und füllen Sie die Spritze mit der Lösung.
   3. Bereiten Sie unter der laminaren Haube HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺ vor, das 0,3 mg/ml Typ-IV-Kollagenase, 1 mg/ml Dispase und 5 mg/ml DNase I für die Lungenverdauung enthält (10 ml pro Maus). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter und füllen Sie die Spritze mit der Lösung.
   4. Füllen Sie unter der laminaren Haube eine Zellkulturschale (35 mm 10 mm, eine Schale pro entnommener Lunge von einer Maus) mit 2 mL sterilem HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺. Stellen Sie die Schale(n), die HBSS mit Ca²⁺/^{Mg 2+} enthalten, auf Eis.

2. Lungenperfusion, Verdauung und Entnahme von einzelliger Suspension

1. Betäuben Sie die Maus durch Verabreichung eines Anästhesiecocktails mit 10 mg/ml Ketamin und 2 mg/ml Xylazin in einer Dosis von 0,01 ml/g Körpergewicht per IP-Injektion.
2. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus in einem tiefen Zustand der Bewusstlosigkeit befindet, indem Sie eine Zehenkneifreaktion beurteilen. Entfernen Sie die losen Haare und sichtbaren Schmutz/Ablagerungen von der Operationsstelle, schneiden Sie sie ab und wischen Sie sie mit 70%igem Alkohol zur Desinfektion sauber.
3. Öffnen Sie mit sterilen chirurgischen Instrumenten die Bauch- und Brusthöhle. Schneide die Rippen und das Zwerchfell auf, um die Lunge und das Herz freizulegen.
   HINWEIS: Dies garantiert einen sofortigen Tod, da die Thorakotomie zu einem Atemstillstand führt, während die Maus betäubt wird. Bei ordnungsgemäßer Durchführung dauert dieser Teil des Eingriffs bis zu 3 Minuten vom Beginn des Eingriffs bis zur Thorakotomie, gefolgt vom Tod des Tieres.
4. Schneiden Sie die untere Hohlvene ab und tragen Sie ein saugfähiges Pad auf, um das freigesetzte Blut aufzunehmen.
5. Perfundieren Sie die Lunge in situ durch den rechten Ventrikel des Herzens mit einer 10-ml-Spritze mit einer 25 G x 1"-Nadel, die mit 5 mL sterilem HBSS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ gefüllt ist. Gelingt die Durchblutung, wird das Lungengewebe weiß.
6. Perfundieren Sie die Lunge in situ mit einer 10-ml-Spritze mit einer 25 G x 1" Nadel, die mit 10 mL sterilem HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺ gefüllt ist, das Typ-IV-Kollagenase (0,3 mg/ml) und Dispase (1 mg/ml) enthält.
7. Entnehmen Sie die Lunge und geben Sie sie in eine Zellkulturschale (35 mm x 10 mm) mit 2 mL sterilem HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺.
8. Spülen Sie die Lungen unter der laminaren Haube aus und zerkleinern Sie sie mit einer sterilen chirurgischen Klinge (#20, passt auf Griff #4). Übertragen Sie die gehackte Lunge in ein 15-ml-Röhrchen, indem Sie die ersten 5 ml HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺ mit 0,3 mg/ml Kollagenase Typ IV, 1 mg/ml Dispase und 5 mg/ml DNase I in das gehackte Gewebe geben und mit einer serologischen 10-ml-Pipette übertragen. Sammeln und übertragen Sie die restlichen gehackten Gewebereste, indem Sie die Zellkulturschale mit den restlichen 5 ml HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺ waschen, die 0,3 mg/ml Kollagenase Typ IV, 1 mg/ml Dispase und 5 mg/ml DNase I enthalten.
9. Inkubieren Sie das zerkleinerte Lungengewebe in HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺ , das 0,3 mg/ml Typ-IV-Kollagenase, 1 mg/ml Dispase und 5 mg/ml DNase I enthält, auf einem rotierenden Schüttler, der 45 Minuten lang bei 37 °C gehalten wird. In jedem der drei 15-Minuten-Intervalle wird das zerkleinerte Gewebe unter der laminaren Haube 10 Mal durch eine serologische 10-ml-Pipette geleitet, um die Zellen besser zu dissoziieren.
10. Die resultierende Zellsuspension wird durch ein 100-μm-Sieb geleitet, um einzelne Zellen in ein 50-ml-Röhrchen mit 20 ml kalter Lebendzell-Bildgebungslösung (physiologische Kochsalzlösung mit 20 mM HEPES, pH 7,4) zu sammeln, die weniger als 5 % fötales Rinderserum (FBS) enthält. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 g für 10 min bei 4 °C gesammelt.
11. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Lysingpuffer für rote Blutkörperchen und lassen Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) stehen, um die Erythrozyten zu eliminieren. Fügen Sie 20 ml kalte Lebendzell-Bildgebungslösung hinzu, die weniger als 5 % FBS enthält. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 g für 10 min bei 4 °C gesammelt.
12. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 ml kalter Lebendzell-Bildgebungslösung, die weniger als 5 % FBS enthält. Die resultierende Zellsuspension wird durch ein 40-μm-Sieb geleitet, um einzelne Zellen in ein 50-ml-Röhrchen zu füllen, das 20 ml kalte Lebendzell-Bildgebungslösung mit weniger als 5 % FBS enthält. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 g für 10 min bei 4 °C gesammelt.
13. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml kalter Lebendzell-Bildgebungslösung, die weniger als 5 % FBS enthält. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zellkonzentration auf ~5-10 x 10⁶ Zellen/ml ein.

3. Isolierung von Retinoid-haltigen Lungenzellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)

1. Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension und legen Sie es beiseite, um es als ungefärbte Gating-Kontrolle zu verwenden. Geben Sie den Viabilitätsfarbstoff SYTOX Green in die verbleibende Zellsuspension (1:1000 Verdünnung, Endkonzentration 30 nM).
2. Führen Sie die Zellsuspensionen durch den Filter, der an dem 5 mL (12 x 75 mm) Sammelrohr aus Polystyrol befestigt ist.
3. Fahren Sie mit der FACS-Zellisolierung fort, indem Sie lebende, einzelne Retinoid-haltige Zellen basierend auf ihrer Emission bei 455 nm sortieren. Führen Sie eine sequenzielle Singulett-Unterscheidung mit einem Diagramm für die Vorwärtsstreuung durch (Vorwärtsstreuhöhe/FSC-H versus Vorwärtsstreufläche/FSC-A). Schließen Sie tote Zellen durch Streucharakteristik (Seitenstreuung) und Färbung mit SYTOX Green aus.
4. Gate, sortieren und sammeln Sie einzelne, lebende, Retinoid-haltige Zellen durch Emission bei 455 nm nach Anregung bei 350 nm.
   HINWEIS: Mit dem beschriebenen Verfahren können etwa 5,10⁵ Retinoid-haltige Lungenzellen aus einer Mauslunge entnommen werden.
5. Führen Sie FACS-Datenanalysen mit Durchflusszytometrie-Software durch.

Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen der Lunge
Mauslungen (von Lrat^+/+ und Lrat^-/-) Mäusen wurden enzymatisch verdaut, und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt und gemäß dem oben beschriebenen Verfahren einer FACS unterzogen. Die Zellsortierung und Datenerfassung wurde auf einem Cytek Aurora™ Zellsortiersystem durchgeführt, das von der SpectroFlo CS-Software Version 1.3.0...

Die Fähigkeit des Vitamin-A-Nachweises in menschlichen und tierischen Geweben und dessen histologische Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde bereits in den 1940er Jahren erstmals berichtet^59,60. Das Phänomen der Retinoid-Autofluoreszenz wurde dann erfolgreich auf Studien angewendet, die darauf abzielten, hohe Konzentrationen von Vitamin A in Geweben in vitro zu lokalisieren ⁶¹ und ...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde finanziert durch ein Stipendium der National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (an I.S.), einen Karriereentwicklungspreis (an I.S.) des Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease, finanziert von den National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, und Start-up-Fonds von Rutgers, The State University of New Jersey (an I.S.). Die Autoren danken den Mitarbeitern der Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource am Rutgers Cancer Institute (teilweise unterstützt mit Mitteln des NCI-CCSG P30CA072770-5920) für ihre Beiträge zu der in diesem Manuskript vorgestellten Arbeit.